肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0401

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (1): 40-45.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0401

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用

王亚萍¹，孔祥平²，卓丽¹，唐小平¹，高洪波¹，佟明华²

¹广州市第八人民医院肝病科，广东省广州市 510060；²解放军第四五八医院肝病防治中心，广东省广州市 510600

修回日期:2017-10-13 出版日期:2018-01-08 发布日期:2018-01-08
通讯作者: 佟明华，博士，主任医师，解放军第四五八医院肝病防治中心，广东省广州市 510600
作者简介:王亚萍，女，1985年生,四川省眉山市人，汉族，2013年南方医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨科研究。
基金资助:
国家973重点基础研究发展计划(2010CB945502)；广州市科技计划项目(201508020262)；广东省科技计划项目(2015B020226004)

Role of mature liver cells and oval cells in liver regeneration after liver injury

Wang Ya-ping¹, Kong Xiang-ping², Zhuo Li¹, Tang Xiao-ping¹, Gao Hong-bo¹, Tong Ming-hua²

¹Department of Hepatopathy, Guangzhou Eighth People’s Hospital, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China; ²Prevention and Treatment Center for Hepatopathy, the 458^th Hospital of PLA, Guangzhou 510600, Guangdong Province, China

Revised:2017-10-13 Online:2018-01-08 Published:2018-01-08
Contact: Tong Ming-hua, M.D., Chief physician, Prevention and Treatment Center for Hepatopathy, the 458th Hospital of PLA, Guangzhou 510600, Guangdong Province, China
About author:Wang Ya-ping, Master, Attending physician, Department of Hepatopathy, Guangzhou Eighth People’s Hospital, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Basic Research Program of China (973 Program), No. 2010CB945502; the Key Scientific and Technological Program of Guangzhou City, No. 201508020262; the Scientific and Technological Program of Guangdong Province, No. 2015B020226004

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肝卵圆细胞：Farber于1950年发现，乙硫氨基酪酸、2-氨基乙酰芴及3-甲基-4-二甲基胺苯等致癌物质可导致大鼠肝脏门脉周围区的上皮细胞增生，因这些增生的上皮细胞细胞核呈卵圆形，故将其命名为卵圆细胞(oval cells)。1956年，Farber首次将其命名为卵圆细胞。后来研究发现其他组织器官在某些病理条件下也出现细胞核为卵圆形的细胞，为与其他组织器官的卵圆形细胞相区别，常将肝脏的这种卵圆形细胞称为肝脏卵圆细胞 (hepatic oval cells，HOC)。一般认为，肝脏卵圆细胞直径为10-15 μm，表达OV-6、细胞角蛋白19、谷氨酰转肽酶、部分表达白蛋白及甲胎球蛋白，但不表达过氧化物酶。
倒千里光碱：中文名雪叶莲，菊科植物名称。菊科是被子植物中最大的一个科；有900-1 000属，25 000- 30 000种，全世界都有分布，热带较少，中国有230属2 300多种。该科植物中有毒种类较多，主要分布在苍耳属(XanthiumL.)、艾属(ArtemiaL.)、斑鸠菊属(VernoniaSchreber)和千里光属(SenecioL.)。

