基质细胞衍化因子1与内皮祖细胞协同促血管新生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：动脉硬化性疾病的发病基础是内皮功能失调，循环中的内皮祖细胞数量和功能均下降，自身血管新生能力不足，单纯干细胞移植的疗效尚不确实，应用细胞因子以及基因修饰干细胞等方法是重要的研究方向。
目的：观察基质细胞衍化因子1对内皮祖细胞移植促血管新生的影响。
方法：制备20只单侧后肢缺血裸鼠模型，随机分为4组，分别给予静脉注射内皮祖细胞和肌肉注射基质细胞衍化因子1、静脉注射内皮祖细胞、局部肌肉注射基质细胞衍化因子1、肌肉注射培养液。造模后观察动物缺血后肢的皮温及存活情况，检测毛细血管/肌纤维比值、CD31和内皮型一氧化氮合酶表达情况。
结果与结论：荧光标记内皮祖细胞移植后整合至缺血后肢肌肉。20只裸鼠死亡2只。联合治疗组、内皮祖细胞组、基质细胞衍化因子1组和空白对照组患肢保存率分别为80%，75%，20%和0。毛细血管/肌纤维比值检测结果显示，联合治疗组和内皮祖细胞组高于空白对照组(P < 0.01)，联合治疗组高于内皮祖细胞组、内皮祖细胞组高于基质细胞衍化因子1组(P < 0.05)。血管密度检测结果显示，联合治疗组、内皮祖细胞组大于空白对照组(P < 0.01)，基质细胞衍化因子1组大于空白对照组(P < 0.05)，联合治疗组大于内皮祖细胞组、内皮祖细胞组大于基质细胞衍化因子1组(P < 0.05)。联合治疗组和内皮祖细胞组缺血肌肉内皮型一氧化氮合酶阳性率分别为73.33%和53.33%(P > 0.05)。提示内皮祖细胞可定向迁移至缺血组织，内皮祖细胞移植能促进治疗性血管新生，基质细胞衍化因子1可增强这一作用，内皮型一氧化氮合酶参与了内皮祖细胞促血管新生的过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 内皮细胞, 内皮祖细胞, 基质细胞衍化因子1, 血管新生, 细胞移植, 缺血

Abstract:

BACKGROUND: The endothelial dysfunction is the pathogenesis of arteriosclerotic disease, the quantity and function of endothelial progenitor cells are decreased within the cycle, leading to a poor capacity of neovascularizatio, the efficacy of stem cell transplantation alone is unclear, the combination of cytokines and gene-modified stem cells is the hotspot.
OBJECTIVE: To observe the effect of stromal cell-derived factor-1 on the neovascularization after endothelial progenitor cells transplantation.
METHODS: Unilateral hindlimb ischemia model was established in 20 athymic nude mice, and the mice were randomly divided into four groups: combined group (intravenous endothelial progenitor cells+intramuscular stromal cell-derived factor-1), endothelial progenitor cells group (intravenous injection of endothelial progenitor cells), stromal cell-derived factor-1 group (intramuscular injection of stromal cell-derived factor-1), and blank control group (intramuscular M199). The skin temperature of ischemic hindlimbs and survival of animals after transplantation were observed. The ratio of capillary/skeletal muscle fiber was counted. The expression of CD31 and endothelial nitric oxide synthase were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The fluorescence-labeled endothelial cells were embedded in ischemic hindlimb muscles after cell transplantation. Of the 20 nude mice, two mice died. The rate of ischemic hindlimb reserving was respectively 80%, 75%, 20% and 0 in combined group, endothelial progenitor cells group, stromal cell-derived factor-1 group, and blank control group. The capillary/muscle fiber ratio in combined group and endothelial progenitor cells group was higher than that of blank control group (P < 0.01). The combined group was greater than endothelial progenitor cells group, and endothelial progenitor cells group was greater than stromal cell-derived factor-1 group (P < 0.05). The capillary density in combined group and endothelial progenitor cells group were higher than that in blank control group (P < 0.01), and stromal cell-derived factor-1 group was also more than blank control group (P < 0.05). The combined group was greater than endothelial progenitor cells group, and endothelial progenitor cells group was greater than stromal cell-derived factor-1 group (P < 0.05). The positive rate of endothelial nitric oxide synthase was 73.33% and 53.33% in combined group and endothelial progenitor cells group respectively (P > 0.05). Endothelial progenitor cells can migrate to ischemic tissues, endothelial progenitor cells transplantation can promote neovascularization, and stromal cell-derived factor-1 augments the neovascularization after cell transplantation, in which endothelial nitric oxide synthase is involved.

