构建糖尿病膀胱病豚鼠模型及其尿动力学评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (7): 1063-1068.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.014

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构建糖尿病膀胱病豚鼠模型及其尿动力学评价

罗广承¹，何志华¹，罗建珍¹，徐益鸣¹，马红²

厦门大学附属中山医院(福建医科大学厦门中山教学医院)，¹泌尿外科，²内分泌科，福建省厦门市 361004

修回日期:2013-12-11 出版日期:2014-02-12 发布日期:2014-02-12
通讯作者: 马红，博士，主任医师，厦门大学附属中山医院内分泌科，福建省厦门市 361004
作者简介:罗广承，男，1969年生，山东省郯城县人，汉族，2006年解放军第三军医大学毕业，博士，主任医师，主要从事尿动力学及泌尿系统肿瘤研究。
基金资助:
2012年厦门市科技计划项目(3502Z20124015)：项目名称“豚鼠糖尿病性膀胱病ICC样间质细胞网络及其超微结构变化的研究”

Establishment of diabetic cystopathy guinea pig model and its urodynamic evaluation

Luo Guang-cheng¹, He Zhi-hua¹, Luo Jian-zhen¹, Xu Yi-ming¹, Ma Hong²

¹Department of Urology, Zhongshan Hospital of Xiamen University (Teaching Hospital of Fujian Medical University), Xiamen 361004, Fujian Province, China; ²Department of Endocrine, Zhongshan Hospital of Xiamen University (Teaching Hospital of Fujian Medical University), Xiamen 361004, Fujian Province, China

Revised:2013-12-11 Online:2014-02-12 Published:2014-02-12
Contact: Ma Hong, M.D., Chief physician, Department of Endocrine, Zhongshan Hospital of Xiamen University (Teaching Hospital of Fujian Medical University), Xiamen 361004, Fujian Province, China
About author:Luo Guang-cheng, M.D., Chief physician, Department of Urology, Zhongshan Hospital of Xiamen University (Teaching Hospital of Fujian Medical University), Xiamen 361004, Fujian Province, China
Supported by:
the grant by Xiamen Municipal Science and Technology Plan, No. 3502Z20124015

摘要/Abstract

摘要：

背景：糖尿病性膀胱病是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一，建立糖尿病膀胱病动物模型为相关研究提供实验动物平台。
目的：建立糖尿病膀胱病豚鼠模型并进行尿动力学评价。
方法：50只英国种短毛雌性豚鼠，实验组(n=42)以单次腹腔注射链脲佐菌素法诱导糖尿病豚鼠，对照组(n=8)注射相应剂量空白枸橼酸缓冲液，分别在9周和12周时行尿动力学检查，确定膀胱功能失代偿豚鼠即糖尿病性膀胱病组和代偿豚鼠即代偿组豚鼠尿动力学特点。
结果与结论：42只豚鼠有20只成功诱导出糖尿病。糖尿病豚鼠中，9周时9只糖尿病组豚鼠，6只膀胱功能代偿，3只失代偿；12周时，另外9只糖尿病组豚鼠，1只膀胱功能代偿，8只失代偿(89%)。糖尿病性膀胱病组豚鼠残余尿量增加(0.72±0.08) mL、最大逼尿肌压下降(0.63±0.05) kPa、膀胱容量增加(2.01±0.05) mL及膀胱顺应性增加(3.47±0.41) mL/kPa，与对照组及代偿组比较，差异均存在显著性意义(P < 0.001)。豚鼠一般可在诱导糖尿病成功后12周发生糖尿病性膀胱病，表现出膀胱残余尿量增加等相应的尿动力学改变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 组织工程, 豚鼠, 动物模型, 尿动力学, 糖尿病膀胱病

Abstract:

