加味阳和汤含药血清抑制过氧化氢诱导成骨细胞的氧化损伤

doi:10.12307/2026.476

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (33): 8583-8590.doi: 10.12307/2026.476

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

加味阳和汤含药血清抑制过氧化氢诱导成骨细胞的氧化损伤

吴凡1，2，杨文龙2，刘江源2，夏汉庭2，曾志奎2，杨凤云2

1江西中医药大学，江西省南昌市 330004；2江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330006

收稿日期:2025-10-29 修回日期:2026-03-20 出版日期:2026-11-28 发布日期:2026-06-08
通讯作者: 杨凤云，主任中医师，江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330006
作者简介:吴凡，男，1991年生，2025年江西中医药大学毕业，博士，副主任中医师，主要从事儿童骨科先天性和发育性疾病以及四肢骨折研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82260946)，项目负责人：夏汉庭；江西省自然科学基金项目(20232BAB216116)，项目负责人：杨文龙；江西省科技厅临床医学研究中心建设项目(20212BCG74004)，项目负责人：杨凤云；全国名老中医药专家传承工作室建设项目(国中医药人教函[2022]75号)，项目负责人：杨凤云

Jiawei Yanghe Decoction-containing serum attenuates hydrogen peroxide-induced oxidative damage in osteoblasts

Wu Fan1, 2, Yang Wenlong2, Liu Jiangyuan2, Xia Hanting2, Zeng Zhikui2, Yang Fengyun2

1Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; 2The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Received:2025-10-29 Revised:2026-03-20 Online:2026-11-28 Published:2026-06-08
Contact: Yang Fengyun, Chief physician, The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Wu Fan, PhD, Associate chief physician, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82260946 (to XHT); Natural Science Foundation of Jiangxi Province, 20232BAB216116 (to YWL); Jiangxi Provincial Department of Science and Technology Clinical Research Center Construction Project, No. 20212BCG74004 (to YFY); National Project for Establishing Inheritance Studios of Renowned Senior Traditional Chinese Medicine Experts, No. [2022] 75 (to YFY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡，导致过量活性氧积累，引发细胞损伤状态，诱导线粒体功能障碍，同时降低细胞周期蛋白表达，阻滞细胞生长，削弱骨形成能力，破坏骨稳态。
成骨分化：是指骨髓间充质干/基质细胞向成骨细胞转变的过程，对骨形成、发育和修复至关重要。MC3T3-E1细胞是小鼠颅顶骨来源的成骨前体细胞系，是研究成骨分化的经典模型。在含抗坏血酸、β-甘油磷酸钠等诱导剂的作用下，MC3T3-E1细胞能增殖分化，表达碱性磷酸酶、骨钙素等标志蛋白，最终形成矿化结节，模拟体内骨生成。

背景：激活核因子E2相关因子2可能是成骨细胞抗氧化应激和预防骨质疏松症的有效策略。
目的：探究加味阳和汤含药血清对过氧化氢诱导成骨细胞损伤的保护作用及机制。
方法：将小鼠成骨细胞系MC3T3-E1分为5组：对照组、模型组、加味阳和汤含药血清低、中、高剂量组。对照组细胞常规培养，模型组采用过氧化氢处理建立成骨细胞氧化应激损伤模型，加味阳和汤低、中、高剂量组在模型组基础上分别加入终体积分数为5%，10%，15%加味阳和汤含药血清干预24 h，分别检测细胞状态、成骨功能、氧化应激水平、炎症反应、核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路蛋白表达水平。
结果与结论：与对照组比较，模型组细胞活力、碱性磷酸酶活性、成骨矿化能力、抗氧化酶活性和核因子E2相关因子2、血红素加氧酶1蛋白表达水平均显著降低，细胞凋亡率、活性氧和炎症因子白细胞介素6、白细胞介素1β水平均显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，加味阳和汤含药血清组细胞上述指标均有不同程度改善(P < 0.05)。结果表明，加味阳和汤含药血清可通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1抗氧化信号通路，从而恢复MC3T3-E1细胞活力和骨形成功能，减轻氧化应激损伤。
https://orcid.org/0009-0003-2469-4836 (吴凡)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 加味阳和汤, MC3T3-E1细胞, 成骨细胞, 核因子E2相关因子2, 血红素加氧酶1, 成骨分化, 氧化应激, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Activation of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 may be an effective strategy for antioxidant stress in osteoblasts and prevention of osteoporosis.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect and mechanism of Jiawei Yanghe Decoction-containing serum on hydrogen peroxide-induced osteoblast injury.
METHODS: The mouse osteoblast cell line MC3T3-E1 was divided into five groups: control group, model group, and low-, medium-, and high-dose Jiawei Yanghe Decoction-containing serum groups. Cells in the control group were routinely cultured. Cells in the model group were treated with hydrogen peroxide to establish an oxidative stress injury model of osteoblasts. Cells in the low-, medium-, and high-dose Jiawei Yanghe Decoction-containing serum groups were treated with final volume fractions of 5%, 10%, and 15% Jiawei Yanghe Decoction-containing serum for 24 hours based on the model group. Cell status, osteogenic function, oxidative stress level, inflammatory response, and protein expression related to the nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase 1 signaling pathway were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the model group showed significantly decreased cell viability, alkaline phosphatase activity, osteogenic mineralization capacity, antioxidant enzyme activities, and protein expression levels of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 and heme oxygenase 1, and significantly increased apoptosis rate, reactive oxygen species levels, and levels of the inflammatory factors interleukin-6 and interleukin-1β (P < 0.05). Compared with the model group, the Jiawei Yanghe Decoction-containing serum groups showed varying degrees of improvement in the above indicators (P < 0.05). These findings indicate that Jiawei Yanghe Decoction-containing serum can restore the viability and bone formation function of MC3T3-E1 cells and alleviate oxidative stress injury by activating the nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase 1 antioxidant signaling pathway.