摘要
背景：倒千里光碱是能长期抑制成熟肝细胞分裂增生的肝化学毒剂。
目的：联合应用倒千里光碱和肝脏1/3切除建立肝损伤大鼠模型，肝损伤观察大鼠肝细胞和卵圆细胞增殖情况，以及成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。
方法：SD雄性大鼠30只，随机分为2组，每组15只。①倒千里光碱/肝脏1/3切除组：腹腔注射倒千里光碱，30 mg/ kg，共注射2次，每次间隔2周；②1/3肝切除组：用生理盐水代替倒千里光碱。两组大鼠在末次注射4周后行肝脏1/3切除术。观察两组大鼠术后不同时间点肝脏病理形态变化、细胞增殖情况和CK19、C-kit免疫组织化学检测情况。
结果与结论：①倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠术后20 d体质量仍低于术前，肝脏增大明显小于肝脏1/3切除组，苏木精-伊红染色示胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性，汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生；②肝脏1/3切除组术后20 d体质量恢复接近术前，肝脏损害较倒千里光碱/肝脏1/3切除组轻，Brdu免疫荧光示成熟肝细胞大量增生，术后14 d见肝卵圆细胞增生，多出现在肝细胞索中，形态和免疫组织化学标记与倒千里光碱/肝脏1/3切除组卵圆细胞一致；③结果提示，成功构建了倒千里光碱联合肝脏1/3切除的急性肝损伤大鼠模型，实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞和成熟肝细胞增殖的现象，证实肝细胞更新与损伤后再生是肝流域中肝内外源肝干细胞及成熟肝细胞共同作用的结果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0609-9115(王亚萍)

关键词: 组织构建, 组织工程, 倒千里光碱, 肝脏1/3切除术, 肝细胞, 卵圆细胞, 肝脏再生

Abstract:

BACKGROUND: Retrorsine (RS) is a chemical agent for the long-term inhibition of mature liver cell division and proliferation.
OBJECTIVE: To establish a rat model of liver injury by combined use of RS and 1/3 partial hepatectomy, to observe the proliferation of liver cells and oval cells in rats after liver injury, and to discuss the relationship between liver regeneration and mature liver cells and oval cells after liver injury.
METHODS: Thirty male Sprague-Dawely rats were randomized into two groups (n=15 per group): RS group and control group. Rats in the RS group were subjected to intraperitoneal injection of RS, 30 mg/kg, twice in total, with 2 weeks in between; and rats in the control group were injected physiological saline instead of RS. Four weeks after the last injection, the 1/3 partial hepatectomy was performed in two groups of rats. Liver pathological and morphological changes as well as cell proliferation were observed, and CK19 and C-kit immunohistochemical detections of the rat liver in the two groups were conducted at different time points after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: At 20 days after operation, the body mass of the RS group rats was still lower than the baseline, and the liver increase was obviously less than that in the control group; there was cell body swelling shown by hematoxylin-eosin staining, loose cytoplasm, extensive vacuoles degeneration of liver cells, and clustered or scattered oval cells around the portal area of small bile duct and in the hepatic lobule. However, in the control group, the body mass was close to the baseline, liver damage was lighter than that in the RS group, a large number of mature liver cells proliferated under BrdU Immunofluorescence at 20 days after operation; liver oval cells proliferated and distributed in the liver cell line at 14 days after operation, with morphology and immunohistochemical markers consistent with oval cells in the RS group. These findings indicate that the rat model of acute liver injury is successfully established by combining retrorsine with 1/3 partial hepatectomy, liver poisoning and the proliferation of liver stem cells and mature liver cells after poisoning can be seen in the experiment, which firmly confirm that liver cell renewal and regeneration after injury is accredited to the combined action of liver stem cells in liver basin and mature liver cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hepatectomy, Hepatocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王亚萍，孔祥平，卓丽，唐小平，高洪波，佟明华. 肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 40-45.

Wang Ya-ping, Kong Xiang-ping, Zhuo Li, Tang Xiao-ping, Gao Hong-bo, Tong Ming-hua. Role of mature liver cells and oval cells in liver regeneration after liver injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 40-45.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠30只，分为2组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 大鼠体质量及病理学大体改变 两组大鼠肝脏1/3切除后体质量均明显下降，肝脏出现充血肿胀，少数散在瘀点。倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠术后20 d体质量仍低于术前，肝脏增大明显小于肝脏1/3切除组，肝脏颜色稍淡，余小叶增生不明显(图2A)。肝脏1/3切除组至术后20 d体质量恢复接近术前，肝脏颜色偏深，结构恢复良好，余小叶增生明显(图2B)。

