[1]	张同同, 王中华, 文 杰, 宋玉鑫, 刘 林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张 婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王 峰, 李 佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭 锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[5]	常文辽, 赵 杰, 孙晓亮, 王 锟, 吴国锋, 周 剑, 李树祥, 孙 晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[6]	刘 旒, 周箐竹, 龚 桌, 刘博言, 杨 斌, 赵 娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[7]	刘 飞, 崔宇韬, 刘 贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[8]	李晓壮, 段 浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何 飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[9]	张振坤, 李 喆, 李 亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[10]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[11]	邢 浩, 张永红, 王 栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[12]	陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张 磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.
[13]	刘 鋆, 杨 龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴 颖, 卢 涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶 川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[14]	王 皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李 获, 黄 波, 田广招, 刘舒云, 眭 翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[15]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈 亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.

阴道是女性重要生殖器官，由于先天性疾病或后天损伤、肿瘤等原因造成的部分或全部缺失，需要进行修复和再造。应用各种自体或异体组织进行阴道修复时，不但会造成新的损伤，而且术后可能出现再造阴道挛缩、分泌物过多及异味等现象，另外再造的阴道在组织学、形态学和功能方面都与正常阴道组织有很大差异^[1-2] 。倘若能利用患者自身的少量细胞，通过组织工程技术“再造”出接近自然的阴道组织，再覆盖阴道穴腔，则无疑是一种新型的、理想的阴道成形术。2003年，De Filippo等^[3]将阴道上皮细胞和平滑肌细胞种植于包被有50︰50异量分子聚合物(左旋和右旋的内交脂和乙醇酸交脂聚合物)的聚乙醇酸支架上成功地构建了组织工程阴道组织，种植于其上的阴道上皮细胞和阴道平滑肌细胞生长增殖良好。但聚乙醇酸材料在免疫原性、抗微生物原性、能促进组织再生等特性与天然支架材料相比还有一定的差距。
小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)基质作为天然细胞外基质类生物衍生材料，是自猪小肠解剖出其黏膜下层经处理后获得富含胶原的生物材料，具有无免疫原性、抗微生物原性、能促进细胞再生、提供细胞生存和铺展的三维空间，利于细胞新陈代谢等特性^[4] ，在实验和临床工作中已被较多用于血管、膀胱、神经及腹壁等组织缺损的修复^[5-8] ，显示出良好的组织相容性。Rotariu等^[9]用猪SIS修复兔长达2.5 cm尿道缺损，观察到SIS能促进尿道上皮的再生，组织学检查见基质中新生的尿道组织层几乎与正常无差别。Gabouev等^[10]将膀胱上皮细胞和膀胱平滑肌细胞种植在SIS上，免疫组化显示形成了膀胱上皮和膀胱平滑肌细胞双层结构，成功地制成了组织工程化膀胱。本实验制备无细胞成分的SIS细胞基质，将培养扩增阴道平滑肌细胞种植于SIS上，体外复合培养观察细胞在该材料上黏附、增殖、侵入情况，以探讨猪SIS用作组织工程学阴道平滑肌细胞载体的可行性，为研制无细胞基质组织工程学阴道奠定基础。

