三维重组人体皮肤模型在与表皮基底膜相关皮肤内稳态研究中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0096

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
表皮基底膜：真皮和表皮是人体皮肤的两大主要部分，表皮基底膜则是位于这两种形态迥异的组织之间、由一系列胞外基质分子组成的膜状结构区域。表皮基底膜也有皮肤基底膜、真皮-表皮连接处、皮肤基底膜带等别称。
三维重组人体皮肤模型：也称组织工程皮肤、人体皮肤替代物等。三维重组人体皮肤模型指采用生物相容性良好的基质材料，将人体来源的真皮成纤维细胞、表皮角质细胞等接种于其上进行体外培养，培育出与人体皮肤结构和功能相似的三维人工皮肤。

摘要
背景：日趋成熟的皮肤组织工程技术正在皮肤学的研究中发挥着越来越重要的作用。皮肤组织工程领域的重要研究内容之一就是构建具有完善的表皮基底膜的体外重组皮肤模型，这是因为表皮基底膜作为真皮和表皮的交界，将两大部分彼此连接起来，并且使表皮角质细胞和真皮成纤维细胞得以产生影响深远的交互作用。只有形成了正常的表皮基底膜，皮肤才具备了稳定性的基础。
目的：综述表皮基底膜的结构和功能及其对皮肤内稳态的重要影响，同时总结三维重组人体皮肤模型在表皮基底膜研究中的应用，为相关的皮肤病理学和生理学研究提供解决方案。
方法：以“skin”、“basement membrane”、“dermal epidermal junction”、 “skin equivalent”、“reconstructed skin”、“skin homeostasis”为关键词，使用PubMed数据库和Google学术搜索进行文献检索，检索时间范围为2000年1月至2016年9月的相关文献，并对检索结果进行筛选和排除，选择和本文研究目的高度相关的57篇文献进行综述。
结果与结论：①近年来的研究显示表皮基底膜的作用不仅限于结构上的功能，它同时还具有选择性透过屏障的功能，并参与调节细胞行为、信号传导的过程，是表皮完整性和皮肤维持内稳态的基础，表皮基底膜分子的异常表达会导致皮肤出现病理学或生理学变化；②随着皮肤组织工程的发展，体外重建皮肤模型能够与人体皮肤在结构和组分上达到很好的相似性，从而成为表皮基底膜研究的重要手段，并且可应用于皮肤抗衰老研究和大疱性疾病的治疗中。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0861-0279(蒋丹丹)

关键词: 表皮基底膜, 大疱性表皮松解症, 皮肤老化, 皮肤内稳态, 体外重建人体皮肤模型, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, skin tissue engineering technology has been well-developed and plays increasingly important roles in dermatology studies. The development of a functional epidermal basement membrane, also called dermal-epidermal junction, is one of the most sought after aspects of skin tissue engineering, and one of the hardest to recreate in vitro. At the dermal-epidermal junction level, dermal fibroblasts and epidermal keratinocytes interact to form an interlinked basement membrane of extracellular matrix, which forms as a concerted action of both keratinocytes and fibroblasts. Successful formation of this basement membrane is essential for the stability of human skin.
OBJECTIVE: To summarize the molecular organization and impact of epidermal basement membrane on skin homeostasis, and to review the applications of reconstructed human skin model in epidermal basement membrane studies, providing solutions for related dermato-pathological and physiological issues.
METHODS: A computer-based online search was performed in PubMed database and Google Scholar with the defined publication date ranging from 2000 until September 2016. The keywords were “skin, basement membrane, dermal epidermal junction, skin equivalent, reconstructed skin, skin homeostasis”. Finally 57 pertinent articles were screened out of the preliminary retrival list for further analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Epidermal basement membrane is shown to play gate-keeping roles, which controls cellular behavior and diffusion of bioactive molecules via outside-in signaling. It is the foundation of epidermal integrity and skin homeostasis. The abnormal expression of basement membrane molecules will lead to skin physiological changes and even skin diseases. In vitro reconstructed skin model, highly resembling the normal human skin in structure and molecular organization, is becoming a very powerful tool to study the physiology of epidermal basement membrane, and also very promising for skin anti-aging research and the treatment of blistering diseases caused by epidermal basement membrane disorders.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Skin, Artificial, Basilar Membrane, Review, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

蒋丹丹，Morgan Dos Santos. 三维重组人体皮肤模型在与表皮基底膜相关皮肤内稳态研究中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(4): 593-599.