2.3 苏木精-伊红染色结果 肝脏1/3切除后第3天，倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠肝脏可见胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性，散在肝组织小灶凝固性坏死(图3A)；术后第7天可见肝细胞小灶状坏死、汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生 (图3B)；第14天这种有增生倾向的卵圆细胞减少，部分细胞呈团束状、细胞间无管腔或有围管现象(图3C)。肝脏1/3切除组仅见肝细胞和胆管细胞轻微固缩、部分轻度水变性和少数细胞轻微空泡变性，第14天5例中2例损伤较重的大鼠汇管区可见炎细胞浸润，伴少量卵圆细胞出现并向小叶内延伸(图3D)。直到术后第20天仍能观察到卵圆细胞的增生。

2.4 BrdU免疫荧光化学检测结果 见图4。

肝脏1/3切除后第3天，倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠肝组织内可见散在数个BrdU阳性的肝卵圆细胞，细胞核小，仅正常肝细胞核的1/4左右，多出现在细胆管壁和基膜外侧及少部分肝细胞索中(图4A)。肝脏1/3切除组大鼠肝组织内可见较多的BrdU阳性成熟肝细胞。核体积较大，圆形，与附近肝细胞核体积相仿，只出现在肝板内(图4D)。其中，倒千里光碱/肝脏1/3切除组在各时间点上均看到少量成熟肝细胞的增殖。两组大鼠肝脏BrdU阳性细胞在术后第7天增殖最活跃，直到第14天仍维持在一定高的水平上，其中倒千里光碱/肝脏1/3切除组出现数十个至数百个BrdU阳性卵圆细胞团(图4B)。同一时间点，对照组未见肝细胞团出现(图4E)，BrdU阳性细胞数与实验组接近，稍低于实验组，但组间差异无显著性意义(P > 0.05)。随着时间的增加，增殖细胞的数量逐渐减少，20 d左右基本消失(图4C、F)。值得注意的是：①倒千里光碱/肝脏1/3切除组的各时间点上均可见少量成熟肝细胞的增殖；②肝脏1/3切除组术后14 d切片中可见BrdU阳性的肝卵圆细胞，多出现在肝细胞索中，形态与倒千里光碱/肝脏1/3切除组卵圆细胞一致。

2.5 CK19和C-kit免疫组织化学染色结果 阳性细胞表现为细胞浆呈棕黄色，均匀弥漫性。

倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠术后第3天在肝脏汇管区附近可见核呈卵圆形，胞质较少的CK19阳性细胞，多出现在细胆管壁和基膜外侧(图5A)；第7天阳性细胞增加，并逐渐向肝小叶内穿插生长(图5B)；之后阳性细胞数逐渐减少，20 d左右仅见少量阳性细胞(图5C)。C-Kit染色结果基本和CK19相同(图5D-F)。肝脏1/3切除组术后3，7 d在切片中均未见CK19阳性细胞(图5G)，术后第14天作者在其中2例大鼠切片中发现CK19阳性肝卵圆细胞，多出现在肝细胞索中，形态和免疫组织化学标记与倒千里光碱/肝脏1/3切除组卵圆细胞一致(图5H)。2例大鼠直到术后第20天仍能观察到卵圆细胞的增生(图5I)。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年9月在中山大学完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级体质量150 g左右SD雄性大鼠30只，由中山大学动物实验中心提供，许可证号为SCXK(粤) 2011-0029。

试剂：倒千里光碱(RS)、BrdU、Triton X-100(Sigma)；鼠抗BrdU多克隆抗体(Invitrogen)；兔抗鼠CK19、C-Kit (Bioss)；Anti-Mouse IgG Fragment (Cellsignal)；抗兔免疫组织化学检测试剂盒(DAKO)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组和大鼠化学性肝损伤模型的建立 30只大鼠随机分为2组，每组15只。倒千里光碱/肝脏1/3切除组：取150 g左右SD大鼠，腹腔注射倒千里光碱溶液30 mg/kg，共注射2次，每次间隔2周。肝脏1/3切除组：用生理盐水代替倒千里光碱，腹腔注射30 mg/kg，共注射2次，每次间隔2周^[6]。

