改良线栓法制作SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.011

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (2): 225-230.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.011

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改良线栓法制作SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型

孙念霞¹，高维娟^{1, 2}，易忠良¹

1承德医学院病理生理学教研室，河北省承德市 067000；2河北化工医药职业技术学院，河北省石家庄市 050026

收稿日期:2013-10-14 出版日期:2014-01-08 发布日期:2014-01-08
通讯作者: 高维娟，博士，教授，硕士生导师，承德医学院病理生理学教研室，河北省承德市 067000；河北化工医药职业技术学院，河北省石家庄市 050026
作者简介:孙念霞，女，1986年生，山东省菏泽市人，汉族，承德医学院在读硕士，主要从事脑缺血再灌注发生机制研究。
基金资助:
河北省科技支撑计划资助项目(13272504D)

Improved suture occlusion method to prepare focal cerebral ischemia reperfusion models in Sprague-Dawley rats

Sun Nian-xia¹, Gao Wei-juan^{1, 2}, Yi Zhong-liang¹

1Department of Pathophysiology, Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China; 2Hebei Chemical and Pharmaceutical College, Shijiazhuang 050026, Hebei Province, China

Received:2013-10-14 Online:2014-01-08 Published:2014-01-08
Contact: Gao Wei-juan, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Pathophysiology, Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China; Hebei Chemical and Pharmaceutical College, Shijiazhuang 050026, Hebei Province, China
About author:Sun Nian-xia, Studying for master’s degree, Department of Pathophysiology, Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China snx1985@163.com
Supported by:
the Scientific Supportive Plan of Hebei Province, No. 13272504D

摘要/Abstract

摘要：

背景：线栓法是制作局灶性脑缺血再灌注模型的常用方法，防治大出血和顺利插线是其造模成功的关键和研究热点。
目的：对Longa线栓法进行改良，以期有效防治术中大出血和提高造模成功率。
方法：制备模型时颈外动脉两断端除了手术线结扎外，线结外端用电刀夹闭；插线时借助弯镊的力量使鱼线沿血管前内侧壁(翼腭动脉分叉处颈内动脉血管的方向)前行。术后进行大鼠行为评分，计算脑梗死体积和光镜下观察组织病理学变化。
结果与结论：电刀夹闭后的血管从横切面上的“圆”形变成“一”字形，线结不易脱落，有效防治术中大出血。借助弯镊的力量，可使插线成功率明显提高。模型大鼠脑梗死体积均明显增加，脑组织病理损伤加重。结果可见改良线栓法制作SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，可有效防止线结脱落，提高插线成功率，模型制备成功。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 组织构建实验造模, 线栓法, SD大鼠, 颈外动脉, 局灶性脑缺血再灌注, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: During the progress of focal cerebral ischemia-reperfusion in rat with transient suture occlusion, bleeding combating and the line being plugged into the cerebral middle artery smoothly are important for successful modeling and research focus.
OBJECTIVE: To improve Longa suture occlusion method for focal cerebral ischemia reperfusion model in Sprague-Dawley rats in order to establish a simple surgical procedure with low rate of intraoperative bleeding and high rate of successful models.
METHODS: The two ends of the external carotid artery were clipped with electric knife, in addition to ligation of surgery lines intraoperatively; with the help of pincett, a fishing line was plugged into the carotid artery along the anteriomedialis artery wall (the direction of the internal carotid artery from the pterygopalatine arterial bifurcation). Postoperative behavior scores in rats, infarct volume calculation and histopathological evaluation under optical microscope were done.
RESULTS AND CONCLUSION: Transverse sections of the external carotid artery were changed from a “O” shape to a “-” shape after being clipped with electric knife. Subsequently, line nodes were not easy to fall off any more, effectively preventing intraoperative bleeding. With the power of pincett, the rate of plugging the fishing line into artery was significantly increased. Rat’s neurological score and infarct volumes were significantly increased, and brain tissue pathological injury worsened. The modified suture occlusion method for focal cerebral ischemia reperfusion models effectively prevented line nodes off, successfully increased the rate of suture occlusion and models in Sprague-Dawley rats were developed successfully.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: models, animal, reperfusion injury, carotid artery, external, rats, Sprague-Dawley

中图分类号:

R318

孙念霞，高维娟，易忠良 . 改良线栓法制作SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 225-230.