Jiang Dan-dan, Morgan Dos Santos. Three-dimensional reconstructed human skin model: a powerful tool to study skin homeostasis and epidermal basement membrane morphogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(4): 593-599.

图/表（结果） 1

2.1 表皮基底膜的结构和分子组成表皮基底膜区域可分为4部分结构，图1为正常人皮肤组织中表皮基底膜的透射电镜图片，图中从表皮到真皮的方向依次是：与角质细胞紧紧相邻的胞膜层(plasma membrane)、透明层

(lamina lucida)、致密层(lamina densa)、以及连接真皮的网状层(lamina reticularis，或称致密下层)。

表皮基底膜的每一层都含有具备特定功能的胞外基质分子^[9]，如图2所示，胞膜层的主要成分是构成半桥粒(hemidesmosome)的蛋白，包括角蛋白(keratin)、Ie型大疱性类天疱疮抗原、网蛋白(plectin)、ⅩⅦ型胶原(也称Ⅱ型大疱性类天疱疮抗原)、整合素α6β4(α6β4 integrin)、CD151，其中ⅩⅦ型胶原和整合素α6β4是跨膜蛋白，也成为透明层的构成部分，桥接起胞膜层和透明层^[10]。近年来，多项研究认为胞膜层和透明层间的连接元件除了半桥粒，还有一种名为黏着斑(focal adhesion或focal contact)的蛋白复合体，成分包括整合素α2β1、整合素α3β1、ⅩⅢ型胶原和Ⅰ型黏着斑蛋白(Kindlin-1)等^[11]。黏着斑和基底层角质细胞内的肌动蛋白细胞骨架(actin cytoskeleton)相连，同时Ⅰ型黏着斑蛋白结合到整合素β1上^[12]，因为后者是跨膜结构，从而也起到了串联胞膜层和透明层的作用。Ozawa等^[13]还通过实验发现半桥粒和黏着斑在角质细胞贴附、迁移的过程中存在共调节和交互作用的现象。透明层是各种跨层

胞外基质组成的区域，紧随其下的致密层则是表皮基底膜的关键结构，其中包含了许多非常重要的胞外基质，如层粘连蛋白(laminins)家族、Ⅳ型胶原、基底膜蛋白聚糖和巢蛋白(nidogen)。Ⅳ型胶原分子间通过N端和C端的二硫键共价连接，从而自组装形成非常稳定的网状结构，表皮基底膜的抗机械性能主要得益于此。层粘连蛋白分子则多数可通过它们α、β、γ链N端的球状结构域非共价结合，形成松散的网络结构。基底膜蛋白聚糖和巢蛋白则负责把Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的网络结构桥接起来，使致密层的胞外基质组合成稳定有序的整体^[14]。Breitkreutz等^[9]和Vidal等^[15]分别在各自的著述中详细阐述了这些胞外基质的分子结构和组装的方式。层粘连蛋白同时还是跨层蛋白，如层粘连蛋白332跨层与整合素α6β4 或整合素α3β1相结合，从而起到连接透明层和致密层的作用^[16]。致密层下方的网状层主要由Ⅶ型胶原构成，Ⅶ型胶原的NC-1端伸入致密层中与层粘连蛋白332结合，使网状层和致密层锚定在一起^[15]。

综上所述，表皮基底膜内的各层结构由“角蛋白-网蛋白-Ie型大疱性类天疱疮抗原-整合素α6β4-层粘连蛋白332-Ⅶ型胶原”和“肌动蛋白-黏着斑-整合素α3β1-层粘连蛋白332-Ⅶ型胶原”这两条主要的胞外基质线索紧密联系在一起，维持了表皮基底膜的完整性。

近些年来随着研究的拓展和深入，更多基底膜分子的结构和功能不断被报道出来，如半桥粒中的CD151可通过与整合素α6β4的结合影响层粘连蛋白332，从而影响角质细胞的贴附、迁移和增殖^[17]；ⅩⅩⅢ型胶原能通过和整合素α2β1在胞膜层的结合促进角质细胞的贴附和铺展^[18]；踝蛋白(talin)、黏着斑激酶能对整合素β1产生作用促进黏着斑的形成等等^[11^，^19-20]。这些发现有助于完善对表皮基底膜结构和机制的认知，为皮肤内稳态研究提供更多的分子靶向。

