设计:随机对照动物实验。
时间及地点:实验于2013年9月至2014年2月华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。
材料:
预防血管成形后再狭窄使用的主要试剂及仪器:
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试剂及仪器
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来源
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质粒提取纯化试剂盒
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Promega公司
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Lipofectamine 2000(脂质体)
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Invitrogen公司
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胆固醇
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武汉亚法生物技术有限公司
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多聚赖氨酸
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Sigma
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脂肪
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武汉中百超市
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大肠杆菌DH5α和携带绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1质粒(空载体)
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武汉晶赛生物技术有限公司
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球囊导管(HayateTM)
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Pro 公司
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荧光显微镜
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Nikon公司
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动物:健康雄性日本大耳白兔20只,兔龄3个月,体质量(2.22±0.18) kg,购于湖北省武汉市生物制品研究所,实验动物许可证号:No.0000274。实验动物的使用经华中科技大学同济医学院同济医院动物伦理委员会批准。实验动物饲养于同济医院实验动物中心。
方法:
携骨桥蛋白短发夹RNA质粒载体(OPN-shRNA1质粒)的构建:OPN-shRNA质粒由华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科实验室构建[10]。利用带有绿色荧光蛋白基因的质粒作为shRNA的表达载体,将设计好骨桥蛋白特异性shRNA与该载体成功连接。通过脂质体将OPN-shRNA质粒体导入血管平滑肌细胞后,通过可激发的绿色荧光可以直接在荧光显微镜下判断转染效率, 筛选较高比率的稳定转染细胞。通过G418稳定筛选后,发现骨桥蛋白基因mRNA和蛋白表达均下调。骨桥蛋白在血管平滑肌细胞的增殖、黏附、迁移中起重要作用,骨桥蛋白蛋白下调后可使血管平滑肌细胞的上述能力减弱并抑制细胞Ⅰ,Ⅲ型胶原分泌[11]。
实验性动脉粥样硬化模型兔的建立:参考文献[12]每天给予白兔高脂高胆固醇(5%脂肪,1%胆固醇饲料)。高脂高胆固醇饲料喂养前及喂养后4,8周在耳缘静脉取血送华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科,检测血清胆固醇和三酰甘油水平。高脂高胆固醇饲料喂养后4,8,12周血管内超声监测大血管病变。12周后血管内超声证实模型建立成功,以斑块负荷大于50%为模型建立成功标准,见图1。
基因球囊的制备:球囊导管球囊表面涂抹0.1%的多聚赖氨酸30 μL,反复吹干备用。分别将300 μg空载体+300 μL脂质体,300 μg OPN-shRNA质粒+300 μL脂质体混合后均匀涂于上述球囊导管的球囊表面,吹干待用。上述过程均在无菌条件下进行。
局部基因转染:随机将实验性动脉粥样硬化模型兔分为2组,每组各10只。OPN-shRNA质粒组兔,全身麻醉,行腹主动脉左肾动脉开口上段球囊扩张,将携带OPN-shRNA质粒的球囊导管上,插入腹主动脉左肾动脉开口上段,使球囊膨胀,压力在405 kPa,维持20 min, 降压退出。结扎动脉切口,缝合皮肤,精心饲养。空质粒组使用的是携带空载体的球囊导管。
超声观察:基因转染后1,2,4周,血管内超声观察兔左肾动脉开口处上端1 cm处的腹主动脉的管腔横截面积及斑块负荷。斑块负荷=外弹力膜横截面积-管腔横截面积/外弹力膜横截面积×100%。
荧光显微镜观察基因转染的效果:超声观察后,家兔麻醉处死,取扩张的腹主动脉血管,放入冷冻包埋剂中,低温成型后,冰冻切片机连续切片,片厚10 μm,荧光显微镜下观察并摄片,重复4次。
主要观察指标:球囊扩张血管段斑块负荷变化及OPN-shRNA质粒转染情况。
统计学分析:所有数据以x±s表示,采用SPSS 10.0统计软件(美国SPSS公司)分析。组间比较采用t 检验,以P < 0.05为有差异有显著性意义。