Key words: Jiawei Yanghe Decoction, MC3T3-E1 cell, osteoblast, nuclear factor erythroid 2-related factor 2, heme oxygenase 1, osteogenic differentiation, oxidative stress, apoptosis

中图分类号:

吴凡, 杨文龙, 刘江源, 夏汉庭, 曾志奎, 杨凤云. 加味阳和汤含药血清抑制过氧化氢诱导成骨细胞的氧化损伤[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(33): 8583-8590.

Wu Fan, Yang Wenlong, Liu Jiangyuan, Xia Hanting, Zeng Zhikui, Yang Fengyun. Jiawei Yanghe Decoction-containing serum attenuates hydrogen peroxide-induced oxidative damage in osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(33): 8583-8590.

图/表（结果） 5

2.1 加味阳和汤含药血清体积分数筛选结果如图1A所示，对照组与体积分数2.5%，5%，10%，15%，20%，25%加味阳和汤含药血清组细胞活力差异均有显著性意义(P < 0.05)。体积分数2.5%-20%加味阳和汤含药血清提高MC3T3-E1细胞细胞活力，其中体积分数15%加味阳和汤含药血清组最佳，而体积分数25%加味阳和汤含药血清具有一定的细胞毒性。如图1B所示，体积分数5%，10%，15%加味阳和汤含药血清均可升高过氧化氢诱导后的MC3T3-E1细胞活力(P < 0.05)。因此选择体积分数5%，10%，15%加味阳和汤含药血清进行后续实验。
2.2 细胞增殖检测结果如图2所示，与对照组比较，模型组MC3T3-E1细胞活力显著降低(P < 0.05)；与模型组比较，加味阳和汤含药血清(体积分数5%，10%，15%)组MC3T3-E1细胞活力显著升高(P < 0.05)。
2.3 细胞凋亡检测结果如图3所示，与对照组(4.68±0.32)%相比，模型组MC3T3-E1细胞凋亡率(64.13±6.98)%明显升高(P < 0.05)；而与模型组相比，加味阳和汤含药血清(体积分数5%，10%，15%)组MC3T3-E1细胞凋亡率则显著降低(P < 0.05)。
2.4 细胞成骨分化与矿化检测结果如图4所示，与对照组比较，模型组碱性磷酸酶染色阳性面积、茜素红染色阳性面积均显著降低(P < 0.05)。与模型组比较，加味阳和汤含药血清(体积分数5%，10%，15%)组碱性磷酸酶染色阳性面积、茜素红染色阳性面积均显著升高(P < 0.05)。
2.5 细胞活性氧水平如图5所示，与对照组(10.53±0.90)%比较，模型组MC3T3-E1细胞活性氧水平(75.50±6.35)%显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，加味阳和汤含药血清(体积分数5%，10%，15%)组细胞活性氧水平显著降低(P < 0.05)。
2.6 细胞中抗氧化酶活性与炎症因子水平如图6所示，与对照组比较，模型组过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性均显著降低(P < 0.05)，白细胞介素6、白细胞介素1β水平均显著升高(P < 0.05)。与模型组比较，加味阳和汤含药血清(体积分数5%，10%，15%)组过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性均显著升高(P < 0.05)，白细胞介素6、白细胞介素1β水平均显著降低(P < 0.05)。