2.2 表皮基底膜的病理学研究表皮基底膜胞外基质对皮肤内稳态的维持有重要的影响，单种胞外基质分子的缺失，如层粘连蛋白332或Ⅶ型胶原，就有可能造成表皮基底膜结构缺陷^[14^，^21-23]，导致大疱性疾病，临床表现为皮肤极度脆弱，轻微的摩擦或创伤就会引起皮层分离，同时导致水疱和疼痛的产生。

大疱性疾病总体分为两大类，一类是自体免疫类大疱疾病，例如由Ⅶ型胶原自身免疫抗体诱发的获得性表皮松解症，以及Ie型大疱性类天疱疮抗原或ⅩⅦ型胶原的自身免疫抗体诱发的类天疱疮^[24-26]。

另一类大疱性疾病则是遗传性的大疱性表皮松解症，是由于编码基底膜分子的基因缺陷所造成的先天性疾病^[27]。大疱性表皮松解症按照缺陷分子的定位不同和皮肤松解的不同位置又可分为4种类型：断裂在表皮基底层内的单纯型大疱性表皮松解症；断裂在透明层内的交界型大疱性表皮松解症；断裂在网状层的营养不良型大疱性表皮松解症；断裂位置混合型的Kindler综合征。Fine等^[28]2014年联合发布了这种分类和诊断的方法，并列举了每一种大疱性表皮松解症的亚型和对应的突变基因。

Has等^[29]和Hsu等^[30]分别总结了截至目前已有报道的针对遗传性大疱性疾病的临床试验，包括基因疗法、骨髓移植、多能干细胞疗法、蛋白补充以及药物疗法等，对患者的痛苦有一定程度地减轻，但是仍然没有可以彻底治愈的方法。

2.3 表皮基底膜与衰老对于非疾病个体，表皮基底膜一直处于动态的变化和平衡中以维持皮肤的内稳态，然而一些常见的生理现象也会对表皮基底膜产生影响，比如衰老。Zouboulis等^[31]总结了皮肤老化的形态学特征，不论是皮肤固有的程序性老化还是外源应激压力引起的老化，其中典型的一条表现就是表皮基底膜失去了波浪形结构而日渐扁平。Liao等^[32]采用活体谐波显微术定量测量不同年龄志愿者表皮基底膜带的结构差异，结果显示随着年龄增加，基底膜结构逐渐趋于平缓，真皮乳突结构减少，意味着基底膜逐渐失去了胞外基质的支持，结构和功能逐渐退化。Mondon等^[33]则进一步采用多种活体成像法和志愿者皮肤样本免疫组化分析法相结合，考察了不同年龄女性皮肤的生理结构和生化特征，结果发现年长女性的皮肤除了基底膜真皮乳突起伏程度减少了，各种胞外基质含量也显著减少了，如Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原、ⅩⅦ型胶原和巢蛋白1。Feru等^[34]也对32位年龄在30-70岁区间内的女性的皮肤样本做了免疫荧光染色、RT-PCR和ELISA等测试，证实随着年龄增长，基底膜中的Ⅳ型胶原显著减少。Fisher等^[35]比较了平均年龄35.8岁的年轻人和平均年龄81.9岁的老年人群组在皮肤伤口愈合过程中表皮基底膜的变化情况，结果年轻人皮肤伤口处的基底膜在4周后得到了完全恢复，而老年人皮肤伤口处的基底膜没有恢复好，甚至出现了结构异常，通过皮肤切片的免疫组化染色和皮肤组织样本的RT-PCR分析，发现老年人的皮肤伤口在恢复过程中，编码Ⅶ型胶原的COL7A2基因表达量没有相应地增加，因此无法支持基底膜的正常修复，这同时也是老龄化皮肤在受到摩擦应力时更容易发生擦伤的重要原因之一。

Dos Santos等^[36]采用38例年龄跨度为22-73岁的女性皮肤样本做分析，发现基底膜蛋白聚糖的天然表达量会随着年龄的增加而下降，该研究还采用年轻和老年女性来源的角质细胞分别构建三维重组人体皮肤模型，随后对模型进行的基底膜蛋白聚糖免疫组化分析也得到和正常人皮肤样本同样的年龄性差异，有趣的是当用老年细胞构建重组皮肤时，如果向培养液里添加基底膜蛋白聚糖，则重建出来的皮肤不论是组织结构还是各种增殖分化相关的生物标记分子水平都有了很大的改善，皮肤衰老相关的表征得到缓减，这显示着基底膜蛋白聚糖的补充对皮肤的自我修复有显著的促进作用。以上提及的那些随年龄增长而流失的表皮基底膜分子，如果表达量能得到提高的话，可能对皮肤的自我修复和更新会起到积极的调节作用^[37]。