BACKGROUND: Diabetic cystopathy is one of the most common chronic diabetic complications. The establishment of animal models of diabetic cystopathy will provide experimental animal platform for relevant research.
OBJECTIVE: To establish a guinea pig model of diabetic cystopathy and to evaluate its urodynamic characteristics.
METHODS: Fifty short-hair Britain female guinea pigs were randomly divided into two groups, 42 as the experiment group and the other 8 as the control group. The experiment group was intraperitoneally injected with streptozotocin to induce diabetes. The control group received injection of blank citric acid buffered solution. Diabetic guinea pigs were detected by urinary dynamics test at 9 and 12 weeks. Diabetic guinea pigs were further assigned into diabetic cystopathy subgroup and compensated subgroup. The urodynamic parameters of three groups were compared.
RESULTS AND CONCLUSION: Twenty of 42 guinea pigs were successfully induced diabetes by the injection of streptozotocin. At 9 weeks after the injection, bladder function compensation was present in six diabetic guinea pigs while bladder function was decompensated in another three diabetic guinea pigs. At 12 weeks, bladder function compensation was present in one diabetic guinea pig, while another eight guinea pigs were confirmed with diabetic cystopathy (88.89%). In the diabetic cystopathy subgroup, the residual urine volume was increased (0.72±0.08) mL, maximal detrusor pressure was decreased (0.63±0.05) kPa, maximum bladder capacity was increased (2.01±0.05) mL, and bladder compliance was increased (0.34±0.04) mL/kPa. There were significant differences compared with the compensated subgroup and the control group (P < 0.001). Diabetic cystopathy occurs at 12 weeks after diabetic models are successfully established in guinea pigs, and urodynamic changes are mainly the increase of residual urine volume.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: diabetes mellitus, urinary bladder diseases, guinea pigs, models, animal, blood glucose, urination

中图分类号:

R318

罗广承，何志华，罗建珍，徐益鸣，马红. 构建糖尿病膀胱病豚鼠模型及其尿动力学评价[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(7): 1063-1068.

Luo Guang-cheng, He Zhi-hua, Luo Jian-zhen, Xu Yi-ming, Ma Hong . Establishment of diabetic cystopathy guinea pig model and its urodynamic evaluation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(7): 1063-1068.

图/表（结果） 2

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引言

糖尿病是严重危害人类健康的常见病和多发病，最新的调查显示中国成年人糖尿病患病率达9.7%^[1]。糖尿病性膀胱病是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一，早期主要表现为尿频、尿急，后期主要表现为排尿不尽、残余尿增多等膀胱功能失代偿征象^[2-3]。糖尿病患者因为膀胱功能障碍、排尿异常，往往导致其日常生活受限、苦恼难堪，生活质量下降^[4-6]。糖尿病性膀胱病发生的病理生理机制还不十分清楚，这导致临床上也没有很好的预防和治疗措施。相关研究正日益受到泌尿外科、内分泌科、神经内科医师等多学科研究者的关注。在糖尿病患者身上作相关基础与临床研究受到很多限制，且具有许多不可操作性。动物模型是研究疾病发生、机制、治疗、预后以及药物研发和药效评价的十分重要的工具。

目前，糖尿病动物模型的建立已较成熟，链脲佐菌素诱导动物糖尿病是国内外使用较多的一种制备糖尿病动物模型的方法^[7-9]，链脲佐菌素通过自由基损伤β细胞，使β细胞功能受损，胰岛素合成减少，引发糖尿病，方法简便，易于掌握，重复性好的特点。国外有学者报道选用雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠^[10-12]。1型糖尿病与2型糖尿病动物模型的制备与链脲佐菌素注射的剂量有关系：大剂量注射时，由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可造成1型糖尿病模型；而注射较少量链脲佐菌素时，由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类2型糖尿病的动物模型。

糖尿病模型有以犬、猪为代表的大型动物模型和以鼠为代表的小型动物模型。糖尿病动物随着病情的进展，将发生膀胱功能障碍，但每种动物、甚至每个动物个体的发病时间是不同的。由于糖尿病膀胱病的发生需要相当长的时间，而小动物由于生命周期短，产生糖尿病性膀胱病并发症的时间相应较短，所以，小型动物是制作糖尿病性膀胱病模型的理想动物。糖尿病膀胱病作为糖尿病的常见并发症，其基础与临床研究正在成为新的热点，包括其发病机制、临床治疗等^[13-14]。糖尿病性膀胱病是糖尿病外周神经在下尿路的表现，患者因长期高血糖可导致周围自主神经节段性脱髓鞘和轴突破坏，神经传导障碍引起膀胱感觉功能减退。一般认为，膀胱感觉神经功能损害较早发生。糖尿病性膀胱病临床分3种类型^[15-17]：①膀胱逼尿肌无力引起尿潴留，表现为下腹膨胀、有尿排不出，膀胱残余尿量可达数百毫升，很像是前列腺肥大引起的排尿困难。②膀胱括约肌失控引起尿失禁，表现为尿急、尿频、小便淋漓不尽，很像前列腺增生的早期症状或老年性尿失禁。③膀胱逼尿肌与括约肌不协调引起的排尿障碍，主要表现为排尿时间延长，排尿中断。糖尿病膀胱病的发展有代偿性期和失代偿而期两个阶段，这两个阶段的表现不同，病理基础也迥异。膀胱病变早期表现多不明显，膀胱失代偿期是糖尿病膀胱病的典型阶段。可靠的糖尿病膀胱病动物模型需要确定的分期，区分膀胱功能代偿与失代偿对建立模型建立具有重要意义。

