电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.012

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (2): 231-238.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.012

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电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化

曾建军^{1, 2}，贺旭¹，严小新¹，罗学港¹，潘爱华¹

1中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系，湖南省长沙市 410013；2湖南怀化医学高等专科学校人体解剖学教研室，湖南省怀化市 418000

收稿日期:2013-11-08 出版日期:2014-01-08 发布日期:2014-01-08
通讯作者: 潘爱华，博士，教授，中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系，湖南省长沙市 410013
作者简介:曾建军，男，1977年生，湖南省怀化市人，汉族，中南大学湘雅医学院毕业，讲师，主要从事神经发育方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81171060)

Unilateral olfactory functional deprivation model in the left peripheral nostrils by electric cautery injury: olfactory bulb neurogenesis and transformation

Zeng Jian-jun^{1, 2}, He Xu¹, Yan Xiao-xin¹, Luo Xue-gang¹, Pan Ai-hua¹

1Department of Anatomy and Neurobiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China; 2Department of Human Anatomy, Huaihua Medical College, Huaihua 418000, Hunan Province, China

Received:2013-11-08 Online:2014-01-08 Published:2014-01-08
Contact: Pan Ai-hua, M.D., Professor, Department of Anatomy and Neurobiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China
About author:Zeng Jian-jun, Lecturer, Department of Anatomy and Neurobiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China; Department of Human Anatomy, Huaihua Medical College, Huaihua 418000, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171060

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来嗅球的神经发生、转化以及成熟已成为研究热点，并且嗅觉经验和神经活动能影响嗅球神经发生，但是到目前为止关于嗅觉功能活动是否影响豚鼠嗅球的神经发生尚无报道。
目的：观察单侧嗅觉功能剥夺对幼年豚鼠两侧嗅球微管聚合蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白和小白蛋白表达的影响。
方法：将24只幼年豚鼠随机分成2组，通过电烙铁损伤左侧外周鼻孔区建立嗅觉功能剥夺模型，分别于建立嗅觉功能剥夺模型后3，6周灌注取材，应用免疫组织化学技术观察不同时间点豚鼠自身两侧嗅球微管聚合蛋白、小白蛋白和维生素D依赖性钙结合蛋白的表达情况。
结果与结论：造模后3周组豚鼠嗅觉未剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白、小白蛋白和维生素D依赖性钙结合蛋白数目明显高于嗅觉剥夺侧(P < 0.05)；造模后6周组豚鼠嗅觉未剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白、小白蛋白和维生素D依赖性钙结合蛋白数目明显高于嗅觉剥夺侧(P < 0.05)。提示豚鼠嗅觉功能活动影响神经发生和转化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 单侧嗅觉剥夺, 嗅球, 微管聚合蛋白, 维生素D依赖性钙结合蛋白, 小白蛋白；国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Olfactory bulb neurogenesis, transformation and maturation have been considered the hot topic. Olfactory bulb experience and nervous activity can influence olfactory bulb neurogenesis. However, no study reports that olfactory bulb functions can affect olfactory bulb neurogenesis in guinea pigs.
OBJECTIVE: To investigate the effect of unilateral olfactory functional deprivation on doublecortin, calbindin and parvalbumin expression in olfactory bulb of juvenile guinea pigs.
METHODS: Totally 24 guinea pigs were randomly divided into two groups, which were killed after establishing olfactory functional deprivation model through electric cautery injury at the left peripheral nostrils. At 3 and 6 weeks after modeling, the specimens were harvested. The expression change of doublecortin, calbindin and parvalbumin in two sides’ olfactory bulb of juvenile guinea pigs was detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of doublecortin, calbindin and parvalbumin positive cells in olfactory bulb at the un-deprived side was significantly higher than that at the deprived side at 3 and 6 weeks (P < 0.05). This finding indicates that olfactory neural activities can affect neurogenesis and transformation in guinea pigs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: olfactory sensation, olfactory bulb, microtubular proteins, calbindin, vitamin D-dependent, parvalbumin

中图分类号:

R318

曾建军，贺旭，严小新，罗学港，潘爱华 . 电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 231-238.

