体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (2): 211-217.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.009

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体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力

连建春¹，刘洋²，刘畅^{2, 3}，吕世杰⁴，郭昕²，南丰⁵，孙广炜²，贺欣¹，马小军²

1大连医科大学检验医学院，辽宁省大连市 116044；2中国科学院大连化学物理研究所生物医用材料工程组，辽宁省大连市 116023；3中国科学院大学，北京市 100049；4大连市妇产医院，辽宁省大连市 116021；5大连医科大学附属第二医院骨科，辽宁省大连市 116023

收稿日期:2013-10-16 出版日期:2014-01-08 发布日期:2014-01-08
通讯作者: 孙广炜，博士，副研究员，中国科学院大连化学物理研究所生物医用材料工程组，辽宁省大连市 116023 并列通讯作者：贺欣，硕士，副教授，大连医科大学检验医学院，辽宁省大连市 116044
作者简介:连建春，男，1986年生，山西省大同市人，汉族，大连医科大学在读硕士，主要从事干细胞生物学以及生物材料研究。并列第一作者：刘洋，男，1979年生，辽宁省昌图县人，汉族，2007年大连理工大学毕业，博士，副研究员，主要从事(干)细胞生物学、生物材料以及组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31271055)：模拟细胞微环境强化干细胞体外定向预分化体系的研究及其工程化构建；国家自然科学基金(81101757)：利于肿瘤干细胞扩增的基质刚度与乏氧微环境的构建及调控。国家自然科学基金(21076207)：细胞间质体外模拟系统的构建及物质传递基本规律的研究。国家科技重大专项(2012ZX10002-011-013)：肝癌细胞三维培养模型标准化构建和规模化制备技术研究；大连市科学技术基金(2012J21DW029)：体外肿瘤干细胞培养体系的建立及应用

Phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro

Lian Jian-chun¹, Liu Yang², Liu Chang^{2, 3}, Lv Shi-jie⁴, Guo Xin², Nan Feng⁵, Sun Guang-wei², He Xin¹, Ma Xiao-jun²

1The Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; 2Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, China; 3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4Dalian Maternity Hospital, Dalian 116021, Liaoning Province, China; 5Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116023, Liaoning Province, China

Received:2013-10-16 Online:2014-01-08 Published:2014-01-08
Contact: Corresponding author: Sun Guang-wei, Doctor, Associate investigator, Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, China Corresponding author: He Xin, Master, Associate professor, the Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Lian Jian-chun, Studying for master’s degree, the Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China Liu Yang, Doctor, Associate investigator, Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31271055, 81101757, 21076207; the National Key Science and Technology Project of China, No. 2012ZX10002-011-013; Science and Technology Foundation of Dalian, No. 2012J21DW029

摘要/Abstract

摘要：

背景：人羊膜上皮细胞具有多系分化能力，是再生医学中重要的细胞来源。目前的研究多集中于对其分化能力的考察，而体外培养过程中羊膜上皮细胞的生物学特征如何变化尚不清楚。
目的：分析体外培养对人羊膜上皮细胞生长、表型及向心肌样细胞分化的能力等生物学特性的影响，探讨原代人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性。
方法：使用统一分离方法获得原代羊膜上皮细胞并进行体外培养。利用CCK-8、流式细胞仪及real-time PCR等手段检测不同培养阶段人羊膜上皮细胞的增殖、表型以及向心肌样细胞分化的能力。
结果与结论：不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达在26.7%-97%，存在很大的个体差异。并且，随着传代次数的增加，人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平显著降低，其下降程度与原代SSEA-4的表达水平无关。另外，培养后人羊膜上皮细胞的心肌分化潜能也存在很大个体差异，且其差异与原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平的高低无关。结果提示，不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平受到个体差异的影响，需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得原代高表达SSEA-4的胎儿样本，以实现对人羊膜上皮细胞的质量监控。另外，体外培养过程中SSEA-4的表达水平受到培养条件的影响，需要继续优化培养条件以维持其高表达。此外，人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力受到样本个体差异以及培养条件的影响，在今后还需要进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 羊膜上皮细胞, 体外培养, SSEA-4, 羊膜上皮细胞标志物, 心肌样细胞分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human amniotic epithelial cells are an important source of cells in regenerative medicine as its
multipotentation, but new studies mainly focused on differentiation features and there were little research oneffect of culture in vitro on biological property of amniotic epithelial cells.
OBJECTIVE: To analyze the effects of in vitro culture on growth, cell phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells, and explore the correlation of primarily cultured human amniotic epithelial cells marker SSEA-4 expression level and the change of biological characteristics of human amniotic epithelial cells.
METHODS: Primarily cultured human amniotic epithelial cells were obtained from amniotic tissues by using the same separation protocol. Human amniotic epithelial cells were cultured in vitro. The proliferation, cell phenotype and the differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells were evaluated by means of cell counting kit-8, flow cytometry and real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The SSEA-4 positive cells in primarily cultured human amniotic epithelial cells from different fetal tissues were between 26.7%-97%, which indicated that there was great individual difference among amniotic tissue samples. Moreover, with passage, the SSEA-4 expression in human amniotic epithelial cells decreased significantly, which did not correlate with the SSEA-4 expression in primarily cultured human amniotic epithelial cells. Results indicated that there was great individual difference in SSEA-4 expression level in primarily cultured human amniotic epithelial cells from different amniotic tissue samples. Thus, it is necessary to set up clinical screening indexes to get samples with higher SSEA-4 expression stably and to control the quality of human amniotic epithelial cells. In addition, during culture period, SSEA-4 expression level was affected by culture conditions. The culture conditions of human amniotic epithelial cells should be optimized to maintain SSEA-4 expression at a high level. In addition, the differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells was also affected by individual difference among different samples and culture conditions, which will be further studied in the future.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: stem cells, amnion, epithelial cells, cell differentiation, myocytes, cardiac, antigens, surface