Sun Nian-xia, Gao Wei-juan, Yi Zhong-liang. Improved suture occlusion method to prepare focal cerebral ischemia reperfusion models in Sprague-Dawley rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 225-230.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析假手术组大鼠全部纳入结果分析，按造模成功标准改良模型组26只大鼠纳入结果分析，Longa模型组17只大鼠纳入结果分析，改良模型组成模率(87%)与Longa模型组成模率(60%)比较差异有显著性意义(P < 0.05)(图2A)。

2.2 TTC染色和脑梗死体积改良模型组脑梗死体积占大脑总体积的(13.66±6.01)%，Longa模型组脑梗死体积占大脑总体积的(12.89±5.74)%，均与假手术组(0%)比较差异有显著性意义(P < 0.001)，两模型组间差异无显著性意义(P > 0.05)(图2B)。

假手术组大鼠冠状切面左右脑半球染色均匀、对称，灰质呈红色，白质呈浅红或瓷白色，无呈苍白色的梗死区(图2C1)。模型组大鼠脑组织缺血侧可见皮质和(或)皮质下呈苍白色的梗死区域，包括基底核的外侧、顶叶和颞叶皮质、海马、纹状体等区域，与对侧半球呈红色的正常脑组织对比鲜明，白色区与红色区域之间界限不明显(图2C2，C3)。

2.3 组织病理学观察结果光镜下假手术组海马区各层细胞排列规则、整齐，核和核仁清晰可见，胞质内尼氏体为紫蓝色颗粒或块状结构，神经突起自然排列(图3A)。

模型组术侧海马区各层细胞排列紊乱，部分神经细胞消失，残存神经细胞胞膜皱缩内陷，神经纤维异常弯曲，胞质内尼氏体消失、模糊，核固缩均质化，核仁易位(图3B，C)。

假手术组各叶皮质细胞层次清晰，核均匀，核仁清晰、圆形、居中，胞质内尼氏体丰富、深染，胞体有多个突起(图3D)。

模型组缺血侧顶叶、颞叶皮质梗死区和正常区之间无明显界限，梗死区神经细胞出现缺血性损害，部分神经细胞消失，残存神经细胞结构紊乱，纤维弯曲，胞膜外周出现空泡，胞膜皱缩凹陷，胞浆内尼氏体模糊、淡染，核固缩、边集，可见胶质细胞吞噬坏死神经元的现象，间质水肿，见图(图3E，F)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年3至7月在承德医学院基础医学研究所、中心实验室完成。

材料：

实验动物及分组：健康雄性SD大鼠90只，清洁级，体质量(280±20) g，八九周龄，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号SCXK(京)2009-0004。90只SD大鼠随机分为改良模型组，Longa模型组和假手术组，每组30只。

改良线栓法制作SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型所需主要试剂、仪器及软件：
试剂、仪器及软件	来源
氯化三苯基四氮唑(2，3，5- Triphenyltetrazolium Chloride，TTC) (分析纯，产品编号101226237)	Sigma公司
WH-A300W型高频电刀	北京市朝阳维思通工程电器厂
α-EX 50M 1.5号棕褐色鱼线，直径 0.22 mm	威海光威渔具公司
DNP-9052型电热恒温培养箱	上海精宏实验设备有限公司
IXUS115HS型高分辨率相机	Canon公司
Thermo Scientifi Excelsior ES自动脱水机	北京弘泰嘉业科技发展有限公司
Image-Pro PLUS 6.0版图片分析软件	MediaCybernetics 软件公司
SPSS Statistics 17.0 版统计软件	IBM SPSS software 公司
GraphPad Prism 6.0版图表处理软件	GraphPad software 公司