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Key words: cell transplantation, cytokines, neovascularization, physiologic, nitric oxide synthase

中图分类号:

R318

吴元兵，王玉琦，符伟国，朱云峰，葛红卫. 基质细胞衍化因子1与内皮祖细胞协同促血管新生[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3158-3164.

Wu Yuan-bing, Wang Yu-qi, Fu Wei-guo, Zhu Yun-feng, Ge Hong-wei . Stromal cell-derived factor-1 and endothelial progenitor cells improve neovascularization[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3158-3164.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 4组共纳入20只裸鼠，死亡2只，原因为1只静脉注射内皮祖细胞时注液过多导致心衰死亡，另一只死亡原因不明。

共18只裸鼠进入结果分析，联合治疗组、内皮祖细胞组、基质细胞衍化因子1组及空白对照组分别为5，4，5，4只。

2.2 人内皮祖细胞的培养单个核细胞多数呈小圆细胞形态，经内皮条件下培养，48 h后出现贴壁，培养第3天可见部分贴壁细胞呈梭形或不规则形，以后贴壁细胞逐渐变大变圆，至第7天梭形细胞增多(图1A)。20 mL外周血可分离得到单个核细胞约5×10⁶个。

2.3 裸鼠缺血后肢演变情况 18只裸鼠缺血下肢演变情况见表1。

移植后3 d缺血的左后肢皮温较低，5 d后有3只鼠出现左后肢的趾端脱落，7只鼠出现缺血坏死，累及膝关节。坏死处未见明显感染迹象。标本经苏木精-伊红染色发现，有缺血坏死的后肢肌肉标本苏木精-伊红染色可见较多炎症细胞浸润(图1B)。

2.3 毛细血管/肌纤维比值的测定在骨骼肌中有生命力的毛细血管内皮细胞表达内源性碱性磷酸酶，当NBT/BCIP作为底物显色时，有生命力的内皮细胞即显示蓝紫色颗粒(图2A，B)。

方差分析显示联合治疗组、内皮祖细胞组、基质细胞衍化因子1组和空白对照组毛细血管/肌纤维比值差异有显著性意义。两两比较联合治疗组、内皮祖细胞组显著高于空白对照组(P < 0.01)，基质细胞衍化因子1与空白对照组差异无显著性意义。联合治疗组高于内皮祖细胞组、内皮祖细胞组高于基质细胞衍化因子1组(P < 0.05，表2)。

2.4 血管密度检测以CD31染色阳性表示血管密度。在细胞膜和细胞浆出现棕黄色颗粒为CD31阳性(图2C，D)。在200倍光镜下，每张切片随机计数5个视野内的棕黄色管状数，取其平均值。经检验，联合治疗组和内皮祖细胞组显著大于空白对照组(P < 0.01)，基质细胞衍化因子1组显著大于空白对照组(P < 0.05)，联合治疗组显著大于内皮祖细胞组、内皮祖细胞组显著大于基质细胞衍化因子1组(P < 0.05，表2)。

2.5 内皮型一氧化氮合酶检测内皮型一氧化氮合酶阳性表达在内皮细胞和/或内皮祖细胞的细胞浆(图2E)。结果判定标准：显微镜下(400×)计数，以阳性细胞数<10%为(-)，>10%为(+)。随机选取15个视野，结果联合治疗组阳性率73.33%，内皮祖细胞组阳性率为53.33%，2组经确切概率法检验，P=0.225。基质细胞衍化因子1组和空白对照组未见内皮型一氧化氮合酶阳性染色。

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引言

随着人们生活水平的提高，膳食结构的改善，动脉硬化性心血管疾病的发病率逐年增高。下肢动脉硬化闭塞症是最常见的动脉硬化性疾病，临床上可产生肢体发凉、麻木、苍白、疼痛等症状，导致患肢坏疽甚至危及生命。由于动脉硬化是全身性的疾病，下肢动脉硬化闭塞症患者多合并有冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑血管疾病、肾动脉狭窄、高血压、糖尿病等伴随疾病，这不仅加重了病情，也增加了治疗的难度。下肢缺血的治疗原则是应努力行血管重建，以恢复组织血运。但有些患者由于闭塞远端的动脉没有满意的流出道，常不能施行动脉转流、血栓内膜剥脱和腔内血管成形，而常用的扩血管药物难以使闭塞的血管复通。据TASCⅡ报道，在失去血管重建机会或血管重建失败的慢性严重缺血患者，应用药物治疗6个月内的截肢率为40%，病死率为20%^[1]。因此，临床迫切需要研究其发病机制并采取相应的措施来解决这一难题。