2.7 核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路相关蛋白表达如图7所示，与对照组比较，模型组核因子E2相关因子2和血红素加氧酶1蛋白表达水平均显著降低(P < 0.05)。与模型组比较，加味阳和汤含药血清(体积分数5%，10%，15%)组核因子E2相关因子2和血红素加氧酶1蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05)。

参考文献

[1] WANG Y, TAO Y, HYMAN ME, et al. Osteoporosis in china. Osteoporos Int. 2009;20(10):1651-1662.
[2] COUGHLAN T, DOCKERY F. Osteoporosis and fracture risk in older people. Clin Med (Lond). 2014;14(2):187-191.
[3] FISCHER V, HAFFNER-LUNTZER M. Interaction between bone and immune cells: Implications for postmenopausal osteoporosis. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:14-21.
[4] LANE JM, RUSSELL L, KHAN SN. Osteoporosis. Clin Orthop Relat Res. 2000; (372):139-150.
[5] ARMAS LA, RECKER RR. Pathophysiology of osteoporosis: new mechanistic insights. Endocrinol Metab Clin North Am. 2012;41(3):475-486.
[6] 徐蕾,张春芳,韩国柱,等.骨质疏松发病机制的研究进展[J].大连医科大学学报,2022,44(5):433-439.
[7] ZHENG YH, YANG JJ, TANG PJ, et al. A novel Keap1 inhibitor iKeap1 activates Nrf2 signaling and ameliorates hydrogen peroxide-induced oxidative injury and apoptosis in osteoblasts. Cell Death Dis. 2021;12(7):679.
[8] 段波,陈丽川,马志毅,等.梓醇对H2O2诱导成骨细胞损伤的影响及机制[J].中国药房,2024,35(10):1220-1225.
[9] WANG L, LIANG Y, ZHOU X, et al. Nrf2 differentially regulates osteoclast and osteoblast differentiation for bone homeostasis. Biochem Biophys Res Commun. 2023;674:19-26.
[10] CAO S, WANG Y, ZHANG Y, et al. Naringenin can Inhibit the Pyroptosis of Osteoblasts by Activating the Nrf2/HO-1 Signaling Pathway and Alleviate the Differentiation Disorder of Osteoblasts Caused by Microgravity. J Agric Food Chem. 2024;72(46):25586-25600.
[11] JIN C, LIN BH, ZHENG G, et al. CORM-3 Attenuates Oxidative Stress-Induced Bone Loss via the Nrf2/HO-1 Pathway. Oxid Med Cell Longev. 2022; 2022:5098358.
[12] NARIMIYA T, KANZAKI H, YAMAGUCHI Y, et al. Nrf2 activation in osteoblasts suppresses osteoclastogenesis via inhibiting IL-6 expression. Bone Rep. 2019;11:100228.
[13] YANG K, CAO F, QIU S, et al. Metformin Promotes Differentiation and Attenuates H2O2-Induced Oxidative Damage of Osteoblasts via the PI3K/AKT/Nrf2/HO-1 Pathway. Front Pharmacol. 2022;13:829830.
[14] SÁNCHEZ-DE-DIEGO C, PEDRAZZA L, PIMENTA-LOPES C, et al. NRF2 function in osteocytes is required for bone homeostasis and drives osteocytic gene expression. Redox Biol. 2021;40:101845.
[15] 王弘宇.加味阳和汤调节去卵巢诱导骨质疏松模型小鼠Th17/Treg平衡机制[D].南昌:江西中医药大学,2023.
[16] 毛昭冲.基于AMPK信号通路探究加味阳和汤对成骨细胞的衰老作用[D].南昌:江西中医药大学,2023.
[17] 曹端广.加味阳和汤对肾阳虚型骨质疏松模型鼠的抗骨质疏松作用及机制研究[D].南昌:江西中医药大学,2020.
[18] 罗云丰.加味阳和汤通过BMP-SMAD信号通路调控骨-脂平衡促进骨髓间充质干细胞向成骨分化[D].南昌:江西中医药大学,2022.
[19] 杨智军,杨文龙,夏汉庭,等.加味阳和汤含药血清对MC3T3-E1与RAW264.7细胞共育体系的影响[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(9): 1342-1346.