3.1  SIS作为阴道平滑肌细胞载体的相关研究
SIS的制备：天然的细胞外基质材料是将天然组织进行脱细胞处理后获得的，最早尝试利用脱细胞技术获得细胞外基质的是Grillo等^[16] ，他们在1964年对皮肤组织进行脱细胞处理，获得细胞外基质，常用的脱细胞方法有物理法和化学法^[17] ，物理的方法包括搅拌、超声降解、机械挤压、反复冻融等，这些方法能使细胞膜破碎，细胞内容物释放，有利于接下来的化学漂洗和去除细胞外基质细胞成分，但是这些方法一般不能完全脱掉细胞外基质中的细胞成分，需结合化学方法。化学方法有渗透液法、生物酶消化法、去污剂洗涤法等。SIS一般由猪空肠制备，根据猪空肠特点，采用改良的Abraham方法制备^[12] ，将新鲜猪空肠反复用清水冲洗，机械方法去除外面的浆膜层和肌层，翻转后，去除黏膜层。高渗盐液浸泡彻底去除材料中的残留细胞^[18] 。这种方法是通过渗透压的变化致使细胞膜破裂来达到脱细胞的目的。但在浸泡的所有过程均是在持续搅拌下进行的，这样一方面可以使细胞裂解并清除细胞碎片，但主要是使细胞充分暴露在高渗液中，有利于细胞成分去除。作者在Abraham方法中增加了生物酶消化、戊二醛交联保护等步骤，使脱细胞更充分。酶消化法包括使用蛋白酶、核酸酶等各种外源性的酶来破坏组织中的细胞膜和细胞器结构，使细胞与基质分离产生脱细胞的作用。胰蛋白酶是脱细胞过程中最常用的一种裂解酶，它可以高度特异的在赖氨酸和精氨酸残基羧基侧水解肽腱。需要注意的是胰蛋白酶在消化细胞成分的同时会降解基质，破坏胶原基质的结构^[19] ，因此需要注意胰蛋白酶的浓度和消化时间。作者采用0.4%的浓度和5.0~6.0 h的消化时间，EDTA主要作用在于能够和二价离子如Ca ²⁺ 、Mg ²⁺等结合，促使细胞自组织中分离，而对胶原基质无损伤。不同的组织需要不同浓度的EDTA消化，实验针对猪空肠结构特点采用了0.5 mmol/L的EDTA消化，达到了既充分地脱细胞，又保护了胶原基质的效果。最后使用了DNA酶，它可以催化核酸水解，消除小肠基质内的核酸成分。
SIS制备后的灭菌：对所有动物来源的生物材料来说，一个潜在的问题是他们能携带危险的病原菌。尽管用极端的pH或湿度可以摧毁许多致病因子，但是仍有一些致病因子如脘病毒对化学或物理降解具有极端的抵抗力。为避免人畜共患疾病的传染，通常用过氧乙酸消毒，0.1%过氧乙酸(含体积分数为20%无水乙醇)浸泡8 h可达到完全消毒作用。Hodde等^[20]研究证实用此消毒液处理猪小肠和SIS，并测定荚膜病毒、无荚膜病毒，包括猪细小病毒、猪呼吸道肠道病毒、鼠白血病反转录酶病毒和猪伪狂犬病毒，证明荚膜病毒易于除去，5 min即可灭活，处理30 min后，所有病毒均被灭活。经消毒、灭菌处后，要求将SIS中的微生物总量降到每个标本 100 cfu以下，内毒素降到每个标本20 EU以下。
SIS制备后贮存：制备的SIS灭菌后可短期储存于PBS 溶液中4 ℃冷藏，如需要长期储存，先要程序性降温到-80 ℃，冻干、干燥后三层真空包装，再用2.5×10-5 Gy γ射线照射消毒^[21] ，储存于4 ℃备用。但是本实验只行短期贮存，因此没用γ射线照射消毒。
实验采用真空包装的目的主要是除氧，以有利于防止SIS变质，其原理也比较简单，因SIS霉腐变质主要由微生物的活动造成而大多数微生物的生存是需要氧气的，而真空包装就是运用这个原理，把包装袋内和SIS内的氧气抽掉，使微生物失去“生存的环境”。实验证明：当包装袋内的氧气体积分数≤1%时，微生物的生长和繁殖速度就急剧下降，氧气体积分数≤0.5%时，大多数微生物将受到抑制而停止繁殖。真空包装不能完全抑制厌氧菌的繁殖和酶反应引起的变质和变色，因此还需与其他辅助方法结合，如采用冷藏、速冻、γ射线照射消毒等。真空除氧除了抑制微生物的生长和繁殖外，另一个重要功能是防止SIS氧化。
3.2  平滑肌细胞-SIS体外联合培养
平滑肌细胞接种时机：体外构建组织工程阴道,种子细胞接种到三维支架材料上是关键和核心步骤，细胞接种对于支架材料中起始细胞量、细胞在支架内的立体分布以及随后细胞增殖分化，迁移和组织形成等方面都有重要影响^[22] 。因此组织工程细胞接种要求比较高，首先要保证较高的接种率，使种子细胞得到最大程度的利用；其次要求有较高的动力学速度，使种子细胞具有充分的活力；最后要使贴壁细胞高密度和均匀的分布，以加快组织再生的速度和提高组织的均一性。所以优化细胞接种方式和接种条件对于体外成功构建组织是必需的。实验显示在细胞达80%融合也可进行传代，这时将细胞移植到SIS上培养，这是因为在原代培养时细胞生长往往不均匀，经常是一些区域已长成致密细胞层，而另一些区域仍未见细胞生长，在这种情况下，当整瓶细胞达完全融合时，致密细胞层已“老化”，功能状态衰退^[23] 。因此，此时即进行传代培养，可以避免局部细胞“老化”、活性降低，影响平滑肌细胞在SIS上培养成功率。