2.4 体外重组皮肤模型在表皮基底膜研究中的应用随着细胞体外培养技术和生物相容性材料技术的日趋成熟，体外重组皮肤模型就逐渐成为皮肤内稳态研究的一项重要手段^[38-39]。在三维皮肤模型中，表皮角质细胞和真皮成纤维细胞在模拟人体自然条件的微环境下共培养，形成组分、结构和功能都近似于真实人体皮肤的组织工程皮肤。

如表1示例，采用马松三色染色法观察在体外重建的皮肤模型和正常人体皮肤样本的显微结构，染色结果显示，体外重建皮肤模型具有组织形态同样良好的真皮和表皮；在透射电镜下观察重建皮肤模型基底膜带的超微结构，可见到与正常人皮肤一样典型的半桥粒、胞膜层、透明层、致密层、网状层结构；通过皮肤组织的免疫荧光染色，可见重组皮肤模型也同样能正常表达基底膜分子，如表1中所展示的层粘连蛋白332免疫组化染色结果。

通过这种多方位的比较，体外重组皮肤模型展现出与人体皮肤的高度相似性，非常利于进行表皮基底膜分子的机制性和应用性研究，研究人员可根据与皮肤内稳态不同功能相关的分子靶标和调研方向对重组皮肤进行修饰，满足各种层次的研究需求^[40-41]，如表2所归纳的文献报道过的细分化皮肤模型类型，如基底膜分子缺陷模型、损伤皮肤模型、老化皮肤模型、疾病皮肤模型等。Nishiyama等^[42]利用重建的皮肤替代物研究层粘连蛋白332分子的功能机制，从而发现了层粘连蛋白332的存在是表皮基底膜组装过程的先决条件，对皮肤的修复和再生至关重要。Sher等^[8]利用携带基底膜蛋白聚糖反义cDNA序列的载体转染HaCaT细胞，并用此细胞株构建起基底膜蛋白聚糖缺失的皮肤模型，结果发现表皮层非常薄弱，无法呈现正常的组织结构，角质细胞凋亡率急剧升高，从而确认基底膜蛋白聚糖是表皮具有正常形态和分化功能的必要前提。

在与表皮基底膜相关的皮肤抗老化研究中，Dos Santos等^[43]采用年轻捐献者的角质细胞和成纤维细胞在体外构建起全层皮肤模型并培养了长达120 d，得到结构和功能近似于衰老皮肤的重组皮肤模型，与正常 42 d培养的重组皮肤模型相比，该替代物在透射电镜下呈现出超微结构极不规则的表皮基底膜。Dos Santos等^[36]在另一项研究中则使用老龄供体来源的皮肤细胞构建全皮模型，揭示出表皮基底膜分子在衰老模型中表达量的变化。Pageon等^[44-45]采用人工糖基化的胶原材料构建皮肤模型，模拟慢性老化皮肤，研究在此过程中各种基质分子的变化。以上研究中提及的各种体外重组衰老皮肤模型为研究表皮基底膜生理性退化导致的皮肤内稳态失衡提供了独特的检测手段。

借助于这些类型丰富的老化皮肤模型，研究者们能够开展以各种关键基底膜分子为靶标的精准调控，如Amano等^[46-47]在皮肤替代物的培养过程中使用基质金属蛋白酶抑制剂CGS27023A和基质金属蛋白酶抑制剂Ⅰ，显著地促进了层粘连蛋白332、Ⅳ型胶原和Ⅶ型胶原的产生，使该皮肤模型恢复了完整而连续的表皮基底膜结构。Iriyama等^[48]采用基质金属蛋白酶抑制剂和肝素酶抑制剂联合添加的方法使重组皮肤模型的表皮基底膜分子Ⅶ型胶原、ⅩⅦ型胶原和整合素β4能够正常表达，阻止了半桥粒、致密层和网状层锚定纤维结构的分解，改善了基底膜微环境。