[20] 曹端广,杨凤云,夏汉庭,等.MTT比色法观察加味阳和汤对SD乳鼠成骨细胞增殖的影响[J].江西中医药,2019,50(9):60-62.
[21] 杨佛,杨文龙,李明慧,等.基于NF-κB信号通路研究加味阳和汤对破骨细胞活性的影响[J].江西中医药大学学报,2022,34(1):84-87.
[22] 曹端广,杨文龙,夏汉庭,等.基于OPG/RANKL/RANK轴观察加味阳和汤及其拆方对去卵巢骨质疏松大鼠的影响[J].中国骨质疏松杂志,2020, 26(6):818-821.
[23] 曹端广,夏汉庭,杨文龙,等.加味阳和汤对肾阳虚型骨质疏松模型大鼠骨密度及血清微量元素的影响[J].安徽中医药大学学报,2019, 38(3):76-79.
[24] XIA H, CAO D, YANG F, et al. Jiawei Yanghe decoction ameliorates cartilage degradation in vitro and vivo via Wnt/β-catenin signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2020;122:109708.
[25] 李福伟,毛昭冲,杨文龙,等.加味阳和汤含药血清联合转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响[J].时珍国医国药,2023, 34(12):2817-2821.
[26] KIMBALL JS, JOHNSON JP, CARLSON DA. Oxidative Stress and Osteoporosis. J Bone Joint Surg Am. 2021;103(15):1451-1461.
[27] RIEGGER J, SCHOPPA A, RUTHS L, et al. Oxidative stress as a key modulator of cell fate decision in osteoarthritis and osteoporosis: a narrative review. Cell Mol Biol Lett. 2023;28(1):76.
[28] ZHOU Y, SU Z, LIU G, et al. The Potential Mechanism of Soy Isoflavones in Treating Osteoporosis: Focusing on Bone Metabolism and Oxidative Stress. Phytother Res. 2025;39(3):1645-1658.
[29] QI XC, LI B, WU WL, et al. Protective effect of hyperoside against hydrogen peroxide-induced dysfunction and oxidative stress in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2020;48(1):377-383.
[30] 杨虎,郑宇,贾承明,等.中药调节氧化应激防治骨质疏松症的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2025,31(15):277-285.
[31] LUO Y, XIA H, WANG J, et al. Jiawei Yanghe Decoction Regulates Bone-Lipid Balance through the BMP-SMAD Signaling Pathway to Promote Osteogenic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:2885419.
[32] 任伟亮,焦永伟,张健,等.黄芪总黄酮对骨关节炎软骨细胞氧化应激和炎症因子分泌的影响[J].郑州大学学报(医学版),2019,54(4): 603-606.
[33] 武艳芝,姚远,杨五小,等.基于NF-κB信号通路探讨当归多糖对LPS介导的SD大鼠骨性关节炎作用研究[J].中华中医药学刊,2024, 42(11):136-140.
[34] 赖立勇,徐圣焱,夏天爽,等.基于抗氧化机制的中药及其化学成分在骨质疏松中的应用[J].海军军医大学学报,2022,43(8):943-950.
[35] 王刘玉,万全会,陈军.黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖的影响及作用机制研究[J].中医正骨,2023,35(8):1-7.
[36] LIN BH, MA RX, WU JT, et al. Cinnamaldehyde Alleviates Bone Loss by Targeting Oxidative Stress and Mitochondrial Damage via the Nrf2/HO-1 Pathway in BMSCs and Ovariectomized Mice. J Agric Food Chem. 2023; 71(45):17362-17378.
[37] BISCHOFF-KONT I, FÜRST R. Benefits of Ginger and Its Constituent 6-Shogaol in Inhibiting Inflammatory Processes. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(6):571.
[38] 陈婷婷,黄天一,李梦雨,等.1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的骨保护作用与Nrf2/HO-1信号通路的相关性研究[J].药学学报,2020,55(5):907-914.
[39] 赵继荣,蒋鹏,陈文,等.Nrf2/HO-1信号通路在骨质疏松症中的作用及中药干预研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(20):241-249.