1.4.2 大鼠肝脏的1/3切除 第2次腹腔注射4周后，两组大鼠行肝脏1/3切除术。乙醚吸入麻醉，剑突下行0.7-1.0 cm大小竖直切口，钝性分离；利用腹压，轻轻挤出肝脏的左外叶、左中叶及中叶，用手术线从根部结扎左外叶，眼科剪剪掉左外叶，将结扎端埋入腹腔，逐层缝合切口(图1)。术前动物不禁食、禁水，无菌手术操作，术后保温至大鼠苏醒并自由进食及饮水。

1.4.3 肝脏的苏木精-伊红染色观察 大鼠肝脏1/3切除术后，每组取3-5只大鼠于术后第3，7，14，20天处死并取出肝脏称质量，体积分数10%甲醛固定，石蜡包埋，常规切片。采用苏木精-伊红染色。

1.4.4 BrdU注射及BrdU免疫荧光化学检测 ①BrdU注射：BrdU 50 mg/kg腹腔注射，共4次，每次间隔2 h，最后1次注射24 h后处死动物并取肝脏；②Brdu免疫荧光化学检测：石蜡组织切片脱蜡至水后，0.3% TritonX-100透化组织25 min，2 mol/L HCl 37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，0.1 mol/L、pH 8.5的硼酸室温处理10 min，PBS洗涤，0.05%胰酶37 ℃抗原修复15 min，PBS洗涤，山羊血清封闭50 min。加入抗Brdu单克隆抗体(1∶100)，置于湿盒中，4 ℃过夜。PBS洗涤，加入Alexa Fluor 488 Conjugate二抗(1∶200)，37 ℃孵育1 h；PBS冲洗，荧光封固液封固，荧光显微镜观察。

1.4.5 CK19、C-Kit免疫组织化学检测 取肝脏组织采用SP法免疫组织化学染色，显微镜下观察；应用Image- Proplus 6.0专业图像分析软件对染色阳性部位灰度值进行定量分析。

1.5 主要观察指标 ①大鼠体质量及病理学大体改变；②肝脏组织苏木精-伊红染色结果；③肝脏组织BrdU免疫荧光化学检测结果；④CK19和C-kit免疫组织化学染色结果。

1.6 统计学分析 所有数据采用SPSS 13.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，两组大鼠各时间点体质量比较采用t 检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肝脏在受到各种因素损伤后可迅速表现出巨大的再生能力，肝脏再生是一个涉及多种效应细胞增殖反应的高度协调的过程，参与肝脏再生的细胞种类与肝损伤程度密切相关^[7]。目前，很多肝脏再生的研究是在动物实验模型中进行的，首先采用多种毒剂制造肝细胞损害，再通过局部肝切给予极大的肝再生需求，从而建立更适合的肝脏再生动物模型^[8-9]。本实验成功建立了倒千里光碱联合应用肝脏部分切除导致肝脏急性损伤的模型，并依据研究中观察到的一系列现象，探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和肝卵圆细胞与肝脏再生的关系。

两组动物病理学大体改变可见肝脏1/3切除组大鼠术后20 d体质量恢复接近术前，余小叶增生明显。而倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠术后20 d体质量仍低于术前，肝脏增大明显小于肝脏1/3切除组，余小叶增生不明显。说明倒千里光碱能够损伤肝细胞的增殖能力，抑制成熟肝细胞分裂增生。倒千里光碱是千里光属植物种中所含吡咯烷类生物碱，进入体内后主要是经由成熟肝细胞的P450酶系代谢，产生毒性产物，将细胞阻滞在细胞周期中的G₁/S期、S后期和(或)G₂/M期，从而抑制肝细胞的增殖^[10-12]。

倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠肝脏苏木精-伊红染色出现胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性；而肝脏1/3切除组仅见肝细胞和胆管细胞轻微固缩、部分轻度水变性；说明倒千里光碱造成大量肝细胞严重变性和炎症反应。这种炎症反应可能是在体液水平传递肝再生信号的一种方式或者是肝干细胞响应肝再生信号的有利协同因素(许多文献表明肝干细胞增生和分化与白细胞分泌的多种细胞因子有关)^[13-14]。

本实验倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠在BrdU及CK19、C-kit免疫组织化学中均观察到不同程度的肝卵圆细胞的增殖，增殖的细胞具有以下几个特征：①细胞体积明显小于肝细胞，相当于肝细胞的1/4-1/3；②形态多为卵圆型，多排列成小腺管样结构或成簇或散在分布；③在此模型中，卵圆细胞的增殖主要位于细胆管壁、Hering管及胆管周围基膜外侧以及与Hering管相邻的肝细胞索中^[15]。说明对倒千里光碱处理的大鼠进行肝切除后，残余成熟肝细胞不能有效分裂增生以满足补充肝细胞的急切需求，肝干细胞就增生为可观察到的成群的卵圆细胞，并进一步增殖分化以补充肝主质细胞之损失。另外，在倒千里光碱/肝脏1/3切除组的各时间点上均看到少量成熟肝细胞的增殖，其内在含义也值得深究。至少有两种可能：或者倒千里光碱对成熟肝细胞分裂增殖的抑制并不完全；或者这些大核分裂相是瞬间由P450匮乏的肝干细胞分化而来的，其P450的含量或者倒千里光碱的毒性代谢产物在细胞启动核分裂之前尚未及达到抑制核分裂产生所需的水平^[16]。

许多报道认为肝切除(PH)后大鼠肝再生系单独由肝细胞分裂增殖完成^[17-19]，此过程无胆管细胞和卵圆细胞参与。而在本实验中，在肝切除组中不仅注意到了文献中通常报道的成熟肝细胞的分裂增殖，而且还观察到了肝脏卵圆细胞的增殖。肝切除组术后第3天Brdu阳性肝细胞迅速增多并于第7天到达峰值，随着时间的增加，增殖肝细胞的数量逐渐减少。术后14 d左右在切片中发现了BrdU阳性的肝卵圆细胞，多出现在肝细胞索中，形态和免疫组织化学标记与倒千里光碱/肝脏1/3切除组卵圆细胞一致。多数大鼠直到术后第20天仍能观察到卵圆细胞的增生。提示：肝切除组术后肝再生可能是由率先启动的成熟肝细胞增殖和随后启动的肝干细胞增殖分化来共同完成的。另外，肝切除组中卵圆细胞出现的大鼠往往是肝组织炎症程度和小灶坏死比较严重的大鼠，这表明卵圆细胞增生反应与肝细胞变性、肝切除后炎症反应和小灶凝固性坏死的程度成正比。

在实验中，倒千里光碱/肝脏1/3切除组和1/3肝切除两组大鼠均完成了肝脏的再生，说明损伤肝再生不仅是由成熟肝细胞增殖来实现，而且要保证正常的肝重建速率，需要肝干细胞更高水平的分裂增殖^[20-22]。总之：肝细胞更新与损伤后再生是肝流域中肝内源及肝外源肝干细胞和成熟肝细胞共同作用的结果，而且从机体漫长生命历程的角度衡量，只有肝干细胞才是肝实质细胞生理更新和病理再生的根本基础^[23]。但是对于肝干细胞的来源、分化潜能、以及参与肝脏修复的过程，都有待进行更深入的研究，以更好的服务于肝脏生理病理及肝脏相关疾病的治疗等研究^[24]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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