实验方法：

线栓制备：将直径0.22 mm、长35 mm的鱼线完全浸泡在水合氯醛溶液里5 min，消毒和软化鱼线，取出后脱脂棉擦拭1次、纯水冲洗2次，自然风干。插线端靠近文火迅速烧灼一下^[4]，去除头端锋利部分以免刺破血管。在距烧灼端20 mm处做标记。造模时浸泡在生理盐水中备用。

术前准备：①大鼠在安静环境下适应性饲养7 d以上。术前1周给予少于正常的食量，不限制饮水，以免大鼠皮下脂肪堆积影响手术视野；术前2 d正常饮食，自由饮水。术前12 h禁食，不禁水。②8-10 cm长4-0手术丝线在体积分数为75%乙醇里浸泡消毒至少30 min。手术器械、脱脂棉球高压消毒。有齿微动脉夹一侧齿上包绕一薄层脱脂棉，以免夹破血管。③腹腔注射7%水合氯醛5 mL/kg全身麻醉^[5]。

模型制作：

改良模型组：①大鼠全身麻醉4-6 min后翻正反射消失，仰卧位固定于手术板上，头端朝向术者。②持无齿镊牵拉大鼠舌前部到一侧口角处，用弯镊持直径约5 mm的棉球擦拭大鼠口咽部2次到3次，来祛痰和畅通气道。③固定门齿，消毒颈部皮肤3次，颈部正中部位纵行切开皮肤约2 cm长，钝性分离皮下组织，分离左侧颈部血管神经束，找到颈总动脉分叉处，沿血管方向纵行钝性分离颈总动脉和颈外动脉。④颈总动脉处置一根手术线不结扎。颈外动脉处置两根手术线，距分叉4 mm处结扎第1根手术线，在线结的远心端2 mm处结扎第2根手术线，于两线结之间高频电刀电凝夹闭血管，眼科剪剪断血管。线剪剪断两线结处的余线。⑤分离颈外动脉第一分支枕动脉并电凝灼断血管。分离颈内动脉，微动脉夹夹闭颈内动脉、颈总动脉。⑥颈外动脉起始处置一手术线，打单结不收紧，紧靠残端线结处眼科剪垂直血管剪口。⑦取出泡在生理盐水中的鱼线，小心提起颈外动脉残端线结与颈内动脉成一直线，从剪口处插进鱼线达颈内动脉夹闭处，适量收紧颈外动脉起始处的手术线，松开颈内动脉的动脉夹，缓慢推进鱼线。⑧插入鱼线16-18 mm遇阻力时停止，结扎颈外动脉起始处的手术线，松开夹闭颈总动脉的动脉夹(图1)^[6]。⑨记录缺血开始的时间，浸泡过生理盐水的脱脂棉球覆盖伤口。⑩大鼠侧卧位置于电热毯上。缺血90 min后缓慢拔出鱼线^[7-9]，记录再灌注开始的时间，清理伤口，观察无内出血后逐层缝合伤口，乙醇消毒，对皮。

Longa模型组：血管断端只结扎，插线不取助弯镊造成的特殊前进方向，均分离翼腭动脉，先关闭手术切口再拔线栓，其余操作同上^[10]。

假手术组：只分离颈总、颈外和颈内动脉，不结扎不栓线。

造模成功标准：大鼠清醒后1 h，依照 Longa 5级4分制神经学评分原则对大鼠行为进行评分^[10]。Longa 5级4分制评分原则：①0分，正常，无神经系统异常的体征。②1分，不能完全伸展病变对侧上肢。③2分，行走时向对侧旋转。④3分，行走时向对侧倾倒。⑤4分，无自发活动伴意识降低。得1-4分者为成功模型。术中意外死亡、再灌注24 h内死亡、蛛网膜下腔出血的大鼠被剔除。