引言

骨质疏松症作为一种与增龄密切相关的全身性骨骼代谢性疾病，已在全球范围内演变为重大公共卫生危机[1]。骨质疏松症的本质是骨微结构进行性退化导致的生物力学性能衰减，在这一病理机制下骨骼脆性增加，轻度外力即可导致骨折[2-3]，给患者身心及经济造成巨大负担[4]。
活性氧在骨代谢中具有双重作用：一是生理浓度下，活性氧作为第二信使参与成骨细胞分化信号转导；二是当活性氧过量累积形成氧化应激时，则会破坏骨稳态，抑制成骨细胞功能，诱发成骨细胞凋亡，导致骨质疏松症[5-6]。因此抗氧化逐渐被认为是改善骨质疏松的有效途径[7-8]。核因子E2相关因子2是一种转录因子，通过调控多种抗氧化酶和解毒酶的基因表达，维持细胞内的氧化还原平衡[9]。氧化应激激活核因子E2相关因子2，使它转位入核并结合抗氧化反应元件，启动血红素加氧酶1、超氧化物歧化酶等抗氧化酶表达[10-11]，有效减少活性氧的累积[12]，这表明激活核因子E2相关因子2可能是成骨细胞抗氧化应激和预防骨质疏松症的有效策略[13-14]。
前期研究发现，加味阳和汤在抗骨质疏松症方面具有多方面的调控作用，核心机制如下：一是调节免疫平衡，促进叉头框蛋白p3表达、抑制维甲酸相关孤儿受体γt表达，改善辅助性T细胞17与调节性T细胞失衡，助力防治绝经后骨质疏松症[15]；二是保护骨细胞功能，能延缓过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞衰老，维持细胞正常功能[16]；三是调控骨代谢相关蛋白，增加骨保护素表达、降低核因子κB受体活化因子配体及核因子κB受体活化因子蛋白表达，通过调节骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子轴，改善骨质疏松症肾阳虚证，同时提高去卵巢骨质疏松症大鼠骨密度、骨矿含量，降低骨代谢，改善骨显微结构[17]；四是平衡骨形成与脂肪生成，以此促进骨修复，延缓骨质疏松症大鼠病程进展[18]。但细胞氧化应激层面的作用机制尚不完善[19-23]。该研究以过氧化氢诱导建立成骨细胞氧化应激模型，探究加味阳和汤对过氧化氢诱导成骨细胞损伤的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2024年1月至2025年1月在江西中医药大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验药物加味阳和汤由熟地黄、鹿角胶、鸡血藤、肉桂、麻黄、木瓜、炮姜、白芥子、汉防己、甘草等10味药物组成[24]，以上药物均购自江西省中医院东湖院区门诊中药房，加水浸泡30 min，用砂锅煎煮，文火浓缩至每毫升含生药1 g，放凉后4 ℃保存。
1.3.2 实验试剂细胞功能检测试剂盒：CCK-8试剂盒(货号：C0038)、EdU试剂盒(货号：C0078S)、TUNEL试剂盒(货号：C1170S)、碱性磷酸酶染色试剂盒( 货号：P0321S)、茜素红染色试剂盒(矿化结节检测)(货号：C0148S)、DCFH-DA活性氧试剂盒(货号：S0035S)、超氧化物歧化酶测试盒(货号：S0060)及过氧化氢酶测试盒(货号：S0051)均购自碧云天生物有限公司(Beyotime Biotechnology)。炎症因子检测试剂盒：白细胞介素6(货号：ml064292)与白细胞介素1β (货号：ml037361)ELISA试剂盒(MLBio)。抗体：核因子E2相关因子2 (货号：16396-1-AP)、血红素加氧酶1 (货号：10701-1-AP)、β-actin(货号：66009-1-Ig)一抗和HRP抗兔二抗(货号：SA00001-2)(Proteintech公司)。
1.3.3 实验仪器细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)；4 ℃医用冷藏箱(海尔HYC-360，青岛)；-80 ℃超低温冰箱(Panasonic MDF-U54V，日本)；倒置显微镜(上海光仪六厂，XSP-2CA)；纯水仪(Thermo Fisher 50138221，美国)；多功能酶标仪(Tecan，瑞士)；荧光倒置显微镜(Zeiss 3324000674，德国)；电泳设备(Bio-Rad 1704406，美国)；转印系统(Bio-Rad 1704150，美国)及Gel Doc XR⁺ 成像仪(Bio-Rad 1708195，美国)。
1.3.4 实验动物 2月龄SPF级雄性SD大鼠30只，购自斯莱克景达实验动物有限公司(合格证号：43004700062023)，采用随机分配法分为加味阳和汤干预组(n=15)及生理盐水对照组(n=15)。实验方案经江西中医药大学动物实验伦理委员会审批许可(批准号：JZLLSC20220012)。
1.3.5 实验细胞小鼠MC3T3-E1细胞株购自赛百慷生物公司(货号：iCellm050)。
1.4 实验方法
1.4.1 加味阳和汤含药血清的制备根据前期实验研究[17，25]，取30只SPF级SD大鼠，采用2.0 g/kg最佳剂量灌胃加味阳和汤，连续灌胃1周后进行腹主动脉采血，提取含药血清，保存在-80 ℃备用。
1.4.2 加味阳和汤含药血清最佳体积分数筛选 MC3T3-E1细胞快速解冻后，用含体积分数10%胎牛血清及1%双抗的α-MEM完全培养基复苏培养，传代2次后接种于2块96孔板，培养至对数生长期，用不同体积分数(0%，2.5%，5%，10%，15%，20%，25%)加味阳和汤含药血清干预，每组6个复孔，其中1块板于含药血清干预21 h后，加入终浓度400 μmol/L的过氧化氢处理3 h以诱导氧化应激；另1块板为含药血清干预24 h。处理结束后，按CCK-8试剂盒说明检测450 nm波长处各孔吸光度值，以0%含药血清组为对照组、无细胞孔为空白组，按公式[(干预组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)]×100%计算细胞活力，筛选既能提高细胞活力，又对正常细胞无毒性的含药血清体积分数用于后续实验。