Zeng Jian-jun, He Xu, Yan Xiao-xin, Luo Xue-gang, Pan Ai-hua. Unilateral olfactory functional deprivation model in the left peripheral nostrils by electric cautery injury: olfactory bulb neurogenesis and transformation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 231-238.

图/表（结果） 4

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引言

嗅觉系统是自然界最古老、保存最完好的系统之一，嗅球是嗅觉系统的重要组成部分，嗅球接受外界信号的刺激，然后进行加工和处理^[1]。人依靠嗅觉分辨气味，而动物寻找食物、识别异己、标记占有地及联络同类等活动主要依赖于嗅觉。嗅球是一个层状结构，接受外界信息的输入后进行加工和处理。实验表明海马齿状回的颗粒下层和侧脑室的室管膜下区有终生产生神经元的能力^[2-5]，并且侧脑室的室管膜下区产生的新生神经元接受了复杂的排斥和吸引，经过“链状迁移”到达嗅球, 嗅球的神经元在成年仍可不断的再生^[6-8]。嗅球中的神经元含有投射神经元和中间神经元两类，其主要细胞是僧帽细胞和簇状细胞。近年来嗅球的神经发生、转化以及成熟已成为研究热点，并且嗅觉经验和神经活动能影响嗅球神经发生^[9-11]，但是到目前为止关于嗅觉功能活动是否影响豚鼠嗅球的神经发生却尚无报道。微管聚合蛋白是一种微管相关蛋白，由360个氨基酸组成，相对分子质量为40 000，其基因位点为Xq22.3-23，其主要作用是加速微管聚合和稳定其网络结构。微管聚合蛋白能转化为中间神经元，它能特异性的表达于未成熟和迁移神经元^[12-13]，并且已经被证明是一个可靠而特异的能反映神经发生的标记物^[14-15]，除此以外跟突触可塑性也相关联^[16]。在啮齿类动物，微管聚合蛋白的表达不仅局限于海马的齿状回颗粒层、室管膜下区及嗅球，在纹状体、胼胝体、梨状皮质和大脑皮质第Ⅰ层也发现有表达^[17-21]。维生素D依赖性钙结合蛋白和小白蛋白是到目前为止最常见的和功能被研究明确的2种钙结合蛋白，是中间神经元的可靠的分子标记物，维生素D依赖性钙结合蛋白参与细胞内Ca²⁺的运输和促进Ca²⁺的吸收，小白蛋白是一种酸性肌浆蛋白，相对分子质量较低(12 000 000)，当细胞兴奋时，小白蛋白与Ca²⁺结合，因此它们充当Ca²⁺缓冲器，直接参与了胞内Ca²⁺的存储浓度和释放。通过中间神经元之间的相互影响，对外界信息作进一步的优化、加工和处理，成为信息的编码、可塑性、学习、记忆等功能的基础^[22-24]，中间神经元在嗅球有明显表达并且嗅球有终生更生中间神经元的能力^[25-28]。鉴于有关幼年豚鼠嗅觉系统神经新生或神经发育是否受嗅觉功能活动的影响以及嗅觉功能剥夺是否影响未成熟神经元和中间神经元在嗅觉系统表达的数目和密度，通过电烙铁损伤左侧外周鼻孔区建立嗅觉功能剥夺模型，观察微管聚合蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白以及小白蛋白在嗅球的发育情况和表达变化，探讨嗅觉功能活动在神经发生及分化过程中的可能作用及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年8月至2012年6月在中南大学湘雅医学院人体解剖与神经生物学系实验室完成。

材料：24只幼年雄性豚鼠，健康清洁级，1周龄，体质量132-143 g，由中南大学湘雅医学院实验动物部提供，许可证号：SYXK(湘)2011-0001。全身情况要求：毛发色泽光亮，身体无脱毛，四肢和尾部无畸形，无炎性疾病，颈部无歪斜。鼻部检查要求：双侧鼻孔等大和对称，无畸形。所有实验动物饲养于中南大学湘雅医学院第三附属医院实验动物部，室温保持22 ℃，相对湿度55%，饲养于12/12 h光暗环境，自由饮水，给予标准饮食。

