高/低表达miR-122-5p稳转PC12细胞株的构建和鉴定

doi:10.12307/2026.082

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (7): 1790-1799.doi: 10.12307/2026.082

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

高/低表达miR-122-5p稳转PC12细胞株的构建和鉴定

陶代菊，苏海玉，王宇琪，沈志强，何波

昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南省昆明市 650500

收稿日期:2024-11-12 修回日期:2025-05-21 接受日期:2025-06-20 出版日期:2026-03-08 发布日期:2025-08-20
通讯作者: 沈志强，博士，教授，昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南省昆明市 650500 何波，博士，教授，昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南省昆明市 650500
作者简介:陶代菊，女，云南省楚雄市人，汉族，昆明医科大学在读博士，主要从事老年病药理学基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82260271)，项目负责人：何波；云南省科技厅科技计划项目(202001AY070001-157)，项目负责人：沈志强

Construction and identification of stable PC12 cell lines with high/low expression of miR-122-5p

Tao Daiju, Su Haiyu, Wang Yuqi, Shen Zhiqiang, He Bo

School of Pharmaceutical Science & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China

Received:2024-11-12 Revised:2025-05-21 Accepted:2025-06-20 Online:2026-03-08 Published:2025-08-20
Contact: Shen Zhiqiang, PhD, Professor, School of Pharmaceutical Science & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China He Bo, PhD, Professor, School of Pharmaceutical Science & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China He Bo, PhD, Professor, School of Pharmaceutical Science & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
About author:Tao Daiju, Doctoral candidate, School of Pharmaceutical Science & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82260271 (to HB); Science and Technology Project of Science and Technology Department of Yunnan Province, No. 202001AY070001-157 (to SZQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

慢病毒载体：是一种高效的基因工程工具，它能够将目的基因稳定整合到宿主细胞基因组中，具有感染和整合能力强、安全性高等特点，被广泛应用于基因治疗、基因功能研究、组织工程研究等领域。在此次研究中利用慢病毒载体将miR-122-5p基因导入PC12细胞株，确保了它的长期稳定表达。这一方法为研究miR-122-5p在神经系统疾病中的作用机制提供了坚实的实验基础，有助于深入探索其功能并开发新的治疗策略。
PC12细胞株：源自大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤，是一种在神经科学研究中广泛使用的细胞模型，不仅易于培养且稳定性高，还展现出典型的神经内分泌细胞特征。通过在PC12细胞中稳定高/低表达miR-122-5p，能够深入探究miRNA对神经细胞功能、分化以及信号传导的影响，为miR-122-5p在神经系统疾病中的作用机制提供了有力的实验工具。

摘要
背景：MicroRNA-122-5p(miR-122-5p)作为微小RNA(miRNA)家族中的关键成员，在调控基因表达及多种疾病的发生发展中扮演着重要的角色，然而其确切的作用机制尚未完全阐明。构建稳定的miR-122-5p高/低表达 PC12细胞模型，可为深入研究miR-122-5p在神经系统疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。
目的：旨在构建高/低表达大鼠miR-122-5p慢病毒载体，并以此建立稳定高/低表达miR-122-5p的PC12细胞株，为进一步研究miR-122-5p在神经系统疾病中的作用奠定基础。
方法：根据miR-122-5p基因序列设计合成引物，通过PCR扩增该基因片段。将目的基因定向接入经AgeI/NheI酶切的载体质粒GV369中，构建重组慢病毒质粒。筛选阳性克隆，并进行测序比对结果。将质粒载体与目的质粒载体同293T细胞共培养转染，获得慢病毒原液进行包装和滴度测定。通过体外培养PC12细胞，确定嘌呤霉素工作浓度。慢病毒分别与PC12细胞共培养，确定转染效率，用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞，RT-qPCR法检测稳定转染细胞株的miR-122-5p表达量。