实验应用豚鼠建立糖尿病性膀胱病模型，并对其进行尿动力学检查评价，以区分动物膀胱功能代偿期与失代偿期。建立糖尿病性膀胱病失代偿期动物模型可为糖尿病性膀胱病相关研究提供可靠的实验动物平台，促进糖尿病性膀胱功能障碍的诊治。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年5月至2013年10月在厦门大学附属中山医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：普通级50只英国种短毛雌性豚鼠，体质量170-230 g，实验豚鼠购自上海市松联实验动物场，许可证号码：SCXK(沪)2007-0011。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

主要仪器、试剂：链尿佐菌素购自Sigma公司；Laborie尿动力仪购自加拿大Laborie公司。

方法：

诱导糖尿病豚鼠模型：将50只豚鼠全价饲料适应性喂养1周，其后随机摸球法分成对照组8只，实验组42只，两组豚鼠体质量、血糖差异均无显著性意义。链尿佐菌素溶于新鲜配制的pH 4.4、浓度0.1 mol/L 枸橼酸缓冲液中。实验组豚鼠按链脲佐菌素200 mg/kg单次腹腔注射，对照组注射相应剂量空白枸橼酸缓冲液。3 d后，剪耳法测定豚鼠血糖，每周1次，连续4周。随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病诱导成功，为糖尿病组研究对象；血糖16.7 mmol/L为诱导失败，在实验中摒弃。42只实验组豚鼠喂养过程死亡3只，诱导失败19只，共20只诱导成功的糖尿病豚鼠进入下一步实验。

豚鼠尿动力学评价及糖尿病性膀胱病豚鼠确定：20只糖尿病豚鼠，喂养过程中死亡2只，9周时随机检查9只糖尿病豚鼠和4只对照组豚鼠，12周时检查另外9只糖尿病豚鼠和4只对照组豚鼠。豚鼠以水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定，碘伏消毒下腹部，耻骨上作小切口显露膀胱。两个4号留置针分开穿刺膀胱顶部，其中一个与微量泵相连，用生理盐水以0.25 mL/min的速度膀胱灌注，另一个与尿动力仪(Laborie公司)压力感受器相连，进行膀胱压力(储尿期及排尿期)及膀胱残余尿测定。连续记录3个排尿周期。失代偿期糖尿病性膀胱病诊断标准：豚鼠膀胱排空障碍(残余尿>10%膀胱容量)。

主要观察指标：①随机血糖。②膀胱残余尿。③最大逼尿肌压力。④最大膀胱容量。⑤膀胱顺应性。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0统计分析软件，比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

实验先以链脲佐菌素诱导豚鼠糖尿病，不干预糖尿病豚鼠，在12周后成功建立糖尿病膀胱病模型。通过尿动力学检查发现12周后有88.89%的糖尿病豚鼠发生失代偿期糖尿病性膀胱病，确定了膀胱失代偿期发生的时间窗口，建立了较为可靠的失代偿期糖尿病膀胱病豚鼠动物模型。

关于豚鼠糖尿病的血糖标准有两个，一是空腹血糖≥11.1 mmol/L，二是随机血糖≥16.7 mmol/L。本实验中尽量避免测空腹血糖，因为空腹会造成一些血糖太高的实验动物体内酮体增多而增加死亡率^[18]。另外，在尿动力学检查过程中要掌握麻醉药物的剂量，避免麻醉过深而影响膀胱逼尿肌收缩力。糖尿病模型成功率47.6% (20/42)，死亡率7.14%(3/42)，与Joseph等^[19]接近。实际上，没有降糖药物的干预，随着实验的继续，糖尿病豚鼠仍有一定的死亡率，本组20只糖尿病豚鼠，2只死亡(10%)。对实验动物来讲，糖尿病膀胱病的典型表现中，以残余尿最为直观。膀胱残余尿也没有一个明确的诊断标准，本实验借鉴Hagstroem等^[20]的标准，将膀胱残余尿定义为>10%膀胱容量。当然，糖尿病性膀胱病的尿动力学表现还有膀胱感觉过度敏感、逼尿肌收缩力下降、膀胱容量增加、甚至尿失禁等表现，但残余尿的出现标志着膀胱功能失代偿，是糖尿病性膀胱病膀胱功能失代偿的确定指标^[21]。