Varkey等^[49]研究者采用浅层真皮成纤维细胞和角质细胞构建的组织工程皮肤具有良好的表皮基底膜结构，且有层粘连蛋白332、巢蛋白和Ⅶ型胶原的表达，Wojtowicz等^[50]构建的双层皮肤中成纤维细胞和角质细胞有良好的交互作用，基底膜带有Ⅳ型胶原表达，还包括一些与伤口愈合相关的细胞因子和生长因子，这些皮肤替代物在外科伤口敷料、皮肤创伤愈合方面显示出应用潜力。作为各种皮肤疾病中最严重的罕见病之一，遗传型大疱性表皮松解症一直没有很好的治疗方法，目前有研究者尝试把基因疗法与体外重组人体皮肤相结合治疗隐性营养不良型大疱性表皮松解症^[51]，该疾病的病因是编码Ⅶ型胶原的COL7A1基因缺陷，研究者使用含有COL7A1基因的自失活反转录病毒载体转导患者的原代成纤维细胞和角质细胞，然后构建COL7A1基因矫正的患者自体皮肤替代物，再移植回患者身上。该研究为欧盟第七框架计划261392号项目，旨在开展为期60个月的临床一期和二期研究，期望对隐性营养不良型大疱性表皮松解症的治疗能取得突破。Hirsch等^[52]新近发表了一个由LAMB3内含子14纯合子受体剪接位点突变导致的交界型大疱性表皮松解症病例，该病患的皮肤无法表达层粘连蛋白332，因此不具有正常的表皮基底膜，导致占全身表面积60%的表皮丢失，危及生命。研究者们提取患者来源的角质细胞进行培养，并采用逆转录病毒载体转染使细胞正常表达LAMB3基因，之后用基因修饰的角质细胞构建表皮替代物，移植回患者的创伤部位。患者在术后21个月里，再生的表皮紧密附着于真皮之上，恢复了正常的基底膜结构，皮肤状况保持稳定。该报道为基因修饰与重组皮肤相结合疗法展示了良好的应用前景。

参考文献

[1] Ko MS, Marinkovich MP. Role of dermal-epidermal basement membrane zone in skin, cancer, and developmental disorders. Dermatol Clin. 2010;28(1):1-16.

[2] Martins VL, Vyas JJ, Chen M, et al. Increased invasive behaviour in cutaneous squamous cell carcinoma with loss of basement-membrane type VII collagen. J Cell Sci. 2009; 122(Pt 11):1788-1799.

[3] Hagedorn EJ, Sherwood DR. Cell invasion through basement membrane the anchor cell breaches the barrier. Curr Opin Cell Biol. 2011;23(5):589-596.

[4] Whitelock JM, Melrose J, Iozzo RV. Diverse cell signaling events modulated by perlecan. Biochemistry. 2008; 47(43): 11174-11183.

[5] Löffek S, Hurskainen T, Jackow J, et al. Transmembrane collagen XVII modulates integrin dependent keratinocyte migration via PI3K/Rac1 signaling. PloS One. 2014; 9(2): e87263.

[6] Yurchenco PD. Basement membranes: cell scaffoldings and signaling platforms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011;3(2). pii: a004911.

[7] Kruegel J, Miosge N. Basement membrane components are key players in specialized extracellular matrices. Cell Mol Life Sci. 2010;67(17):2879-2895.

[8] Sher I, Zisman-Rozen S, Eliahu L, et al. Targeting perlecan in human keratinocytes reveals novel roles for perlecan in epidermal formation. J Biol Chem. 2006; 281(8):5178-5187.

[9] Breitkreutz D, Koxholt I, Thiemann K, et al. Skin Basement Membrane: The Foundation of Epidermal Integrity—BM Functions and Diverse Roles of Bridging Molecules Nidogen and Perlecan. Biomed Res Int. 2013;2013:179784.

[10] Chaudhari PR, Vaidya MM. Versatile hemidesmosomal linker proteins: structure and function. Histol Histopathol. 2015; 30(4):425-434.

[11] Winograd-Katz SE, Fässler R, Geiger B, et al. The integrin adhesome: from genes and proteins to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol; 2014; 15(4):273-288.

[12] Rognoni E, Ruppert R, Fässler R. The kindlin family: functions, signaling properties and implications for human disease. J Cell Sci. 2016; 129(1):17-27.

[13] Ozawa T, Tsuruta D, Jones JC, et al. Dynamic relationship of focal contacts and hemidesmosome protein complexes in live cells. J Invest Dermatol. 2010; 130(6):1624-1635.