结果与结论：①测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功，高表达慢病毒滴度为4×108 TU/mL，miR-122-5p低表达慢病毒滴度为1×109 TU/mL；②PC12细胞嘌呤霉素工作浓度为3.5 μg/mL；③高表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞的最佳条件为HiTransG P转染增强液，且感染复数值=10；感染复数值=50时低表达miR-122-5p效率最高；④RT-qPCR结果显示，高表达稳转细胞株中miR-122-5p的表达量有明显升高，而低表达稳转细胞株中miR-122-5p表达量显著降低；⑤此次研究成功构建了高/低表达miR-122-5p慢病毒载体，并获得稳转PC12细胞株，为miR-122-5p在神经系统疾病中的进一步研究提供了实验基础。

https://orcid.org/0000-0002-4544-8787 (沈志强)

https://orcid.org/0000-0002-4029-5435 (何波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: PC12细胞, 微小RNA, 慢病毒载体, 质粒, miR-122-5p, 稳转细胞株, 神经系统疾病, 缺血性脑卒中

Abstract: BACKGROUND: MicroRNA-122-5p (miR-122-5p), as a key member of the microRNA (miRNA) family, plays an important role in regulating gene expression and the occurrence and development of various diseases. However, its precise mechanisms remain incompletely understood. The construction of stable miR-122-5p-overexpressing or miR-122-5p-knockdown PC12 cell models may provide a powerful experimental tool for in-depth studies of the exact mechanism of action of miR-122-5p in neurological diseases and the discovery of potential therapeutic targets.
OBJECTIVE: To construct a lentiviral vector for high/low expression of rat miR-122-5p and use it to establish a PC12 cell line with stable overexpression of high/low expression of miR-122-5p, which would lay the foundation for further research on the role of miR-122-5p in neurological diseases.
METHODS: Synthetic primers were designed according to the miR-122-5p gene sequence, and the resulting gene fragment was amplified via polymerase chain reaction (PCR). A recombinant lentiviral plasmid was constructed via the directional insertion of the target gene into the vector plasmid GV369 digested by AgeI/NheI. Positive clones were screened and sequenced to compare the results. The plasmid vector was cocultured and transfected with the target plasmid vector in 293T cells, and the lentiviral stock solution was obtained for packaging and titer assays. The working concentration of puromycin was determined by culturing PC12 cells in vitro. Lentiviruses were cocultured with PC12 cells separately to determine the transfection efficiency. Stably transfected cells were selected with puromycin, and miR-122-5p expression in the stably transfected cell lines was detected via real-time quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The sequencing sequence was consistent with the target sequence, suggesting that the recombinant lentiviral vector was constructed successfully. The lentiviral titer of high expression was 4×108 TU/mL, and the lentiviral titer of low expression of miR-122-5p was 1×109 TU/mL. (2) The working concentration of puromycin in PC12 cells was 3.5 μg/mL. (3) The optimal conditions for the lentiviral transfection of PC12 cells with high expression of miR-122-5p were HiTransG P transfection enhancement solution and an infection complex value equal to 10; the highest efficiency of low expression of miR-122-5p was achieved at an infection complex value of 50. (4) qRT-PCR revealed a significant increase in miR-122-5p expression in stably transfected cell lines and a significant decrease in miR-122-5p expression in stably transfected cell lines. (5) In this study, a miR-122-5p lentiviral vector was successfully constructed, and a stably transformed PC12 cell line was generated, which provides an experimental basis for further study of the role of miR-122-5p in neurological diseases.

Key words: PC12 cell, microRNA, lentiviral vector, plasmid, miR-122-5p, stable cell line, neurological disease, ischemic stroke

中图分类号:

陶代菊, 苏海玉, 王宇琪, 沈志强, 何波. 高/低表达miR-122-5p稳转PC12细胞株的构建和鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1790-1799.

Tao Daiju, Su Haiyu, Wang Yuqi, Shen Zhiqiang, He Bo . Construction and identification of stable PC12 cell lines with high/low expression of miR-122-5p[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(7): 1790-1799.