1.4.3 细胞分组及处理将MC3T3-E1细胞随机分为对照组、模型组以及体积分数5%，10%，15%加味阳和汤含药血清组。对照组细胞不作处理，模型组仅用400 μmol/L过氧化氢处理3 h，不添加含药血清；体积分数5%，10%，15%加味阳和汤含药血清组在过氧化氢诱导氧化应激损伤后，分别加入终体积分数为5%，10%，15%加味阳和汤含药血清，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中孵育24 h，待进行下一步检测。
1.4.4 细胞增殖检测将MC3T3-E1细胞以3×103个/孔密度接种于96孔板中培养至对数生长期，以1.4.3分组方法处理24 h后，加入10 μmol/L EdU试剂孵育2 h，弃培养基，PBS洗涤，40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton X-100通透10 min，加Click反应液避光孵育20 min，使EdU标记的DNA显色；DAPI染核10 min，封固后荧光显微镜观察。EdU阳性细胞呈红色荧光，通过计算标记率评估细胞增殖活性。
1.4.5 细胞凋亡检测将MC3T3-E1细胞以3×104个/孔密度接种于24孔板中培养至对数生长期，以1.4.3分组方法处理24 h后，PBS漂洗2次，加40 g/L多聚甲醛固定20 min，加TUNEL反应混合液37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗涤，加DAPI染核10 min，PBS漂洗后荧光显微镜下观察呈现绿色荧光的凋亡细胞及呈现蓝色的细胞核，用Image J软件计算凋亡细胞数。
1.4.6 细胞碱性磷酸酶活性检测将MC3T3-E1细胞以3×104个/孔密度接种于24孔板中培养至对数生长期，以1.4.3分组方法处理24 h后，使用成骨诱导液[含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基+抗坏血酸(50 mg/mL)+β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)]培养，每2 d换液1次，成骨诱导1周时按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行相关操作。
1.4.7 细胞茜素红染色将MC3T3-E1细胞以3×104个/孔密度接种于24孔板中培养至对数生长期，以1.4.3分组方法处理24 h后，使用成骨诱导液培养，每2 d换液1次，成骨诱导3周时按照茜素红染色试剂盒说明书进行相关操作。
1.4.8 细胞活性氧水平检测将MC3T3-E1细胞以3×104个/孔密度接种于24孔板中培养至对数生长期，以1.4.3分组方法处理24 h后，PBS洗涤，加DCFH-DA荧光探针避光孵育30 min，PBS洗去游离探针，荧光显微镜采集图像后分析各组荧光差异， Image J软件计算活性氧相对水平。
1.4.9 细胞抗氧化酶活性与炎症因子水平检测将MC3T3-E1细胞以1×105个/孔密度接种于6孔板中培养至对数生长期，以1.4.3分组方法处理24 h后，加RIPA加裂解液冰浴裂解，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上层清液，BCA法测定蛋白浓度，按试剂盒说明书加反应底物，孵育后检测吸光度值，按超氧化物歧化酶、过氧化氢酶试剂盒及白细胞介素6、白细胞介素1β试剂盒说明书，计算超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性及白细胞介素6、白细胞介素1β水平。
1.4.10 核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路相关蛋白表达检测将MC3T3-E1细胞以1×105个/孔密度接种于6孔板中培养至对数生长期，以1.4.3分组方法处理24 h后进行Western blot检测：在冰水浴中用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA测蛋白浓度；取20 μg样本进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，电泳结束后转至PVDF膜，将膜放入封闭液中4 ℃孵育过夜，加1∶1 000稀释的核因子E2相关因子2、血红素加氧酶1、β-actin一抗，4 ℃摇床缓慢振荡孵育12 h，洗膜后加1∶10 000稀释的二抗孵育2 h；ECL试剂显色并采集条带图像，Image J软件分析灰度值，结果以目的蛋白(核因子E2相关因子2、血红素加氧酶1)灰度值与内参β-actin灰度值比值表示。
1.5 主要观察指标细胞功能指标(成骨细胞存活、增殖、分化与矿化)、细胞损伤核心病理特征(氧化应激与炎症指标)、信号通路指标(核因子E2相关因子2、血红素加氧酶)。
1.6 统计学分析用GraphPad Prism 8(v8.0.1)软件开展数据分析，计量资料以x±s表示；多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，经Brown-Forsythe检验显示方差齐性(P > 0.05)，采用Tukey法进行多重比较，方差不齐时选用Games-Howell法进行比较。统计显著性设为α=0.05。该文章的统计学方法已经江西中医药大学统计学专家审核。