[14] Hohenester E, Yurchenco PD. Laminins in basement membrane assembly. Cell Adh Migr. 2013; 7(1):56-63.

[15] Vidal EM. The Basement Membrane Zone: Making the Connection. 2013. https://www.aad.org/File%20Library/ Main%20navigation/Education/Basement%20Membrane%20Zone/The-Basement-Membrane-Zone--Textbook--pdf.pdf

[16] Turcan I, Jonkman MF. Blistering disease: insight from the hemidesmosome and other components of the dermal-epidermal junction. Cell Tissue Res. 2015; 360(3):545-569.

[17] Geary SM, Cowin AJ, Copeland B, et al. The role of the tetraspanin CD151 in primary keratinocyte and fibroblast functions: implications for wound healing. Exp Cell Res. 2008; 314(11-12):2165-2175.

[18] Veit G, Zwolanek D, Eckes B, et al. Collagen XXIII, novel ligand for integrin alpha2beta1 in the epidermis. J Biol Chem. 2011; 286(31):27804-27813.

[19] Truong T, Shams H, Mofrad MR. Mechanisms of integrin and filamin binding and their interplay withCollagen XXIII, novel ligand for integrin alpha2beta1 in the epidermis talin during early focal adhesion formation. Integr Biol (Camb). 2015; 7(10):1285-1296.

[20] Nader GP, Ezratty EJ, Gundersen GG. FAK, talin and PIPKIγ regulate endocytosed integrin activation to polarize focal adhesion assembly. Nat Cell Biol. 2016; 18(5):491-503.

[21] Nyström A, Velati D, Mittapalli VR, et al. Collagen VII plays a dual role in wound healing. J Clin Invest. 2013; 123(8): 3498-3509.

[22] Bruckner-Tuderman L, Has C. Disorders of the cutaneous basement membrane zone—The paradigm of epidermolysis bullosa. Matrix Biol. 2014;33:29-34.

[23] Has C, Nyström A. Epidermal basement membrane in health and disease. Curr Top Membr. 2015; 76:117-170.

[24] Kasperkiewicz M, Sadik CD, Bieber K, et al. Epidermolysis Bullosa Acquisita: From Pathophysiology to Novel Therapeutic Options. J Invest Dermatol. 2016; 136(1):24-33.

[25] Nishie W. Update on the pathogenesis of bullous pemphigoid: an autoantibody-mediated blistering disease targeting collagen XVII. J Dermatol Sci. 2014; 73(3):179-186.

[26] Yamase A, Kono T, Ishii N, et al. An autoimmune bullous dermatosis with clinical, histopathological, and immunological features of bullous pemphigoid and epidermolysis bullosa acquisita in an adult. Br J Dermatol. 2016.

[27] Masunaga T. Epidermal basement membrane, its molecular organization and blistering disorders. Connect Tissue Res. 2006;47(2):55-66.

[28] Fine JD, Bruckner-Tuderman L, Eady RA, et al. Inherited epidermolysis bullosa: updated recommendations on diagnosis and classification. J Am Acad Dermatol. 2014; 70(6):1103-1126.

[29] Has C, Kiritsi D. Therapies for inherited skin fragility disorders. Exp Dermatol. 2015; 24(5):325-331.

[30] Hsu CK, Wang SP, Lee JY, et al. Treatment of hereditary epidermolysis bullosa: updates and future prospects. Am J Clin Dermatol. 2014;15(1):1-6.

[31] Zouboulis CC, Makrantonaki E. Clinical aspects and molecular diagnostics of skin aging. Clin Dermatol. 2011; 29(1):3-14.

[32] Liao YH, Kuo WC, Chou SY, et al. Quantitative analysis of intrinsic skin aging in dermal papillae by in vivo harmonic generation microscopy. Biomed Opt Express. 2014; 5(9): 3266-3279.

[33] Mondon P, Hillion M, Peschard O, et al. Evaluation of dermal extracellular matrix and epidermal-dermal junction modifications using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging, in vivo reflectance confocal microscopy, echography, and histology: effect of age and peptide applications. J Cosmet Dermatol. 2015; 14(2): 152-160.

[34] Feru J, Delobbe E, Ramont L, et al. Aging decreases collagen IV expression in vivo in the dermo-epidermal junction and in vitro in dermal fibroblasts: possible involvement of TGF-β1. Eur J Dermatol. 2016;26(4):350-360.