动脉硬化性疾病的发病基础是内皮功能失调，导致一系列细胞因子的分泌失常，最终导致血管张力增加、平滑肌细胞增生、粥样斑块形成、动脉硬化狭窄闭塞。某些病理因素如高血压、高脂血症、糖尿病等患者循环中的内皮祖细胞数量和功能均下降，且与心血管危险因素的严重程度呈负相关，外周血中的内皮祖细胞是更好的内皮损伤预测指标^[2]。

2002年首次报道临床采用干细胞移植治疗严重下肢缺血以来^[3]，以内皮祖细胞为靶细胞治疗缺血性疾病的再生医学研究越来越受到重视。内皮祖细胞移植能促进缺血组织的血管新生，改善缺血下肢以及心肌梗死的血供和内皮功能的恢复^[4-6]。但循环中的内皮祖细胞数量稀少，尚不能满足临床治疗的需要^[7]。根据动物实验计算所需内皮祖细胞的数量，在人体取得血管新生的效应约需12 L外周血才有治疗作用。

作者已成功从人外周血分离内皮祖细胞，并报道了基质细胞衍化因子1在体外对内皮祖细胞迁移功能的影响及其受体CXCR4的表达^[8]，因此，推测应用基质细胞衍化因子1能否将循环中的内皮祖细胞更多地募集至局部缺血部位，以促进治疗性血管新生效应。

文章将人内皮祖细胞移植于裸鼠，结合基质细胞衍化因子1的趋化作用，在动物体内观察内皮祖细胞与基质细胞衍化因子1是否具有协同促血管新生的作用，并初步探讨其作用机制，为临床进行干细胞移植治疗性血管新生奠定基础。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2006年5月至2007年1月在复旦大学中山医院血管外科研究所完成。

材料：

基质细胞衍化因子1对内皮祖细胞血管新生作用实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
超净台	上海汇龙环境工程公司
低温水平离心机	德国Eppendorf公司
倒置相差显微镜	日本Nikon公司
荧光显微镜及摄像系统	日本Olympus公司
切片机	德国Leica公司
电热恒温水浴箱	上海跃进医疗器械厂
胎牛血清、人重组血管内皮细胞生长因子、M199培养液	美国Invitrogen公司
碱性成纤维细胞生长因子	美国Cytolab公司
人纤维连接蛋白	美国R&D公司
CD31鼠抗人单抗	CD31鼠抗人单抗
羊抗鼠二抗(-HRP)、内皮型一氧化氮合酶兔抗人多抗	Santa Cruz公司
BCIP/NBT、DAB显色剂	Boster公司

实验动物：雄性裸鼠20只，8-10周龄，体质量18-22 g，购于中国医学科学院上海分院药物研究所。

实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

人外周血内皮祖细胞的培养：取健康志愿者外周抗凝血20 mL，等倍稀释，置于淋巴细胞分离液上方；去闸离心20 min。吸出单个核细胞层，清洗离心接种于纤连蛋白包被的24孔板。配制完全培养液：M199培养液中加入体积分数20%胎牛血清、血管内皮细胞生长因子 (20 μg/L)、碱性成纤维细胞生长因子(2 μg/L)；调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。

裸鼠单侧后肢缺血模型的建立：3%戊巴比妥按 0.75 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，取左大腿纵切口，从左腹股沟韧带至膝关节近端，长约3 cm。游离隐动静脉(股浅动静脉)，切断结扎腹壁浅动静脉。彻底切除一段股浅动静脉，长约2 cm。

内皮祖细胞移植：在建立裸鼠缺血模型的同时，按下述方案移植内皮祖细胞(n=5)：

联合治疗组：肌肉注射基质细胞衍化因子1α 1 μg +尾静脉内皮祖细胞1×10⁵。

内皮祖细胞组：尾静脉内皮祖细胞1×10⁵+肌注M199培养液100 μL。

基质细胞衍化因子1组：肌肉注射基质细胞衍化因子1α 1 μg。

空白对照组：肌肉注射M199培养液100 μL。

内皮祖细胞经锥虫蓝拒染试验检测活力达98%以上，计数并调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，每只鼠静脉给予细胞悬液约100 μL。