讨论

该研究基于活性氧介导的氧化应激在骨代谢调控中的关键作用，重点探讨活性氧通过干扰骨形成与骨吸收的动态平衡进而抑制成骨分化这一骨质疏松症的核心病理机制[26-28]。采用过氧化氢干预小鼠颅顶前成骨细胞系MC3T3-E1成功建立了氧化应激介导的成骨功能障碍模型[29-30]。实验数据显示，400 μmol/L 过氧化氢处理显著提高了细胞内源性活性氧水平，并伴随促炎细胞因子白细胞介素6、白细胞介素1β表达上调，呈现典型氧化应激特征。骨质疏松症成骨细胞有2个核心病理特征：一是成骨细胞增殖与分化能力显著抑制，表现为碱性磷酸酶活性和矿化结节形成显著下降，碱性磷酸酶活性降低反映了成骨分化早期能量代谢障碍和基质合成能力减弱，而矿化减少则直接导致骨基质沉积不足；二是成骨细胞存活受损，细胞凋亡率显著升高，提示成骨细胞数量减少与寿命缩短。该模型结果高度符合临床骨质疏松症患者骨形成减弱的病理生理改变，验证了该模型在模拟疾病相关成骨细胞功能障碍方面的有效性。
加味阳和汤是在经典方剂阳和汤基础上化裁而成，课题组前期工作表明加味阳和汤具有抗炎、调节骨代谢平衡的潜力[31]，包括延缓膝骨关节炎软骨下骨改变、促进体内外成骨和抑制破骨分化[18]。该研究进一步揭示加味阳和汤含药血清能有效拮抗过氧化氢诱导的成骨细胞功能损伤，改善细胞活力及生存状态，并且可恢复成骨分化潜能，具有拮抗氧化和炎性应激作用，清除细胞内累积的活性氧，降低炎性因子白细胞介素6和白细胞介素1β水平，提高关键抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶)活性，减轻氧化应激和炎症反应对成骨细胞的损害。现代药理学研究表明，加味阳和汤中的核心药物富含黄酮类、多糖及胶质成分，具有直接清除自由基和抑制核因子κB炎症通路的潜力[32-34]。黄芪中的黄芪苷可通过增强线粒体功能间接减少活性氧生成[35]；肉桂的桂皮醛[36]、炮姜的姜酚等成分为核因子E2相关因子2天然激动剂[37]，它们可能通过抑制Keap1 (核因子E2相关因子2的抑制剂)或促进核因子E2相关因子2核转位激活相关信号通路。该研究结果不仅为传统方剂的现代应用提供了实验依据，也揭示了多成分-多靶点的作用特征，符合中医药整体观念的优势。
核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路是调控骨微环境稳态、细胞抗氧化防御及骨形成能力的重要信号通路之一[38-39]。该研究结果显示，在过氧化氢诱导的MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤模型中，核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路活性显著受抑制，关键蛋白核因子E2相关因子2、血红素加氧酶1表达下调，导致细胞抗氧化能力下降，进而陷入氧化应激恶性循环，引发成骨细胞功能障碍。加味阳和汤含药血清可剂量依赖性激活该通路，随加味阳和汤含药血清体积分数升高，核因子E2相关因子2、血红素加氧酶1蛋白表达水平逐步上调，加味阳和汤高剂量组表达接近正常对照组水平，有效逆转通路抑制状态。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路激活后产生多重保护效应：一是增强细胞抗氧化能力，清除细胞内累积的活性氧，提升超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶活性；二是抑制炎症反应，降低促炎因子白细胞介素6、白细胞介素1β的表达水平；三是恢复成骨细胞功能，减少细胞凋亡，提高细胞增殖能力，同时促进成骨分化关键标志物碱性磷酸酶活性升高及矿化结节形成。上述结果表明加味阳和汤含药血清保护成骨细胞、提高成骨细胞分化功能的重要机制之一可能是通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路来实现的。
综上所述，该研究从骨质疏松症的核心病理生理出发，证实氧化应激通过抑制核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1通路导致成骨细胞功能障碍，是骨形成减弱的重要机制。加味阳和汤可能通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1通路，有效清除活性氧、抑制炎症因子释放、提升抗氧化能力，从而减轻氧化应激损伤，恢复成骨细胞活力与骨形成功能，为加味阳和汤应用于骨质疏松症的骨代谢调控及成骨功能保护提供重要实验依据和潜在作用靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