[35] Fisher G, Rittié L. Restoration of the basement membrane after wounding: a hallmark of young human skin altered with aging. J Cell Commun Signal. 2017.

[36] Dos Santos M, Michopoulou A, André-Frei V, et al. Perlecan expression influences the keratin 15-positive cell population fate in the epidermis of aging skin. Aging (Albany NY). 2016; 8(4):751-768.

[37] Tsunenaga M. Heparanase inhibitors facilitate the assembly of the basement membrane in artificial skin. Curr Tissue Eng. 2016; 5(2):113-122.

[38] Nicholas MN, Jeschke MG, Amini-Nik S. Methodologies in creating skin substitutes. Cell Mol Life Sci. 2016; 73(18): 3453-3472.

[39] Nyame TT, Chiang HA, Leavitt T, et al. Tissue-Engineered Skin Substitutes. Plast Reconstr Surg. 2015;136(6): 1379-1388.

[40] Schlotmann K, Kaeten M, Black AF, et al. Cosmetic efficacy claims in vitro using a three-dimensional human skin model. Int J Cosmet Sci. 2001;23(5):309-318.

[41] Auxenfans C, Fradette J, Lequeux C, et al. Evolution of three dimensional skin equivalent models reconstructed in vitro by tissue engineering. Eur J Dermatol. 2009;19(2):107-113.

[42] Nishiyama T, Amano S, Tsunenaga M, et al. The importance of laminin 5 in the dermal-epidermal basement membrane. J Dermatol Sci. 2000;24 Suppl 1:S51-59.

[43] Dos Santos M, Metral E, Boher A, et al. In vitro 3-D model based on extending time of culture for studying chronological epidermis aging. Matrix Biol. 2015; 47:85-97.

[44] Pageon H, Bakala H, Monnier VM, et al. Collagen glycation triggers the formation of aged skin in vitro. Eur J Dermatol. 2007;17(1):12-20.

[45] Pageon H, Técher MP, Asselineau D. Reconstructed skin modified by glycation of the dermal equivalent as a model for skin aging and its potential use to evaluate anti-glycation molecules. Exp Gerontol. 2008;43(6):584-588.

[46] Amano S, Akutsu N, Matsunaga Y, et al. Importance of balance between extracellular matrix synthesis and degradation in basement membrane formation. Exp Cell Res. 2001;271(2):249-262.

[47] Amano S, Ogura Y, Akutsu N, et al. Protective effect of matrix metalloproteinase inhibitors against epidermal basement membrane damage: skin equivalents partially mimic photoageing process. Br J Dermatol. 2005; 153 Suppl 2: 37-46.

[48] Iriyama S, Tsunenaga M, Amano S. Key role of heparan sulfate chains in assembly of anchoring complex at the dermal-epidermal junction. Exp Dermatol. 2011; 20(11): 953-955.

[49] Varkey M, Ding J, Tredget EE. Superficial dermal fibroblasts enhance basement membrane and epidermal barrier formation in tissue-engineered skin: implications for treatment of skin basement membrane disorders. Tissue Eng Part A. 2014; 20(3-4):540-552.

[50] Wojtowicz AM, Oliveira S, Carlson MW, et al. The importance of both fibroblasts and keratinocytes in a bilayered living cellular construct used in wound healing. Wound Repair Regen. 2014; 22(2):246-255.

[51] Phase I/II ex vivo gene therapy clinical trial for recessive dystrophic epidermolysis bullosa using skin equivalent grafts genetically corrected with a COL7A1-encoding SIN retroviral vector (GENEGRAFT). Hum Gene Ther Clin Dev. 2014; 25(2):65-66.

[52] Hirsch T, Rothoeft T, Teig N, et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 2017; 551(7680):327-332.

[53] Bernerd F, Asselineau D. An organotypic model of skin to study photodamage and photoprotection in vitro. J Am Acad Dermatol. 2008; 58(5 Suppl 2):S155-159.

[54] Bernerd F. Human skin reconstructed in vitro as a model to study the keratinocyte, the fibroblast and their interactions: photodamage and repair processes. J Soc Biol. 2005; 199(4):313-320.

[55] Ponec M, Kempenaar J. Use of human skin recombinants as an in vitro model for testing the irritation potential of cutaneous irritants. Skin Pharmacol. 1995; 8(1-2):49-59.

[56] Dickson MA, Hahn WC, Ino Y, et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Mol Cell Biol. 2000; 20(4):1436-1447.