图/表（结果） 4

2.1 慢病毒载体构建及质粒鉴定 如图1所示，此次研究成功构建了GV369和GV691两种慢病毒载体，分别用于miR-122-5p的高表达和低表达(图1A，B)。经37 ℃培养18 h后，筛选得到的阳性单克隆菌落进行测序分析，所得序列与目标基因的反向互补序列比对结果显示完全匹配(图1D)。如图1C所示，合成的目的基因序列经测序验证证实已准确插入GV369载体(图2，3)，测序结果与预期设计序列完全一致。
2.2 慢病毒的包装及滴度测定 进一步对慢病毒进行包装及滴度测定，结果显示，miR-122-5p 高表达慢病毒滴度为4×108 TU/mL，miR-122-5p低表达慢病毒滴度为1×109 TU/mL(图4)。

2.3 嘌呤霉素处理PC12细胞后的死亡情况 在将PC12细胞铺板于24孔板并培养24 h后更换各培养孔的培养基，使其含有不同嘌呤霉素质量浓度。培养24 h后在显微镜下观察到，随着嘌呤霉素质量浓度的增加，PC12细胞死亡情况愈加明显，当质量浓度达到4 μg/mL及以上时，基本无细胞存活(图5A)。此外，随着培养时间的延长，即使嘌呤浓度仅为3.5 μg/mL，也无细胞存活(图5B)。
2.4 高/低表达miR-122-5p慢病毒最佳转染条件 将生长状态良好的PC12细胞进行转染，根据不同条件加入相应的转染试剂和慢病毒，并在荧光显微镜下观察细胞转染情况并拍照记录保存。实验结果表明，在MOI=10条件下，高表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞效果良好，转染增强液P组表现出最优的转染效率(荧光强度显著)和细胞存活率，显著优于完全培养基组和转染增强液A组(图6)。随着MOI值增加至50，各组转染效率均有提升，其中转染增强液P组仍保持最佳转染效果；但当MOI升至100时，细胞存活率明显下降。对于低表达miR-122-5p慢病毒转染，MOI=10时转染效率欠佳(荧光信号较弱)，MOI=50时转染效率可达90%且细胞状态良好，而MOI=100则导致部分细胞死亡(图7)。综合细胞状态、病毒用量和荧光强度等因素最终确定，当MOI=10且使用转染增强液HiTransG P进行高表达miR-122-5p慢病毒转染时转染效果最佳；在MOI=50使用转染增强液HiTransG P低表达miR-122-5p 慢病毒转染时转染效果最佳。
2.5 高表达miR-122-5p慢病毒稳转PC12细胞株miR-122-5p的表达量 将转染增强液HiTransG P及MOI=10高表达miR-122-5p的慢病毒对PC12细胞进行转染，连续培养72 h，然后添加3.5 μg/mL嘌呤霉素进行筛选，培养四五代后获得miR-122-5p稳定高表达的PC12细胞株。荧光显微镜结果显示，在miR-122-5p高表达的PC12细胞株中，大多数细胞成功转染，且细胞生长状态良好，转染效率达到100%，见图8。通过提取总RNA进行qPCR定量检测，结果显示，与正常对照组相比，高表达miR-122-5p组的miR-122-5p表达量有显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01)，而高表达miR-122-5p空载对照组的miR-122-5p表达量未发生明显变化，见图9。

2.6 低表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞株miR-122-5p的表达量将含转染增强液HiTransG P以及MOI=50的低表达慢病毒加入完全培养基中，与PC12细胞共培养72 h，随后使用3.5 μg/mL嘌呤霉素筛选获得了稳定低表达PC12细胞株。荧光显微镜结果显示，稳转PC12细胞株生长状态良好，且达到100%的转染效率(图10)。进一步对该细胞株提取总RNA并进行RT-qPCR分析，结果表明，与正常对照组比较，低表达miR-122-5p组的miR-122-5p表达量有显著降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，而低表达miR-122-5p空载对照组的miR-122-5p表达量未出现明显变化(图11)。