加味阳和汤含药血清抑制过氧化氢诱导成骨细胞的氧化损伤

Jiawei Yanghe Decoction-containing serum attenuates hydrogen peroxide-induced oxidative damage in osteoblasts

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	孙蕾, 张琦, 张宇. 绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜的促成骨效应[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 1877-1884.
[2]	吴妍廷, 李宇, 廖金凤. 氧化镁纳米粒调控成骨与血管生成相关基因表达促进骨缺损愈合[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 1885-1895.
[3]	杨学涛, 朱梦菡, 张宸熙, 孙一民, 叶玲. 抗氧化纳米材料在口腔中的应用和不足[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 2044-2053.
[4]	董春阳, 周天恩, 莫孟学, 吕文权, 高明, 朱瑞凯, 高志伟. 二甲双胍联合血水草敷料治疗深Ⅱ度烧伤创面的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 2001-2013.
[5]	李镇宇, 张思明, 柏家祥, 朱晨. 蛇床子素改善高糖环境下骨髓间充质干细胞的成骨分化功能[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1641-1648.
[6]	金东升, 赵张红, 朱子银, 张森, 孙祖延, 邓江. 淫羊藿苷缓释微球三维支架对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1658-1668.
[7]	邹玉莲, 陈朝沛, 黄海霞, 兰玉燕, 刘敏, 黄婷. 白藜芦醇在炎症微环境下促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1669-1678.
[8]	刘安婷, 陆江涛, 张文杰, 贺玲, 唐宗生, 陈晓玲. 血小板裂解物调控腺苷酸活化蛋白激酶抑制镉诱导的神经细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1800-1807.
[9]	杨肖, 白月辉, 赵甜甜, 王东昊, 赵琛, 袁硕. 颞下颌关节骨关节炎软骨退变：机制及再生的挑战[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(4): 926-935.
[10]	王厚元, 肖嘉聪, 邵首嘉, 何拍岸, 杨楠, 姜自伟, . 杜仲苷促进小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(36): 9381-9392.
[11]	连勇, 谢志兴, 陆嘉欣, 潘兆丰, 陈庆真, 邵敏. 高糖诱导成骨细胞铜死亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(36): 9393-9401.
[12]	徐洪涛, 王建平, 徐月红, 李琴, 漆启华, 夏琪鹏. 积雪草苷促进骨质疏松大鼠的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(35): 9113-9119.
[13]	董士铭, 谢祯子, 陶荣荣, 买尔旦·买买提, 马海蓉. Ⅵ型胶原蛋白：骨稳态与工程应用中的多功能调控因子[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(35): 9239-9247.
[14]	朱礼丰, 王文驰, 刘强, 崔宪钦, 章震浩, 黄杰, 吕柱成, 王磊航, 崔伟. 淫羊藿苷防治骨质疏松症的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(35): 9248-9257.
[15]	肖扬, 高梓博, 胡宇翔, 康智鑫, 张焯铉, 黄澄宇, 刘汯林, 陈凯, 王洪伸, 李永津. 金属蛋白酶类组织抑制剂功能网络失衡驱动椎间盘退变的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(35): 9258-9268.