[57] Reijnders CM, van Lier A, Roffel S, et al. Development of a full-thickness human skin equivalent in vitro model derived from TERT-immortalized keratinocytes and fibroblasts. Tissue Eng Part A. 2015; 21(17-18):2448-2459.

引言

皮肤是人体最大的器官，作为机体的第一道防线，它保护人体内部的组织器官不会轻易受到外界刺激因素的侵袭。人体的皮肤内稳态和机体健康程度息息相关，它指皮肤能较好地独立于外部环境的变化因素，保持自身内环境始终处于生长和分化的动态平衡中。

皮肤的结构主要分为真皮、表皮和皮下组织，真皮是质地厚实的结缔组织，富含胶原蛋白等胞外基质，其中包裹着成纤维细胞、毛细血管细胞、毛细淋巴管细胞、肥大细胞、免疫细胞等类型丰富的细胞，真皮为位于其上的表皮提供机械支撑和传送营养；而表皮则是主要由角质细胞、黑色素细胞、朗格汉斯细胞和梅克尔细胞构成的多层鳞状上皮组织。位于真皮表皮这两个形态特性迥异的部分之间的区域称为真皮-表皮连接处。真皮-表皮连接处的本质是许多有序组合的胞外基质，因形似一条狭长的薄膜且紧邻表皮的基底层(stratum germinativium)，因此也被称为表皮基底膜(epidermal basement membrane)。

30多年前，表皮基底膜仍然被认为仅仅是连接真皮和表皮、为表皮细胞提供支架的简单膜状结构，之后随着组织显微、免疫组化、基因修饰等技术的发展，研究者们有了更加丰富而精确的手段来研究表皮基底膜的生理特性，尤其是皮肤组织工程技术的快速发展，研究者们能够体外构建含有表皮基底膜的人体全层皮肤模型，借此大大便利了表皮基底膜的分子功能和形态发生研究。得益于这些工具，近十多年来研究者们发现表皮基底膜还具有许多其它功能，例如它是皮肤的选择性渗透屏障，确保真皮表皮间的物质交换，阻止炎症细胞或肿瘤细胞的入侵和迁移^[1-3]；另外表皮基底膜的一些胞外基质还可以结合细胞因子和蛋白受体，从而参与重要的信号转导和调控过程^[4-6]，影响细胞的增殖和迁移^[7]，进而影响皮肤的形态发生、自我更新和自我修复功能^[8]。表皮基底膜分子缺陷则会导致皮肤失去内稳态，产生生理学变化甚至皮肤疾病，三维重组皮肤模型则提供了研究皮肤内稳态失衡机制的工具和探索治疗方案的手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

讨论

皮肤组学的传统研究通常聚焦在真皮和表皮两大主要部分，表皮基底膜作为真皮和表皮的连接部位，以往被认为只具有单纯的结构功能。近年来随着表皮基底膜相关研究的深入开展，表皮基底膜的分子组成和功能被发现与皮肤内稳态有着密不可分的联系。表皮基底膜紊乱不但影响皮肤的结构和自我修复，甚至还会导致严重的皮肤疾病；对于非疾病个体，一些常见的生理现象也会对表皮基底膜产生影响，如衰老的过程就会导致表皮基底膜结构的退化，而一些关键性基底膜分子表达量的下降又会反过来加剧皮肤的衰老、破坏自我修复的进程。

在表皮基底膜的研究中，体外重组人体皮肤模型具有巨大的应用潜力^[53-57]。在皮肤抗老化研究领域，有多种方式模拟构建老龄化皮肤模型，如利用老年捐献者来源的皮肤细胞做种子细胞，或构建基底膜分子缺陷的皮肤模型，或者采用正常皮肤细胞超长期培养的方式实现衰老化模型。已有的体外重组皮肤模型研究显示，如果使与抗衰老高度相关的表皮基底膜分子表达量得到上调，则可以对老化皮肤的结构和功能产生一定的修复作用，为将来的皮肤抗老化研究提供了重要的启示。

针对表皮基底膜相关疾病的治疗，自体免疫类大疱疾病的患者通过结合组织工程皮肤技术的免疫疗法或基因治疗，病情可得到一定程度的缓解，遗传性的大疱性表皮松解症也受益于皮肤替代物和移植疗法，目前实现了一定突破，但总体而言仍没有彻底治愈的办法，这将继续成为未来体外重组皮肤模型在表皮基底膜的研究中最需要解决的问题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程