所有豚鼠按随机数字表法分成2组，每组12只，单号与双号各为一组，分别作为造模后3周、6周组。每只幼年豚鼠左侧鼻孔为嗅觉功能剥夺侧，右侧为未剥夺侧，同只豚鼠的左侧嗅球与右侧嗅球相比较。

单侧嗅觉剥夺幼年豚鼠嗅球神经发生和转化实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
微管聚合蛋白羊抗、小白蛋白鼠抗、维生素D依赖性钙结合蛋白鼠抗	Sigma 公司
DAB、生物素化广谱	Vector公司
Olympus E53显微镜	Olympus公司

实验方法：

实验模型的建立：麻醉方法为10%水合氯醛+5%乌拉坦腹腔注射(3.5 mL/kg，水合氯醛∶乌拉坦=1∶1)，当动物麻醉成功之后，用电烙铁直接插入豚鼠左侧鼻孔，在鼻孔内部烧灼5 s以损坏嗅黏膜，可见鼻孔内侧黏膜水肿，完全堵塞鼻孔，右侧鼻孔保持通畅。模型成功标准：动物在存活时间点内左侧鼻孔保持完全封闭，没有穿孔；动物在存活时间点内左侧鼻孔未发现感染以及伴发其他相关疾病。模型剔除标准：麻醉过深或其他原因导致大鼠在造模过程中或模型制作后死亡；动物在存活时间点内左侧鼻孔再度穿孔或者在预定存活点内发生感染及其他炎性疾病。

嗅球组织标本的制备：动物造模3，6周后，10%水合氯醛腹腔注射(3.5 mL/kg)麻醉，豚鼠被麻醉后，经左心室快速灌注，先使用生理盐水快速灌注，然后改用40 g/L多聚甲醛溶液快速灌注。取出嗅球后固定过夜、浸30%蔗糖(2次)沉底，恒低温冰冻切片机-25 ℃对双侧嗅球同时进行连续切片。切片时采用邻切法，切片厚为30 μm。

免疫组织化学染色：微管聚合蛋白、小白蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白免疫组织化学染色的实验步骤主要如下：把脑片从-20 ℃冰箱取出后复温1/2 h(室温为 22 ℃)；0.01 mol/L PBS(pH=7.3)充分漂洗2次，每次 10 min, 第3次用0.01 mol/L PBS+0.1%tritonX-100缓冲液(pH=7.3)漂洗1次，10 min；体积分数3%H₂O₂处理 18 min，漂洗3次，方法如上；体积分数5%马血清孵育 2 h，然后加入一抗(微管聚合蛋白、小白蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白的抗体浓度依次为1∶1 000， 1∶1 000，1∶1 000)，4 ℃冰箱过夜；漂洗3次，加入二抗(1∶400)室温孵育2 h；ABC复合物：A液与B液提前1/2 h配好，浓度比为1∶400，室温孵育2 h；DAB显色：显微镜下控制显色时间；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

免疫组织化学染色结果分析：从造模后3，6周组嗅觉剥夺模型标本随机抽取6张嗅球免疫组织化学染色切片，在同等曝光值和象素下使用Olympus E53显微镜拍照，应用Image pro plus 6.0图像分析软件检测剥夺侧和未剥夺侧嗅球相同部位等面积下细胞浓度。

主要观察指标：豚鼠微管剥夺侧和未剥夺侧嗅球聚合蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白和小白蛋白表达。

统计学分析：曾建军负责统计学数据的处理，以上所有实验数据以x(_)±s表示，通过双因素方差分析(Two-way ANOVA)统计不同时间点和不同组间差异。实验结果采用Prism GraphPad 5.0软件进行统计分析和处理。以α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