中图分类号:

R318

连建春，刘洋，刘畅，吕世杰，郭昕，南丰，孙广炜，贺欣，马小军. 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 211-217.

Lian Jian-chun, Liu Yang, Liu Chang, Lv Shi-jie, Guo Xin, Nan Feng, Sun Guang-wei, He Xin, Ma Xiao-jun. Phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 211-217.

图/表（结果） 5

2.1 原代人羊膜上皮细胞的生长以及表型分析原代人羊膜上皮细胞呈现鹅卵石样上皮细胞形态，细胞之间排列紧密，核位于细胞中央，清晰可见(图1)。

流式细胞仪分析显示，不同样本来源的原代人羊膜上皮细胞的造血细胞抗原CD34、CD45以及白细胞抗原HLA-DR表达均低于1%，为阴性；而人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达在26.7%-97%，最高和最低表达之间相差约4倍(图1B)，这说明尽管分离方法相同，来源于不同个体的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达仍存在很大个体差异。

2.2 体外培养后人羊膜上皮细胞的生长和表型变化流式细胞仪分析显示，与原代人羊膜上皮细胞相比传代后人羊膜上皮细胞(第2代，P2)的CD34、CD45及HLA-DR的表达水平无变化(图2A)，而干细胞标志物SSEA-4的表达则由(46.8±29.8)%下降到(27.9±21.6)%，且样本之间仍存在较大个体差异(图2B)。另外，第2代人羊膜上皮细胞在培养第9天达到平台期，细胞扩增了约9倍，提示这一代数的人羊膜上皮细胞具有较好的增殖能力(图2B)。

由于原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达存在很大差异，为了解体外培养后SSEA-4的表达和原代细胞SSEA-4表达之间的关联性，接下来作者选取了SSEA-4分别高(97%，标记为high)、中(51.6%，标记为medium)、低(26.7%，标记为low)表达的3个原代人羊膜上皮细胞样本进行体外培养，观察培养后各个样本人羊膜上皮细胞形态和表型的变化。实验结果显示，不同样本之间以及相同样本培养前后细胞形态无明显差别(图3)，在传代过程中大部分细胞均保持了上皮细胞形态，同时也具有少量间质形态的细胞。细胞表型分析则显示，培养后3个样本的SSEA-4表达均出现了明显降低，分别下降了88.3%(高)、56.2%(中)及8.6%(低)。由此可见，原代SSEA-4表达较高的样本在培养后下降得最快，而表达较低的样本培养后下降得最慢，此结果提示原代SSEA-4的表达高低与传代后人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4表达水平无关。

以上结果提示，目前的培养条件无法维持人羊膜上皮细胞干细胞标志物SSEA-4的稳定表达。

此外，在实验中还发现随着传代次数的增加，某些样本来源的人羊膜上皮细胞形态发生了明显改变，即逐渐失去上皮细胞形态，大量细胞变得狭长，出现了间质细胞形态(图4)。细胞表型分析则显示，在人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4表达下降的同时，间质细胞标志物CD73、CD90以及CD105的表达则显著升高，超过90%。

该结果提示，在目前的培养条件下，体外培养可能会使得某些样本来源的人羊膜上皮细胞出现上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)的现象，这与已报道的研究结果是符合的^[24]。