在临床上，一般在八九年后超过半数的糖尿病患者会出现膀胱病变^[22]。糖尿病膀胱损害分为两个阶段，早期是膀胱代偿性肥厚，表现为尿频等储尿期问题；后期膀胱功能失代偿而出现排空障碍^[23]。曹石金等^[24]采用8周龄雄性SD大鼠腹腔内注射1%链脲佐菌素建立糖尿病大鼠的动物模型，与正常大鼠进行对照观察，建模8周后取膀胱组织标本，病理切片观察膀胱逼尿肌病理组织学变化，与正常对照组比较，糖尿病组大鼠血糖明显升高，体质量明显减轻，24 h尿量和膀胱湿重显著增加；充盈性膀胱测压检查结果显示糖尿病大鼠膀胱容量、单次排尿量和剩余尿量明显增加，收缩力代偿性升高，排尿效率显著降低；常规苏木精-伊红染色光镜下观察可见糖尿病组大鼠组膀胱逼尿肌肌束排列紊乱，结构松散，肌束断裂。可见糖尿病组大鼠早期即可出现膀胱逼尿肌形态学和功能的改变。冯建华等^[25]建立了链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型，观察2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌超微改变，从细胞形态学分析糖尿病膀胱功能障碍发病机制，结果发现电镜下逼尿肌表现为逼尿肌细胞体积增大，血管平滑肌细胞之间的间隙缩小，细胞间胶原纤维增多，细胞间中间连接减少，胞突连接及缝隙连接多见。12周时上述改变较4周明显加重。与时间有明显相关性，此损害过程为一个神经纤维束减少、膀胱逼尿肌代偿与重建，最后导致膀胱功能障碍的过程。故认为在糖尿病早期，大鼠膀胱逼尿肌的平滑肌、细胞间质和神经纤维均有改变，随着时间的延长变明显。根据Daneshgari等^[26]研究提示，以9周和12周两个时间点测量糖尿病大鼠膀胱逼尿肌条，结果提示随着时间的延长，膀胱损害渐趋明显，逼尿肌收缩力下降，证实糖尿病大鼠9-12周发生膀胱功能代偿向失代偿转变。糖尿病动物模型的建立已经比较成熟，有以犬、猪为代表的大型动物模型和以鼠为代表的小型动物模型。但是，由于糖尿病膀胱病的发生需要相当长的时间，不同动物出现糖尿病性膀胱病的时间也迥然有异。小动物由于生命周期短，产生糖尿病性膀胱病并发症的时间相应变短，用小型动物制作糖尿病性膀胱病模型更为经济。作者注意到国内的一项动物模型实验将糖尿病豚鼠发生糖尿病膀胱病的时间定为10 周^[27]。但如能对膀胱功能的代偿期和失代偿期的区分则更加完善。实验继续对豚鼠膀胱功能代偿和失代偿的不同阶段进一步分组与比较，确定了糖尿病豚鼠12周后出现膀胱功能失代偿。最近，也有人尝试用小型化的大型动物，如微型猪来制作糖尿病模型^[28]。这类动物究竟多长时间发生膀胱功能障碍，特别是失代偿期膀胱病的发生时间有待进一步确定。

目前认为尿动力学检查是临床诊断糖尿病性膀胱病的重要依据^[16^，^29]，尿动力学主要表现为膀胱感觉减退，逼尿肌收缩力下降等，最终出现膀胱残余尿增多。毕铮铮等^[30]研究早期糖尿病性膀胱病的无创尿动力学指标变化，分别应用无创尿动力学方法进行最大尿流率、平均尿流率、初尿意膀胱容量及残尿量测定。结果认为糖尿病早期便可出现尿动力学改变，其中可能以最大尿流率降低为最敏感指标。应用无创尿动力学检测方法可早期诊断糖尿病性膀胱病并动态观察评价膀胱功能。本实验尿动力学结果表明发现，9周时大部分糖尿病豚鼠膀胱功能尚可代偿(6/9)，残余尿、最大逼尿肌压力及膀胱容量均未出现明显变化。国内最新的一篇研究也发现^[31]：糖尿病大鼠8周时M3受体的生物合成水平增加，同时膀胱的收缩功能增强，这提示在糖尿病早期膀胱功能的代偿作用，这一结论与实验的尿动力学结果相互印证。12周后，糖尿病豚鼠膀胱功能进一步损害，9只中的8只出现膀胱功能失代偿，残余尿量增多、最大逼尿肌压力明显降低、最大膀胱容量升高、膀胱顺应性增高。对实验动物来讲，准确的尿动力学检查需要麻醉、甚至解剖，几乎是致死性的。用膀胱残余尿量测定替代膀胱压力测定，对维持动物模型的存活及后续实验研究具有重要意义^[32-33]。