毛细血管/肌纤维比值测定：移植后10 d取标本，组织置于恒冷切片机上，与肌纤维走行垂直方向冰冻切片，厚约5 μm，冷丙醛固定10 min；0.01 mol/L TBS充分洗涤后，加入显色液氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(NBT/BCIP)，37 ℃湿盒环境下培养5 h。双蒸水洗涤，伊红衬染，乙醇梯度脱水，中性树胶封固。光镜下观察骨骼肌细胞呈红色，毛细血管呈蓝紫色颗粒。选择5个不同视野，200倍光镜下进行毛细血管计数。

CD31免疫组化检测毛细血管密度：移植后10 d取标本，石蜡包埋。与肌纤维走行垂直方向切片，厚约8 μm；切片梯度脱蜡，体积分数3% H₂O₂浸泡20 min；双蒸水洗4次，以0.1 mol/L柠檬酸浸泡置微波炉，98 ℃ 5 min进行抗原修复；自然冷却后用0.02 mol/L PBS清洗，5%BSA封闭，37 ℃ 30 min；PBS清洗，加1∶200 CD31鼠抗人单抗，4 ℃冰箱过夜。设PBS代替一抗作为阴性对照；PBS清洗，加入1∶200羊抗鼠二抗(-HRP)，室温下2 h；PBS清洗后，加DAB显色；待3-5 min后在显微镜下观察，出现棕黄色颗粒即用清水洗掉DAB，苏木精复染，烘干后二甲苯透明，树胶封固。在200倍光镜下，每张切片随机计数5个视野内的棕黄色管状数，取其平均值，表示毛细血管密度。

缺血组织标本内皮型一氧化氮合酶检测：移植10 d取标本，石蜡包埋。与肌纤维走行垂直方向切片，厚约8 μm；切片梯度脱蜡，体积分数3%H₂O₂浸泡20 min；双蒸水洗4次，以0.1 mol/L柠檬酸浸泡置微波炉，98 ℃ 5 min进行抗原修复；自然冷却后用0.02 mol/L PBS清洗，5%BSA封闭，37 ℃ 30 min；PBS清洗，加1∶200 内皮型一氧化氮合酶兔抗人多抗，4 ℃冰箱过夜。PBS代替一抗作为阴性对照。PBS清洗，加入1∶200羊抗兔二抗(-HRP)，室温下2 h；PBS清洗后，加DAB显色；待3-5 min后在显微镜下观察，细胞浆内出现棕黄色颗粒即用清水洗掉DAB，苏木精复染，烘干后二甲苯透明，树胶封固。内皮型一氧化氮合酶阳性表达在内皮细胞和/或内皮祖细胞的细胞浆，结果判定标准：显微镜下(×400)计数，以阳性细胞数<10%为(-)，>10%为(+)。

主要观察指标：观察动物缺血后肢的皮温及存活情况，检测毛细血管/肌纤维比值、CD31和内皮型一氧化氮合酶表达情况。

统计学分析：本实验数据结果以x(_)±s表示，由本文作者采用SPSS 11.5软件处理数据，组间比较采用One-Way ANOVA方差分析，两均数间比较采用t 检验；计数资料采用确切概率法检验。统计结果以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

机体对于缺血具有一定的代偿机制，包括建立侧支循环和局部缺血组织分泌刺激血管新生的生长因子，如血管内皮细胞生长因子、单核细胞趋化蛋白1、基质细胞衍化因子1等，生理性缺血增加冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的内皮祖细胞数量和血管内皮细胞生长因子浓度^[9]，但内源性侧支循环的代偿是有限的，极少能完全补偿因血管闭塞而造成的血供减少。年龄、高血压、高脂血症和糖尿病等因素导致内皮功能障碍，循环血中内皮祖细胞数量功能减弱对血管新生有抑制作用^[10-12]。

基质细胞衍化因子1及其受体CXCR4的相互作用在胚胎发育、造血生成、内皮祖细胞动员迁移以及内皮祖细胞在缺血区域的募集和血管新生等方面均有重要作用^[13-15]。基质细胞衍化因子1在体外可趋化内皮祖细胞定向迁移^[8,16]。人内皮祖细胞移植裸鼠后，作者用CD31染色检测血管密度以及毛细血管/肌纤维比值的结果发现，局部应用基质细胞衍化因子1可募集人内皮祖细胞至缺血局部，并显著增强缺血组织的血管新生作用。Zheng等^[17]报道基质细胞衍化因子1α通过细胞分子通路PI3K/AKT/内皮型一氧化氮合酶对内皮祖细胞凋亡有抑制作用。应用组织工程基质细胞衍化因子1α类似物ESA可促进内皮祖细胞趋化、血管新生和缺血心肌功能的改善^[18]。如阻断基质细胞衍化因子1可导致子宫内膜增生大鼠血管新生的减少及内膜增生病变的改善^[19]。