2.3 体外培养后人羊膜上皮细胞心肌分化的潜能为阐明人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平与分化能力的关联性，实验考察了上述SSEA-4表达水平不同的3个人羊膜上皮细胞标本的心肌分化能力。结果显示，随着诱导时间的延长，3个样本的细胞形态出现了显著不同(图5)。Real-time PCR检测结果显示，诱导后SSEA-4中表达样本心肌标志基因Nkx 2.5和GATA4明显上调；高表达样本仅出现了GATA4的升高，Nkx2.5未表达；低表达样本并未出现心肌标志物表达(图5)。

以上结果提示，人羊膜上皮细胞的心肌分化能力存在个体差异，而此差异与原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4 表达水平无关。

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引言

羊膜是胎盘的重要组成部分之一，由羊膜上皮细胞层、基底膜及间充质细胞层组成^[1-2]。人羊膜上皮细胞作为一种干细胞，表达SSEA-4等干性标记物，同时具有向心肌、肝以及胰岛细胞等多系分化的潜力^[3-6]，另外，人羊膜上皮细胞来自临床废弃物，且免疫原性低，使用人羊膜上皮细胞不会给供者带来痛苦，不存在伦理问题，适合异体移植^[7-8]，因此人羊膜上皮细胞具有广泛的临床应用前景^[9-11]。此外，除了造血干细胞、间充质干细胞，近年来国内脐血库也开始收集和保存羊膜上皮细胞，其不断增长的样本数量和标准化样本处理流程为未来羊膜上皮细胞的大规模临床应用奠定了重要的产业化基础^[12-14]。但是，单份胎儿羊膜样本所获得的干细胞数量有限，为了满足干细胞移植治疗的目的，需要对干细胞进行体外培养^[15]。但是，研究发现体外培养过程会对胎儿来源干细胞的生物学特性造成一定的影响，如脐带来源间充质干细胞随着传代次数的增加出现了明显的衰老，并且其向成骨、脂肪以及心肌细胞的分化能力发生了明显改变^[17-19]。对于人羊膜上皮细胞，目前的研究多集中在对其分化能力的考察^[20-24]，关于体外培养过程中人羊膜上皮细胞的表型和分化能力等生物学特性变化的研究还比较少。另外，SSEA-4作为一个主要的人羊膜上皮细胞干性标志物，其表达水平是否与人羊膜上皮细胞生物学特征变化具有一定的内在联系还不明确。因此，实验初步考察了体外培养对人羊膜上皮细胞表型及分化能力的影响，着重探讨了原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性，从而为人羊膜上皮细胞的生物学研究以及未来的临床应用提供了一定的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞学水平，对比实验。

时间及地点：于2012年10月至2013年7月在中国科学院大连化学物理研究所生物医用材料工程组完成。

材料：8例人羊膜组织样本来自大连市妇产医院。实验获得了大连市妇产医院伦理委员会的批准，相关孕妇均签署了知情同意书。提供样本的孕妇无合并症及并发症，均采用阴道分娩方式。由协和干细胞基因工程有限公司大连分公司统一将人羊膜上皮细胞由羊膜组织中分离，并获得原代人羊膜上皮细胞。

实验方法：

人羊膜上皮细胞的传代培养：当人羊膜上皮细胞生长至90%融合时，使用PBS洗涤，之后用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)于37 ℃消化3 min，然后加入培养基终止胰蛋白酶作用，之后1 000 r/min离心 5 min，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，按照1∶2的比例进行传代培养。每3 d更换新鲜培养液，使用相差显微镜观察细胞形态。

人羊膜上皮细胞培养、分化及检测实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
商业化培养液	协和干细胞基因工程有限公司大连分公司
心肌分化的RPMI 1640 培养基、胎牛血清	Hyclone公司
抗坏血酸磷酸钠	Sigma-Aldrich公司
CCK-8试剂	日本同仁公司
0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)	Gibco公司
mouse anti-human HLA-DR、CD34、CD45、mouse IgG-FITC、IgG-PE以及SSEA-4 (PE)	BD Pharmingen™公司
TRIzol、PrimeScript^TM RT、2X SYBR^® Premix Ex Taq^TM II	TAKARA公司
相差显微镜(Eclipse TE2000-U)	Nikon公司
酶标仪	Labsystems Dragon公司
流式细胞仪(Well Scan MK3)	BD FASCalibur
Real-time PCR仪(Stratagenes Mx3000 P Real-Time Cycler)	Agilent Technology公司