TTC染色测定脑梗死体积：造模成功的大鼠再灌注 24 h，脊髓脱臼处死后立即断头取脑，生理盐水冲洗2次，置-80 ℃冰箱内冷冻10 min，取出后沿冠状面每隔2 mm切片，切成5片，第1刀在视交叉与大脑前极之间，第2刀在视交叉处，第3刀在垂体处，第4刀在垂体与大脑后极之间^[11]，脑片置避光保存的0.08%TTC-0.01 mol/L pH 7.26的磷酸盐缓冲溶液中^[12]，37 ℃孵育30 min，每隔5 min翻动一次。倾出染色液，磷酸盐缓冲溶液冲洗3次终止染色，置40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，大脑切片正反两面拍片，使用Image-Pro PLUS 6.0图片分析软件计算脑梗死体积。Image-Pro PLUS 6.0图片分析软件中，5个脑片的正反两面使用吸色管和不规则目标区域选择工具各测算一次脑梗死面积和脑片面积，计算百分比值后求均值，作为脑梗死体积。脑梗死体积(%)=全部脑梗死面积/全部脑片面积×100%。

组织病理学观察：TTC染色后的大脑切片经体积分数为75%乙醇脱色脱水、自动脱水机脱水、石蜡包埋、切片，片厚5 μm，经摊片、60 ℃烤片2 h、二甲苯原液脱蜡15 min×2次、体积分数100%乙醇脱水5 min×2次、体积分数为95%乙醇5 min、体积分数为90%乙醇5 min、体积分数为80%乙醇5 min、体积分数为70%乙醇5 min、自来水冲洗5 min×2次、0.2%硫菫溶液37 ℃染色30 min、体积分数为70%乙醇 1 min、体积分数为80%乙醇1 min、体积分数为90%乙醇 1 min、体积分数为95%乙醇1 min、体积分数为95%乙醇分化10 s、体积分数为100%乙醇5 min×2次、二甲苯原液透明10 min×2次、中性树胶封固、干燥，光镜下观察尼氏染色后海马CA1区和顶叶皮质脑组织的病理变化。

主要观察指标：依据模型成功标准筛选出造模成功的大鼠，比较两模型组大鼠的模型成功率，观察假手术组和两模型组大鼠的TTC染色效果、脑梗死体积和光镜下组织病理学的异同。

统计学分析：采用SPSS Statistics 17.0 统计软件进行分析，计量资料呈正态分布采用x(_)±s作统计描述，方差齐性检验采用Levene检验，方差齐采用单因素方差分析，方差不齐采用随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验。计数资料采用百分率作统计描述，采用χ²检验作数据分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

脑缺血再灌注动物模型的建立是开展实验性缺血性脑病的重要基础。Koizumi等^[13]于1986年首先报道了利用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，此后Longa等^[14]对该方法作了改进。插线法制作大鼠短暂性大脑中动脉栓塞模型是目前最理想的局灶性脑缺血再灌注动物模型，因其不需开颅、损伤小，操作简便、不需要特殊设备，缺血部位较恒定、可准确控制缺血和再灌注时间，容易控制局部条件、全身影响小，在国内外得到了广泛的应用^[15-25]。

由于Longa插线法制作的模型存在模型成功率低、插线困难等不足^[3]，后人对Longa插线法做了一系列改进，孙宇等^[26]提出线栓从颈总近颈内外分叉处进入血管制备的大脑中动脉缺血再灌注模型梗死灶恒定、耗时少；有学者研究指出大鼠体质量与栓线直径正交互关系：200-250 g的大鼠多选直径0.20 mm栓线，250-300 g的大鼠多选 0.23 mm栓线，超过350 g的大鼠选0.25 mm的栓线较合适^[27-28]；关于线栓插入深度目前较统一的意见是 (18.5±0.5) mm，并遵循个体差异选择适宜的插线深度^[29]，李忠仁等^[30]提出适宜插线深度可根据各大鼠的TC线长度(指从门齿根部T点距颈总动脉分叉点C点长短)而选择；汪飞等^[31]认为从距离正中0.5-1.0 cm的颈部偏侧切口出血少、便于肌肉及颈内外动脉的分离、对气管刺激性小、视野清晰，大鼠损伤小，有助于模型的存活，优于正中切口。赵凯等^[32]对线栓头端的处理进行改良，采用眼科剪在显微镜下，以垂直于渔线方向将线栓头端剪为平头同样可以成功插线，与用酒精灯烧成球形的线栓相比，头端为平头的线栓可以更加准确地控制头端的直径，同时也降低了处理线栓头端的难度，简化了实验步骤。另外对插入线栓的方式也进行了改良，在颈总动脉上做纵形切口插入线栓，纵形切口后的颈总动脉不容易断裂且操作简便又无需剪断颈外动脉从而减轻了对大鼠创伤，对大鼠的术后咀嚼功能恢复有益。这一改进也直接减少了手术操作，提高了建模成功率。