关于糖尿病膀胱病的病理生理机制是多方面的，逼尿肌改变、神经损害以及尿路上皮损害是其中主要的因素^[34-35]。逼尿肌病理改变可能是因为细胞间的连接和兴奋性改变、受体密度和分布变化、细胞内信号传导变更以及基因改变等^[36-39]。高血糖可能通过多元醇代谢途径，导致糖化终末代谢产物及自由基产物增多、蛋白激酶活性增加。这些代谢异常导致神经轴索变性和神经传导障碍^[40-41]。膀胱内神经生长因子合成减少，以及向腰骶部神经元转运神经生长因子障碍与膀胱病变的发生有关^[42]。郭学敬等^[43]探索了糖尿病大鼠治疗前后逼尿肌和腰骶背根神经节中神经生长因子的表达及意义，将SD大鼠分为糖尿病组、单用神经生长因子组、单用胰岛素组和联合应用神经生长因子和胰岛素组进行观察，结果显示对照组血糖明显低于糖尿病组，糖尿病大鼠经神经生长因子和胰岛素治疗后膀胱和腰骶背根神经节中神经生长因子的含量较非治疗组明显增加，说明了神经生长因子在糖尿病大鼠膀胱病变的发病过程中具有重要作用，给予外源性神经生长因子可能有助于糖尿病大鼠膀胱病变病变减轻和功能改善。膀胱尿路上皮具有感觉功能，并释放多种介质而影响传人神经。在糖尿病动物，膀胱功能异常与尿路上皮内源性前列腺素释放障碍有关^[44-45]。李云飞等^[45]检测了豚鼠糖尿病性膀胱病(DCP)逼尿肌中酪氨酸蛋白激酶生长因子受体mRNA和蛋白的表达水平，探讨c-kit表达与鼠糖尿病性膀胱病的关系及其发病机制，结果显示糖尿病性膀胱病组c-kitmRNA表达、c-kit蛋白表达显著低于对照组及糖尿病性非膀胱病组。说明豚鼠糖尿病性膀胱病逼尿肌中c-kitmRNA、c-kit蛋白表达减少，导致c-kit信号通路异常，从而使Cajal样细胞在膀胱中的功能减弱而导致逼尿肌功能障碍发生糖尿病性膀胱病，因此c-kit表达异常可能是糖尿病性膀胱病的发病机制之一。总之，糖尿病继发的神经损害、逼尿肌及其受体损害以及膀胱上皮功能异常，都参与了糖尿病膀胱病的病理生理过程。糖尿病膀胱病的发病机制多样，机制复杂且存在很多不确定的未知因素^[47-50]。这种复杂的病理机制为相关研究提出了挑战，也为科学工作者提供了广阔的研究空间，建立糖尿病膀胱病动物模型具有重要的价值。

需要指出的是本实验建立的糖尿病膀胱病豚鼠模型为膀胱功能失代偿模型。正如前面文献所述^[21^，^23]，糖尿病膀胱病分为两个时期，早期为膀胱代偿期，膀胱代偿性肥厚；晚期为膀胱失代偿，残余尿出现。膀胱代偿期，常见的症状是尿频、尿急，在动物则较难判断^[51]。所以，代偿期糖尿病膀胱病模型难以确定，这个时期所需要的时间，在鼠类约为9周。12周后，膀胱残余尿的存在标志着膀胱排空障碍、失代偿期糖尿病性膀胱病的发生。实验建立豚鼠失代偿期的糖尿病性膀胱病动物模型，可为研究糖尿病性膀胱病等糖尿病慢性并发症提供可靠的实验动物平台。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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构建糖尿病膀胱病豚鼠模型及其尿动力学评价

Establishment of diabetic cystopathy guinea pig model and its urodynamic evaluation

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