首次证实外周血存在内皮祖细胞的Asahara等^[20]发现，内皮祖细胞表达内皮型一氧化氮合成酶，在血管内皮细胞生长因子刺激下内皮祖细胞可产生一氧化氮。Hiasa等^[21]通过骨髓移植小鼠下肢缺血模型局部应用基质细胞衍化因子1α基因发现，基质细胞衍化因子1不仅促进内皮祖细胞的骨髓动员，且增强内皮型一氧化氮合酶的表达，并提出存在基质细胞衍化因子1/血管内皮细胞生长因子/内皮型一氧化氮合酶分子通路。他汀类降脂药不仅降低血脂，而且具有改善动脉硬化和缺血性疾病，其机制在于促进循环中内皮祖细胞的增加，内皮型一氧化氮合酶基因在其中发挥了关键的作用^[22]。移植表达内皮型一氧化氮合酶的内皮祖细胞可增强抑制内膜增生的作用^[23]，Chen等^[24]报道内皮型一氧化氮合酶转染的内皮祖细胞移植缺血心肌在减少梗死面积、提高左室功能等方面较单纯内皮祖细胞移植更有效。在本文中，基质细胞衍化因子1+内皮祖细胞组和内皮祖细胞组缺血组织标本中均检测到内皮型一氧化氮合酶，尽管两者相比较无明显差异，但内皮型一氧化氮合酶参与是内皮祖细胞移植血管新生的一个可能机制，值得进一步研究。

临床上，Tateishi-Yuyama等^[3]首次采用干细胞移植进行严重下肢缺血的促血管新生研究。他们应用骨髓单个核细胞和外周血单个核细胞进行治疗性血管新生研究，发现前者治疗效应优于后者，认为原因在于前者拥有CD34⁺的内皮祖细胞数量多以及合并输入的多种促血管新生因子。作者采用培养扩增后的内皮祖细胞进行移植主要有以下几点考虑：①外周血中内皮祖细胞数量稀少，单纯应用外周血单个核细胞移植细胞数量不够。②经分化扩增后内皮祖细胞促血管新生的效果可能更好。Kawamoto等^[25]应用内皮祖细胞和外周血单个核细胞移植对于动物心梗模型的血管新生作用作了比较，认为应用经分离的内皮祖细胞在改善血管新生和左室功能优于外周血单个核细胞。③安全性的考虑，超过99%外周血单个核细胞不属于内皮祖细胞范畴，而且有促使炎症反应加重的副作用，且在体内分化方向不明。

本次实验应用基质细胞衍化因子1可促进内皮祖细胞移植的血管新生作用，推测以下几种机制共同参与了这一过程：①机体缺血后自身存在代偿机制，可释放内源性的细胞因子，如血管内皮细胞生长因子、基质细胞衍化因子1等，来实现血管新生效应^[26]。但本实验采用裸鼠为实验对象，其自身的代偿及血管新生作用极弱。②人内皮祖细胞植入裸鼠体内后，经基质细胞衍化因子1趋化、募集至局部缺血部位，实现血管新生作用。③基质细胞衍化因子1自身的促血管新生能力。作为强力趋化剂，基质细胞衍化因子1可趋化循环血中少量的自身内皮细胞及祖细胞。应用基质细胞衍化因子1受体CXCR4拮抗剂AMD3100具有促进内皮祖细胞的动员和防治缺血再灌注损伤的作用，而这一作用与内皮型一氧化氮合酶基因有关^[27]。在本实验中，单纯应用基质细胞衍化因子1肌注的5只鼠中3只出现了下肢自截现象，1只有趾端脱落现象，仅1只完好，说明基质细胞衍化因子1在本实验中趋化人内皮祖细胞并通过人内皮祖细胞发挥血管新生的作用是主要的。

本文结果发现，应用内皮祖细胞移植可以显著增强血管新生的水平，基质细胞衍化因子1能加强内皮祖细胞移植促血管新生的效果，同时检测到内皮型一氧化氮合酶参与了内皮祖细胞促血管新生的过程。有作者报道骨髓间充质干细胞移植也参与缺血组织的血管新生过程^[28]，但干细胞移植血管新生研究很多方面尚未明确，筛选不同作用机制的各种基因和细胞因子是一大研究方向^[29-37]。需要进一步研究内皮祖细胞的生物学特性，筛选最佳的修饰基因及细胞因子，规范输入途径及剂量，严格的病例选择，开展多中心研究，制定规范化的治疗和评估方案，获得长期随访的随机对照资料，以指导临床实践。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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