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引言

微小RNA (microRNAs，miRNA) 是一类18-24个核苷酸长的短链非编码RNA，通过促进mRNA降解或抑制其翻译，调控多种生理功能和病理过程[1-2]。miRNA因在细胞通讯中的微调节作用，参与细胞信号传导和微环境重塑，同时在细胞分化、增殖和凋亡等细胞过程中发挥重要作用[3]。miRNA主要在细胞核内转录，由RNA聚合酶Ⅱ形成包含miRNA序列的发卡样结构pri-miRNA，随后经RNaseⅢ核酸内切酶Drosha修剪后出核，并在细胞质内被加工成成熟miRNA[4]。已有研究表明，miRNA可能通过抑制mRNA翻译来调控神经元细胞的发育和成熟[5]。成熟的miRNA与RNA 诱导沉默复合物结合，导致mRNA的降解或抑制翻译，从而调节基因表达。有学者于1993年发现首个miRNA[5]，后续研究指出，人类基因组中超过1/3的基因可能受miRNA调控[6-7]。尽管miRNA在20世纪90年代已被发现，但由于miRNA家族成员众多且复杂，目前仅部分miRNA的功能和作用机制得到阐明。在多种疾病中，miRNA表达失调涉及多种机制，包括异常的转录调控、miRNA生物合成过程的缺陷以及表观遗传失衡等[8-9]。研究显示，miRNA可能通过抑制mRNA翻译调控神经元细胞的发育和成熟[10]。因此，miRNA在中枢神经系统疾病中的作用不可忽视。高通量功能基因组学的发展使人们能够识别分子与疾病机制间的复杂关系，日益增多的证据支持选择性miRNA的下调和上调可能在疾病发生发展中发挥重要作用。在治疗领域，miRNA药物研发取得了显著进展，目前有超过10种miRNA药物正在进行临床试验[11]。
miR-122-5p是miRNA家族的一员，在多种疾病中发挥重要作用，如子宫内膜异位症[12]、肝损伤[13-14]、心肌损伤以及心室功能下降[15]、非酒精性脂肪肝[16]、动脉粥样硬化等[17]。miR-122-5p在抗肿瘤及肿瘤耐药方面发挥重要作用，研究发现circ_0001047能够海绵吸附miR-122-5p，激活FKBP5表达，从而抑制PCa细胞的增殖、抗凋亡、迁移和侵袭能力[18]。此外，miR-122-5p的异常表达还与结肠癌患者对5-氟尿嘧啶化疗的耐药性密切相关[19]。
也有研究显示，子宫内膜异位症患者卵泡液外泌体中 miR-122-5p 表达水平升高，可能损害了卵丘细胞的葡萄糖代谢，进而影响卵母细胞的质量[20]。
miR-122-3p和miR-122-5p_R+1是参与α-干扰素诱导炎症反应发病机制的关键miRNA，并且在α-干扰素治疗下表达显著下调[21]。miR-122-5p 是骨关节炎治疗中与半合成硫酸软骨素相关的关键调节因子[20]，转染miR-122-5p能降低核因子κB受体活化因子配体诱导的p38和JNK磷酸化以及破骨细胞特异性基因表达。此外，含有miR-122-5p 的脂肪间充质干细胞的外泌体可抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞分化，并可能成为破坏性骨疾病的预防候选者[20]，有趣的是，miR-122-5p表达水平也可作为膝骨关节炎和骨质疏松症患者的循环生物标志物[22]。LIN等[23]研究发现，在急性心肌梗死患者中miR-122-5p的表达水平显著降低，而上调其表达能激活心肌细胞的抗凋亡机制，提示miR-122-5p对心肌梗死具有保护作用。在神经退行性疾病方面，神经保护性分泌性胞外域APPα(the secreted ectodomain APP alpha)是 miR-140和miR-122表达失调导致神经病理学进展的关键因素[20]。在阿尔茨海默症患者中miR-122-5p的表达差异显著，其或可作为阿尔茨海默症患者早期循环生物标志物[24]。研究表明，在急性缺血性脑卒中患者血清中miR-122-5p表达水平明显降低[25]，类似现象也见于重型颅脑损伤患者外周血中[26]。然而，miR-122-5p在神经系统疾病中的具体作用及机制尚不清楚，限制了对其深入研究的可能。
鉴于miR-122-5p在多种疾病中的广泛作用，此次研究旨在通过构建miR-122-5p高表达和低表达的PC12细胞模型，深入探究其在神经系统疾病中的作用机制。PC12细胞具有与神经元相似的特性，为研究miR-122-5p的功能提供了理想的体外平台。此次研究通过慢病毒介导的miR-122-5p高/低表达技术，建立稳定高/低表达miR-122-5p的PC12细胞株，为进一步研究miR-122-5p在神经系统疾病中的作用奠定实验基础，有助于深入探索其功能并开发新的治疗策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 构建稳定的miR-122-5p高表达和低表达的PC12细胞模型，采用RT-qPCR进行验证。
1.2 时间及地点 实验于2023年4月至2024年3月在昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室完成。
1.3 材料 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(pheochromocytoma cell line)PC12细胞(中国科学院昆明动物研究所，KCB200736YJ)，人胚肾细胞(293T细胞)系(中国塞维尔生物科技有限公司)。Trizol试剂、RT反转录试剂盒(美国Thermo)，PCR试剂盒(中国 Gene Copoeia)无水乙醇、异丙醇(中国风船化学试剂科技有限公司)，RPMI1640培养基(美国Gibico)，胰酶(中国Solarbio)，胎牛血清(中国Biosharp)，Trizol试剂(美国Thermo)，嘌呤霉素(中国Solarbio)。All-in-one™microRNA QRT-PCR Detection Kit(QP015)试剂盒(美国Thermo)，由北京擎科生物科技有限公司合成U6 Forward primer、miRNA-122-5p Forward primer。HiTransG P 转染液、慢病毒载体GV369、GV691及pHelper，质粒测序结果来自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 高/低表达miR-122-5p慢病毒载体的构建