人羊膜上皮细胞的增殖检测：按照CCK-8试剂的说明，将细胞接种于96孔培养板，接种密度为4×10³/cm²。每天更换新鲜培养基，并取3个平行孔加入含20 μL CCK-8的培养基200 μL/well，于培养箱内孵育1 h后，用酶标仪测定每孔的吸光度，测定波长为450 nm，参考波长为630 nm。

人羊膜上皮细胞的表型鉴定：将对数生长期的人羊膜上皮细胞用胰蛋白酶消化并洗涤后，细胞浓度均调至1× 10⁹ L^-1。取细胞悬液200 μL，加入荧光标记单抗3 μL混匀，在室温下避光孵育30 min洗涤后用流式细胞仪检测，以mouse IgG-FITC、IgG-PE作为阴性对照。

人羊膜上皮细胞的心肌诱导：参照文献报道的方法进行心肌诱导^[8]，将第2代人羊膜上皮细胞以10⁴/cm²的密度接种于培养瓶中，加入含有体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养48 h后，更换为含有1 mmol/L抗坏血酸磷酸钠的分化培养液，继续培养14 d，每3 d更换新鲜分化培养液。以正常人羊膜上皮细胞作为对照组。

Real-time PCR：待细胞于平面培养至对数生长期，按照试剂盒说明书提取RNA，并进行反转录合成cDNA和实时荧光定量PCR。反转录条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。实时荧光定量PCR条件为：预变性95 ℃ 30 s，PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，扩增45个循环。心肌标志物为Nkx2.5及Gata4，以β-actin作为管家基因(表1)。

主要观察指标：体外培养过程中造血细胞抗原CD34、CD45以及白细胞抗原HLA-DR、人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4变化情况，诱导后细胞心肌标志物Nkx2.5、Gata4表达情况。

统计学分析：利用OriginPro 7.5进行数据统计，使用one-way方差分析，当P < 0.05时认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

目前SSEA-4被认为是人羊膜上皮细胞主要的干性标志物之一，其表达越高代表人羊膜上皮细胞的干性越强^{[11, 25-26]}。此次实验首先发现，在相同分离条件下，不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4蛋白表达水平存在很大的差异，阳性细胞比例在26.7%-97.0%，最高和最低表达之间相差约4倍，这说明不同样本之间原代细胞SSEA-4表达存在很大的个体差异，提示需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得SSEA-4高表达的样本，以更好地进行人羊膜上皮细胞的质量监控。已有的研究表明，孕龄对人羊膜上皮细胞干性标记物表达有重要影响，与晚期妊娠相比，来自中期妊娠的羊膜上皮细胞高表达Nanog、Sox-2，Tra-1-60 和 Tra-1-80^[27]。除此之外与胎儿发育相关的指标，如双顶径、体质量等也与SSEA-4的表达相关，但是对于以上结论还需要大量样本的统计和验证。通过探索临床各类指标与人羊膜上皮细胞干性标志物表达等生物学特性之间的关联，将有助于建立完善的人羊膜上皮细胞样本筛选指标，便于为人羊膜上皮细胞样本的质量监控与合理使用提供帮助。另外，虽然本实验使用的商业化培养液中添加了多种利于人羊膜上皮细胞生长的因子，但仍无法维持SSEA-4的稳定表达。其他实验也表明，人羊膜上皮细胞干性标记物的种类及水平受到了培养方法的影响^[28-30]，并且难以稳定维持^{[18, 31]}。因此可知，目前的培养条件还不足以维持人羊膜上皮细胞干性标志物的高表达。那么，同样具有SSEA-4等表达的胚胎干细胞、多能诱导干细胞等的体外培养方法可能会给人羊膜上皮细胞的体外培养提供一些启发，如与某些特殊基质细胞进行共培养，或使用条件培养液及添加细胞外基质等，这些问题还需要在今后的工作中进一步探讨。此外，这次实验还发现，不同样本来源人羊膜上皮细胞的心肌分化能力也存在很大个体差异，且与原代细胞的SSEA-4表达水平无关，类似结果在向其他组织分化的研究中也有报道^[32]。因此，想要找到影响体外培养后人羊膜上皮细胞定向分化的关键因素，还需要明确特异性高的人羊膜上皮细胞样本筛选指标及优化维持干性的培养条件。总之，本研究表明人羊膜上皮细胞的表型及分化潜能存在较大的个体差异，而体外培养过程又对其生物学特性产生了显著的影响。建立临床样本筛选指标，获得维持人羊膜上皮细胞干性标志物高表达的培养条件是人羊膜上皮细胞临床应用所需要解决的关键问题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[5]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[6]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[7]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[8]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[9]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[10]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[11]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[12]	陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.
[13]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[14]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[15]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.