有实验表明，结扎翼腭动脉后，颈内动脉内的栓线周围易形成血栓，致血管闭塞，再灌注时，难以保证正常的血供^[33]。且翼腭动脉不是基底节区侧支循环的主要供应血管，结扎与否并不影响脑梗死体积和神经缺失症状。因此，一些学者在制备大脑中动脉梗死模型时，不进行翼腭动脉的分离与结扎^[34-36]，能减少大鼠的血栓形成，减少大鼠局部组织的损伤，显著缩短手术时间，减少感染及相关并发症的发生，从而提高造模的效率及成功率。

大出血和插线困难是造模手术过程中的常见问题^[37]，为避免或解决这两个问题，本文采用了电刀夹闭断端血管和先拔栓线再关闭切口防治大出血及沿颈内动脉前内侧壁插线的方法。Longa模型组17只成功，其中4只神经学评分为0分，2只蛛网膜下腔出血，3只插线时呼吸心跳骤停抢救无效死亡，3只拔线后大出血形成的血肿挤压气道抢救无效死亡，1只栓线未能通过颅孔进入颅内。改良模型组成功26只，其中1只神经学评分为0分，1只蛛网膜下腔出血，2只插线时呼吸心跳骤停抢救无效死亡，成模率较Longa模型组明显提高。假手术组无上述情况出现，无神经缺损症状和脑梗死出现，尼氏染色显示各层神经细胞无缺血表现。改良模型组和Longa模型组大鼠出现皮质和(或)皮质下梗死(梗死体积无差别)，大脑切片尼氏染色显示缺血区神经细胞呈现不可逆性缺血性损伤^[37]，进一步证明缺血再灌注模型成功。

实验也存在许多不足，如两个模型组中均出现插线时大鼠出现呼吸心跳骤停抢救无效死亡的情况，可能是术中刺激了左侧迷走神经、交感神经，致呼吸、心跳及血压等产生剧烈波动而死亡^[38-39]。

针对实验结果作者有如下体会：①在距分叉处约 3.5 mm处结扎一次后，手术钳牵拉手术线末端使近乳突端血管处于拉伸状态，在靠近乳突处再次结扎血管，两线结之间的血管电凝夹闭至呈白色，眼科剪垂直剪断白色血管。经此处理的血管两断端无出血现象。②颈外动脉剪口处插线时，弯镊的头端向后向外轻拉线结，镊子紧靠动脉处向前向内抵推鱼线，使鱼线呈弓形沿血管前内侧壁下行，以免误入翼腭动脉。③大鼠术前1周减少食量后，术中视野开阔，操作方便。④栓线插入端稍灼烧不形成圆球，可免头端锋利划破血管、头端直径过大不能通过颅孔，拔线时也能完全退出血管外而不出血。⑤缺血90 min再灌注24 h时，梗死区和正常组织之间的界限不明显，高浓度的TTC染色30 min后，梗死区和正常区域均被染成深红色不易辨别，实验中0.08%TTC染色30 min比2%TTC缩短染色时间效果更好，而且节省TTC^[12]。TTC染色后梗死区域呈白色，可以做为模型成功的指标和计算脑梗死体积百分比，TTC染色操作比尼氏染色更简便。

实验所用的改良线栓法制作SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，经神经学评分、脑梗死体积检测和脑组织病理学观察，证实模型是成功的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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改良线栓法制作SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型

Improved suture occlusion method to prepare focal cerebral ischemia reperfusion models in Sprague-Dawley rats

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