(1)慢病毒载体的构建：根据miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库设计扩增大鼠miR-122-5p前体序列的引物及成熟体，引物信息如表1所示。

构建高表达慢病毒载体：载体编号为GV369，元件顺序：Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin，荧光标记：增强绿色荧光蛋白，AgeI/NheI为克隆位点。
构建低表达慢病毒载体：编号为GV691，元件顺序：hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin。
反载体酶切操作按照表2所示体系进行，于37 ℃孵育3 h后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切胶回收目标片段获得线性化载体。以大鼠基因组DNA为模板，采用表3所列体系扩增miR-122-5p

前体序列，PCR程序设定为：初始98 ℃预变性5 min；后续循环阶段(30个循环)包括98 ℃10 s变性、55 ℃10 s退火与30 s延伸；终延伸步骤为72 ℃维持8 min。随后进行载体与PCR产物的重组反应：按表4配方于冰浴条件下配制反应混合液，37 ℃处理30 min，冰浴骤冷5 min后立即进行转化实验。取10 μL重组产物与100 μL感受态细胞轻柔混合，冰浴静置30 min，42 ℃热激处理90 s后再次冰浴2 min。加入500 μL LB液体培养基后，37 ℃振荡培养1 h。取适量菌液涂布于含抗生素的平板，倒置培养18 h。通过菌落PCR初筛阳性克隆后，对候选菌落进行PCR验证及测序分析。选取测序正确的菌株进行扩大培养并提取质粒。

1.4.2 慢病毒的包装与滴度检测 将pHelper1.0、目的质粒载体及pHelper 2.0质粒共转染至293T细胞，于37 ℃、体积分数5% CO₂条件下培养48 h。收集细胞上清液，离心浓缩去除杂质后分装，并测定病毒滴度。
1.4.3 构建和筛选稳定高/低表达miR-122-5p的PC12细胞株
(1) PC12细胞培养：复苏PC12细胞，使用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。定期更换培养基，待细胞汇合度达80%时进行传代。
(2)嘌呤霉素最佳工作浓度的筛选：取生长良好的PC12细胞，以4×10⁸ cells/mL的密度接种于24孔板，贴壁培养24 h后，分别加入0.5-10 μg/mL (梯度递增)的嘌呤霉素。继续培养24 h观察细胞状态，并于48 h后显微镜下评估存活情况。最终选择能完全抑制PC12细胞生长的最低嘌呤霉素浓度作为后续实验的工作浓度。