平滑肌细胞接种密度：由于实验条件的限制，采用了传统的静态接种方式进行细胞接种。由于静态接种时，细胞悬液静置于材料表面，部分细胞随着液体向材料内部扩散而进入材料内部，但是这种被动的内向运动是有限的，大多数细胞在重力作用下仍堆积在材料表面导致材料表面有大量的细胞黏附，内部侧较少。实验过程发现，由于静态接种时接种悬液体积只有几毫升，要得到较高的接种密度，只有提高悬液的密度，而高的细胞悬液密度容易导致细胞成团，造成孔隙堵塞，影响细胞进入材料内部，同时由于材料表面的细胞结合位点有限，很多细胞仅是松散地停留在表面，当加入培养基时这部分细胞极易离开材料进入培养基，因此接种率随着接种密度的增加而降低。充分考虑这两方面的原因，如果接种密度太低，进入材料内部的细胞很少则接种率低，如果接种密度太高，接种率也会降低，因此要找到一个最佳的接种密度，才能达到最大接种率。作者经过实验筛选，选择了5.0×10⁶/cm²的接种密度，通过病理切片检查，结果较为理想。
3.3  SIS用作阴道平滑肌细胞载体的实验结果分析   经过物理和化学方法处理后所得到的无细胞基质需要验证是否有细胞成分的残留，有很多的方法可以达到这一目的。标准的苏木精-伊红组织学染色是观察组织内是否有残留细胞物质的一线方法。光镜下，SIS基质材料由许多排列规则而紧密连接成网状的胶原纤维组成，苏木精-伊红染色呈红色，内部没有发现细胞碎片。表明SIS抗原性弱，能够运用于组织的移植修复。同时SIS保持了良好的机械强度，适合作阴道组织工程构建的支架材料。
种子细胞的体外培养和扩增是组织工程的另一项关键技术。阴道缺损修复常用的种子细胞包括阴道自体平滑肌细胞和阴道黏膜上皮细胞。阴道作为生殖器官必须具备正常的收缩和舒张功能，而这些都依赖于正常阴道平滑肌细胞来完成，因此阴道平滑肌细胞体外培养和扩增是组织工程阴道重建的重要基础。组织工程器官修复需要体外细胞的培养和扩增，大量有活力的种子细胞是保证器官良好再生的基本条件。本研究体外培养发现阴道平滑肌细胞在原代培养以后能够快速传代，适合作为种子细胞在体外大量增殖。培养细胞在倒置显微镜下观察，细胞呈梭形或多角形，融合时部分区域细胞出现平滑肌细胞特征性生长表现“峰-谷”状结构，符合平滑肌细胞生长形态。同时阴道平滑肌在SIS上接种后生长良好，通过动态的苏木精-伊红染色观察显示阴道平滑肌细胞在该材料上增殖并向材料的中间部位侵入。免疫组化鉴定接种在支架上的阴道平滑肌细胞Smooth Muscle α-actin 表达阳性, 细胞质内a-肌动蛋白是组成平滑肌细胞骨架的必要成分，是平滑肌细胞主要的结构蛋白，为鉴定平滑肌细胞特异性的表达蛋白[24]。本实验所培养的细胞采用a-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。证明了接种在SIS 材料上的平滑肌细胞表形未见改变，仍能表达出代表正常平滑肌细胞收缩性的细胞骨架蛋白，且能在SIS上黏附、生长、扩增。表现出平滑肌细胞与SIS之间相容性良好。从结果来看脱细胞的SIS为阴道平滑肌细胞提供了附着点，其孔隙结构允许并可满足细胞代谢及营养物质出入的要求，另外SIS还含有多种生长因子，因此平滑肌细胞能在SIS上黏附、生长、增殖，且不破坏细胞的形态和组织结构。
3.4  实验体系为阴道组织工程研究提供天然的生物支架材料   本实验利用猪SIS作为阴道平滑肌细胞生长的载体，以观察体外培养后的平滑肌细胞在载体上，能否维持其固有生物学特性和功能，以及细胞-SIS复合物能否向预定组织结构分化和演变。经苏木精-伊红染色和免疫组化染色测定a- Actin，观察到体外培养后的平滑肌细胞移植于SIS后，在猪SIS的支撑作用下，细胞仍然有a-肌动蛋白的表达，并且能够分化成层，维持了平滑肌细胞的结构特点。这些现象清楚地表明SIS的表面活性适合细胞的黏附、生长，其孔隙结构允许并可满足细胞代谢及营养物质出入的要求。
结论：体外培养的平滑肌细胞在SIS种植后，经形态学及免疫组化检测，平滑肌细胞能够在SIS上贴附、分化及增殖，表明SIS的细胞相容性良好，不影响平滑肌细胞的形态，对细胞生长和功能表达也未见明显抑制作用，且来源丰富，价格低廉。故SIS可用作阴道组织工程材料是可行的，同时为阴道组织工程支架材料提供实验模型。

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