1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 于2018年5至12月在青岛大学中心实验室完成。
1.3 材料
实验动物:体质量2.5-3.0 kg,兔龄为10-12月龄雄性清洁级新西兰大白兔32只,由青岛大学中心实验室动物房提供,动物许可证号:SYXK(鲁)20150003。室温下分笼饲养于无特殊病原菌的动物房,标准饲料饲养,动物可以自由进食和水,实验前适应性饲养3 d。实验过程均2018-03-01经青岛大学实验动物管理伦理委员会批准,批准号:AHQU-MAL2018032,符合实验动物伦理要求。
实验使用的主要试剂和仪器:硫氢化钠(NaHS)购自上海麦克林公司;CBS酶抑制剂-氨基氧乙酸、CSE酶抑制剂-炔丙基甘氨酸购自美国Sigma公司;两步法抗兔免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司;RNA 提取试剂盒(TRIzol® Reagent)购自美国Invitrogen公司;基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13以及内参β-actin的上下游引物购自上海生物工程有限公司;SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒(Perfect Real-Time)购自日本TaKaRa公司;倒置显微镜购自日本Olympus BX公司;荧光定量基因扩增仪购自美国ABI7300公司;恒温水浴箱(LRH-150)购自上海益恒公司;紫外分光光度仪购自美国Labsytem公司。
1.4 方法
1.4.1 实验分组 将32只新西兰大白兔采用随机数字表法随机分为空白对照组、骨性关节炎组、H2S干预组和抑制H2S生成组,每组8只。
1.4.2 兔骨性关节炎模型建立 见表1。
1.4.3 药物干预 术后1周开始,骨性关节炎组给予膝关节腔注射生理盐水1 mL,H2S干预组膝关节腔给予注射 60 μmol/L的NaHS稀释液1 mL,抑制H2S生成组膝关节腔给予注射H2S合成酶抑制剂(氨基氧乙酸,37.5 mg/kg;炔丙基甘氨酸,60 mg/kg)1 mL,1次/周,连续6周。空白对照组不做任何处理。
1.4.4 大体观察 处死动物后,切开其膝关节囊暴露出关节软骨,首先对其进行大体观察。
1.4.5 病理学观察 将软骨样本用常规梯度乙醇脱水,EDTA溶液脱钙,石蜡包埋后垂直软骨表面方向作4 μm厚连续切片,然后行苏木精-伊红染色,每张切片随机选3个不同视野,根据改良Mankin评分系统进行评估[14]。由2名病理科医师轮流阅片评分,取平均分。
1.4.6 免疫组化观察Ⅱ型胶原蛋白表达 将石蜡切片常规烤片、脱蜡、水化;浸入柠檬酸盐缓冲液用微波修复抗原;用体积分数5%羊血清(PBS配置)在37 ℃下恒温封闭30 min;滴羊抗兔Ⅱ型胶原蛋白多克隆抗体4 ℃孵育过夜;HRP标记的二抗37 ℃孵育30 min;DAB显色8-12 min;树脂封固后应用图像采集系统分析结果。
1.4.7 反转录PCR检测软骨细胞中基因表达 取出液氮中的关节软骨标本,研磨后加入1 mL Trizol溶液,将组织匀浆,直至标本溶化。静置5 min后向匀浆液中加入200 μL氯仿(1 mL的Trizol配200 μL的氯仿),在室温下静置3.0- 4.0 min。4 ℃,12 000 r/min离心15 min后取无色上清液400 μL,然后加入等量的400 μL预冷的异丙醇,室温下放置5 min。4 ℃,12 000 r/min离心10 min后弃去上清液,加入1 mL体积分数75%乙醇洗涤沉淀2次。室温下放置晾干,加入50 μL不含RNA酶的双蒸水反复吹打,混匀,充分溶解RNA。利用紫外分光光度仪测量吸光度值及RNA的浓度,核酸A260/A280值应介于1.8-2.0之间,重复测量3次。按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA,-20 ℃保存。应用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒行实时荧光定量PCR检测,分析样本中基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3与基质金属蛋白酶13的基因相对表达量。目的基因及内参的引物序列情况见表2。样本中基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13的基因相对表达情况根据公式 RQ=2-??Ct计算。
1.5 主要观察指标 ①大体观察;②病理学观察;③免疫组化观察Ⅱ型胶原蛋白表达;④反转录PCR检测软骨细胞中基因表达。
1.6 统计学分析 所有数据均使用SPSS 22.0统计分析软件(美国IBM公司)进行统计学分析,定量资料以x±s描述,符合正态分布的数据运用单因素方差分析比较组间差异,不符合正态分布的数据则采用非参数秩和检验比较组间差异。P < 0.05为差异有显著性意义。