人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建?

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (7): 1238-1242.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.018

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人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建?

王博涵，余虓，余淦，李恒，肖巍，徐华，叶章群

华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，湖北省武汉市 430030

收稿日期:2012-07-20 修回日期:2012-08-29 出版日期:2013-02-12 发布日期:2013-02-12
通讯作者: 叶章群，博士，教授，主任医师，华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，湖北省武汉市 430030 zhangqun_ye@yahoo.com.cn
作者简介:王博涵☆，男，1984年生，浙江省东阳市人，汉族，华中科技大学同济医学院同济医院泌尿外科在读博士，主要从事泌尿系疾病方面的研究。 bhwang1984@gmail.com

Clone of human KLF4 gene and construction of recombinant KLF4 lentiviral vector

Wang Bo-han, Yu Xiao, Yu Gan, Li Heng, Xiao Wei, Xu Hua, Ye Zhang-qun

Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Received:2012-07-20 Revised:2012-08-29 Online:2013-02-12 Published:2013-02-12
Contact: Ye Zhang-qun, Doctor, Professor, Chief physician, Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China zhangqun_ye@yahoo.com.cn
About author:Wang Bo-han☆, Studying for doctorate, Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China bhwang1984@gmail.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。
目的：构建KLF4基因慢病毒过表达载体。
方法：聚合酶链反应扩增(PCR)目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中，构建重组载体pCDH-KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定，共同转染293NT细胞包装病毒，荧光显微镜观察报告基因的表达情况，收集病毒上清，测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞，RT-PCR检测KLF4 mRNA的表达。
结果与结论：重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确，重组慢病毒载体感染5637细胞后，细胞内KLF4 mRNA高表达。结果证实，实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 慢病毒载体, KLF4基因, 基因重组, 5637细胞, 载体质粒, DNA测序, 组织工程, 泌尿系肿瘤, 大肠杆菌, DH5a感受态细胞, 国家自然科学基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: KLF4 is an essential gene for cell differentiation.
OBJECTIVE: To construct a lentiviral vector pCDH-KLF4 gene.
METHODS: KLF4 gene amplification was used by PCR. Gene amplification products were inserted into the lentiviral vector pCDH and to co-transfect 293TN cells. DNA sequencing was used to confirm the recombinant vector. The virus supernatant was harvested and titrated. The expression of KLF4 was detected by reverse transcription-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: DNA sequencing confirmed that the sequence of amplified KLF4 gene was consistent with the Genebank data. In transfected 5637 cells, KLF4 mRNA was over-expressed. Results verified that lentiviral vevtors of KLF4 gene over-expression were successfully constructed.

Key words: tissue construction, cytology experiments in tissue construction, lentiviral vector, KLF4 gene, gene recombination, 5637 cells, plasmid vector, DNA sequencing, tissue engineering, urinary tract tumors, Escherichia coli, DH5a competent cells, the National Natural Science Foundation of China, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

王博涵，余虓，余淦，李恒，肖巍，徐华，叶章群. 人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建?[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(7): 1238-1242.

Wang Bo-han, Yu Xiao, Yu Gan, Li Heng, Xiao Wei, Xu Hua, Ye Zhang-qun. Clone of human KLF4 gene and construction of recombinant KLF4 lentiviral vector[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(7): 1238-1242.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：病毒载体构建实验。
时间及地点：于2010年9月至2011年6月在华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科实验室完成。
材料：
细胞来源：293TN细胞购于美国SBI公司；5637细胞购于中科院上海细胞库。质粒和菌种KLF4 真核表达载体pEGFP-KLF4来源于吉凯公司、pCDH-CMV-MCS-EF1来源于美国SBI公司；大肠杆菌DH5a感受态细胞由同济医院泌尿外科实验室保存。
人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建主要试剂：
Main reagents for cloning human KLF4 gene and constructing recombinant KLF4 lentiviral vector:

引物设计：引物根据GeneBank 序列采用Oligo6.0 软件设计。PCR扩增KLF4基因，引物1F为5’-ATC GGA ATT CAT GGC TGT CAG CGA CGC GCT-3’，R为5’-ATC GGG ATC CTT AAA
AAT GCC TCTT CAT GTG TAA GG -3’，PCR产物大小为1 535 bp。测序引物2为F为5’-CTC CCA TCT TTC TCC ACG TT-3’，R为5’-GAC GCC TTC AGC ACG AAC-3’，产物大小653 bp。上述引物设计与合成均由上海生工生物工程有限公司完成。引物两端引入酶切位点：EcoRI/BamHI。
方法：
人KLF4基因的扩增与纯化：以包含KLF4的质粒pEGFP-KLF4为模版，用引物1进行PCR扩增。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，按凝胶回收试剂盒回收纯化目的条带。
感受态细胞的制备：从37 ℃培养16 h的新鲜平板中挑选一个单菌落，转到一含100 mL LB培养基的烧瓶中。于37 ℃剧烈摇晃培养3 h。在无菌条件下将细胞转移到一个无菌预冷的50 mL聚丙烯管中，在冰上放置10 min。于4 ℃，3 000×g，离心10 min，回收细胞。倒出培养基，将管倒置1 min。以10 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，放置于冰浴上。于4 ℃，以3 000×g，离心10 min，回收细胞。倒出培养基，每50 mL初始培养物用2 mL用预冷的0.1 mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀，将细胞分装，放于-70 ℃冻存。
重组慢病毒载体质粒的构建：将PCR产物与载体pCDH-CMV-MCS-EF1、T4 DNA连接酶、buffer与ddH₂O加入反应体系，于4 ℃反应过夜，转化DH5a。通过酶切法鉴定细菌阳性克隆，通过PCR和测序法鉴定基因的准确性，送上海生工生物公司测序。
慢病毒包装：取处于对数生长期293TN细胞，每 150 cm2培养面积种(7.0-8.0)×10⁶，在20 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中培养18-24 h，转染时细胞密度约为60%-80%。制备Plasmid-PureFection混合物方法如下：1 mL体积的opti-MEM中，加入pCDH-F5 4.5 μg，pPACKH1载体45 μL混合均匀。加入55 μL PureFection转染试剂并漩涡振荡10 s，放置 15 min，将上述混合液加入293TN细胞的培养液中，轻轻混匀，置于37 ℃，体积分数5%CO2细胞培养箱中培养24 h后换液，加入含体积分数10%胎牛血清的细胞培养基25 mL，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内继续培养48 h。收集293TN细胞上清液，4 ℃，4 000×g 离心10 min，以0.45 μm滤器过滤上清液于40 mL高速离心管中。加入5×PEG-it病毒沉淀剂，于4 ℃反应过夜，1 500×g离心30 min，白色沉淀吸去上清。冰PBS重悬病毒沉淀，4 ℃溶解过夜。分装后置于-70 ℃保存。
慢病毒滴度测定：慢病毒溶液按10倍梯度稀释为原浓度的1/10²，1/10³，1/10⁴，1/10⁵，1/10⁶倍共5个浓度梯度后，分别感染种于96孔板内的293TN细胞感染。体系为每孔90 μL培养基±10 μL稀释病毒液，每个梯度做3个复孔。24 h在倒置荧光显微镜下观察，寻找仅有部分细胞感染成功且可以计数的浓度梯度，本实验1/10⁵倍为合适浓度。在200×显微镜下统计3个复孔的所有转染的细胞取平均值。病毒滴度等于：平均值/0.01 mL×稀释度。
KLF4过表达鉴定：将构建好的pCDH-KLF4和空病毒pCDH-control分别感染5637细胞，24 h后用荧光显微镜观察转染效率，48 h后提RNA。采用TAKARA公司试剂盒反转录并做实时定量PCR检测KLF4的表达变化。实时定量PCR引物为：F5’-CAG AGG AGC CCA AGC CAA AG-3’，R5’-ATC CAC AGC CGT CCC AGT C-3’。
主要观察指标：PCR凝胶电泳检测KLF4扩增产物以及慢病毒重组转座子，免疫荧光检测病毒转染效率，Realtime PCR 检测PCDH-KLF4感染5637细胞48 h后检测KLF4 mRNA的表达。
统计学分析：实时定量PCR检测值的倍数值以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析。数据分析采用SPSS 10.0软件，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

KLF4是一个复杂的转录因子，根据不同的环境发挥不同的作用。人类KLF4基因位于染色体9q31，有5个外显子。KLF4的cDNA包含470个氨基酸的蛋白质，其相对分子质量为55 000。KLF4基因在胚胎发育第15.5天时在胃肠道表达水平最高，对调节细胞增殖、分化，维持组织内环境稳态中有重要作用。例如KLF4敲除小鼠由于缺乏皮肤表皮屏障所以在出生后很快死于脱水。Takahashi等^[2]从胚胎干细胞相关的24个基因中挑选出4个基因(Oct4、Sox2、c-Myc和KLF4)，通过导入小鼠成纤维细胞后，使得小鼠体细胞重新具备了向3个胚层重新分化的能力。这些证据表明KLF4在细胞分化起到重要作用。KLF4基因在食管癌、结肠癌、直肠癌、胃癌等消化系统肿瘤中是低表达的，在肺癌和乳腺癌也是低表达^[6-16]。在泌尿系统，正常膀胱组织中，KLF4具有较高的表达量，而在膀胱癌细胞和组织中，KLF4含量明显降低。通过在膀胱细胞系中过表达KLF4可以抑制肿瘤细胞的增长并促进凋亡，说明KLF4在膀胱肿瘤的形成和发展中具有抑制作用^[3]。良性前列腺增生症和前列腺癌发展过程中都具有上皮间质化过程，有研究表明在上皮间质化过程中KLF4的减少是一个重要的因素，同样，有研究显示在前列腺癌转移过程中，KLF4的表达显著降低，因此建议将KLF4作为前列腺癌侵袭和转移的一个潜在的预测指标^{[4, 17]}。

转基因技术研究中常用的非病毒载体包括脂质体和磷酸共沉淀法等，但转染效率低。病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体及慢病毒载体等。腺病毒载体经包装后能感染分裂和非分裂的细胞。病毒DNA游离在细胞核内，并不整合到染色体上，在体内不能实现稳定的长期表达，且反复应用易产生免疫反应。腺相关病毒载体较少产生免疫反应，然而插入片段少于4.5 kb，转染效率低^[18]。慢病毒载体是近年来非常热门的病毒载体，它的优点是可以容纳较大的外源性基因，可以稳定表达，宿主细胞免疫反应和对其毒性比较小^[19-20]，并且可以感染分裂期和非分裂期细胞。本实验结果显示成功构建了高转染效率的pCDH-KLF4，可以在5637细胞中高表达KLF4基因，这对今后研究KLF4基因在组织工程修复中奠定了基础。

基金资助：国家自然科学基金-青年基金资助项目(81000292)。
作者贡献：第一作者负责实验的实施、数据统计和论文撰写，通讯作者负责课题设计、组织实施和文章的审阅等，其它作者协助实验的实施和数据分析。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其它经济组织直接或间接的经济或利益冲突。
伦理要求：实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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