迄今为止，单侧嗅觉剥夺模型已成为研究体内神经元活性、代谢抑制或降低的经典模型之一^[29-32]，现已被广泛采用。本课题组和其他实验研究已表明该模型具有以下几个优点^[33-35]：属于生理功能抑制性模型，接近于生理学状态的条件下进行体内研究，与常用的嗅球切割或毒性药物引起器质性损伤诱导的神经元活性下降或抑制有本质区别；有如络氨酸氢化酶、c-fos等多种可靠的指标验证模型是否成功，减少实验操作过程的无目的性；由于是同一物种左、右两侧嗅球间进行比较，因而排除了不同物种间的个体差异；手术操作简单，失败率低；重复性好制模创伤小，由于采用乙醚麻醉，避免了深度麻醉的不良反应，从而使动物存活率高。嗅球是一个层状结构，从内到外嗅球可分为6层^[36]：颗粒细胞层、内丛状层、僧帽细胞层、外丛状层、突触球层和嗅神经层。已有大量研究表明，嗅觉剥夺能引起兔子、家猫、豚鼠、非灵长类动物的嗅球体积下降^[37-39]；早期嗅觉剥夺改变嗅脑脑区，使嗅脑结构发生变化^[40]；与此同时气味剥夺还能减少嗅球神经发生和神经元的存活时间^[41-42]。

本实验中发现大量的未成熟神经元集中于颗粒细胞层，这是因为海马齿状回的颗粒层和室管膜区终身产生神经干细胞，它们沿着嘴侧迁移流通过“链状迁移”达到嗅球，大部分细胞在颗粒细胞层分化成颗粒细胞，这与Lledo等^[43]的研究结果是一致的。

在3周和6周2个时间点，幼年豚鼠的未剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白阳性细胞多于剥夺侧，差异有显著性意义(P < 0.01)，其原因可能是：嗅球剥夺延缓或者阻碍了嗅球新生神经元突触的发育，从而增加个体神经元内部兴奋性抑制突触密度^[44]；剥夺侧嗅球接触不到外界信号的刺激，产生新生神经元的速度下降甚至是不能产生新生神经元，而未剥夺侧嗅觉正常，嗅觉刺激可以促使嗅球产生新生神经元同时还可以使新生神经元的存活时间延长^[45]，此外未成熟神经元和新生神经元不断整合到嗅觉环路，改变原有的神经网络。

中间神经元(Interneuron)又称为联络神经元，是神经元之间相互联系的桥梁。大部分中间神经元是抑制性神经元，使用γ-氨基丁酸作为神经递质。广泛的说，中间神经元控制神经元网络3个组成部分，其中树突输入，轴突输出。维生素D依赖性钙结合蛋白和小白蛋白是到目前为止最常见的和功能较为明确的2种钙结合蛋白^[46]，维生素D依赖性钙结合蛋白参与了细胞内Ca²⁺的运输和促进Ca²⁺的吸收，小白蛋白是一种酸性肌浆蛋白，当细胞兴奋时，小白蛋白与Ca²⁺结合，因此它们充当Ca²⁺缓冲器，直接参与了胞内Ca²⁺的存储浓度和释放^[47]。小白蛋白中间神经元针对的是细胞的胞体，小白蛋白几乎全部都表达于γ-氨基丁酸，呈树枝状或蓝状，维生素D依赖性钙结合蛋白针对的是神经元的轴突。本实验发现小白蛋白和维生素D依赖性钙结合蛋白则主要分布在突触球层，这可能是由于绝大部分细胞在颗粒细胞层分化成颗粒细胞，只有少数细胞在突触球层分化成中间神经元。本实验发现小白蛋白阳性细胞形态呈树枝状或蓝状，胞体明显，与Celio^[48]报道一致，并且维生素D依赖性钙结合蛋白和小白蛋白主要分布在突触球层和嗅神经层。

在3周和6周2个时间点作者发现小白蛋白和维生素D依赖性钙结合蛋白的表达情况与Double Cortin表达一致，这可能是由于微管聚合蛋白能转化成中间神经元^[49]，具体说就是实验已经证明未剥夺侧的未成熟神经元数目多于剥夺侧，那么未剥夺侧的未成熟神经元转化成转化成中间神经元的细胞也有可能多于剥夺侧；也有可能是嗅觉功能剥夺之后阻断了嗅觉传导通路，因而不能诱发动作电位产生神经冲动。

总之，实验结果表明神经元功能活动能影响神经发生和转化，至于其作用的分子机制会在以后的实验中进一步研究和阐述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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