(3)慢病毒转染PC12细胞的最适条件优化：将PC12细胞以2×10⁸ cells/L的密度接种于96孔板，培养24 h后，取不同滴度(1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸ TU/mL)的慢病毒进行转染(具体操作参照表5)。24 h后更换为完全培养基继续培养，72 h后观察荧光表达及细胞状态。最终选择转染效率≥80%、MOI值最低且细胞状态最佳的实验条件用于后续稳定株的构建。

(4) 高/低表达miR-122-5p稳转PC12细胞株的构建及鉴定实验分组：将实验分为5组，具体如下：高表达miR-122-5p组为高表达miR-122-5p慢病毒(4×108 TU/mL)+HiTransG P转染液(20 μL)+完全培养基；高表达miR-122-5p空载对照组为高表达miR-122-5p慢病毒空白载体(2.5×109 TU/mL)+HiTransG P转染液(20 μL)转染液+完全培养基；低表达miR-122-5p组为低表达miR-122-5p慢病毒(1×109 TU/mL)+HiTransG P 转染液(20 μL)+完全培养基；低表达miR-122-5p空载对照组为低表达miR-122-5p慢病毒空白载体(3×108 TU/mL)+HiTransG P 转染液(20 μL)+完全培养基；正常对照组为完全培养基。
转染实验：PC12细胞按4×105/mL的密度种于24孔板，每组3个复孔，贴壁生长1 d后，依据病毒滴度和MOI计算出病毒体积，取出相应体积的病毒液与20 μL 25×HitransG P转染增强液混合到1 mL完全培养基里一并加入培养孔中。病毒体积计算公式如下：病毒体积=(MOI×细胞数目)/病毒滴度。适时观察细胞状态，发现细胞漂浮死亡即更换新鲜的培养基以保证细胞可获得充足的营养。培养72 h后，细胞荧光强度可达到最大值，此时在荧光显微镜下观察转染效率并拍照保存。
构建稳转株：在使用慢病毒感染PC12细胞72 h之后，将完全培养基更换为含3.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基继续培养，不断传代筛选，四五代之后提取RNA进行qPCR实验检测miR-122-5p的表达量。
(5) RT-qPCR检测稳转细胞株的miR-122-5p表达量：使用Trizol提取各组PC12细胞中总RNA，按试剂盒说明书操作。通过Light Cycler 96测定目的基因、内参U6的表达，以2-ΔΔCT法计算miR-122-5p的相对表达量。miR-122-5p的上游引物序列：5’-CCG CTC GAG TTC GTG GCT ACA GAG TTT-3’，下游引物序列：5’-CCG GAA TTC TTT ATC GAG GGA AGG ATT-3’；U6的上游引物序列：5’-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3’，下游引物序列：5’-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3’。
1.5 主要观察指标 ①慢病毒载体的测序结果及病毒滴度；②荧光显微镜观察评估转染效率；③实时定量PCR检测miR-122-5p的表达量。

1.6 统计学分析 所有数据均以x±s呈现，使用SPSS 25.0进行统计分析，应用GraphPad Prism 6.01软件作图。组间差异比较采用方差分析和t检验，显著性水平设定为P < 0.05。此次研究的统计方法经昆明医科大学生物统计学专家审核认证。

讨论

miRNA是一类内源性的非编码小分子单链RNA，具有调控基因表达的功能。LEWIS等[27]提出，在人类基因组中超过1/3的基因可能受miRNA调控。每个miRNA可同时调控数百个靶基因，形成复杂的调控网络，这种广泛性使miRNA在生理和病理过程中发挥关键作用。miRNA的表达受到多层次调控，包括转录水平控制、表观遗传修饰以及生物合成通路的调节，这些调控机制的失衡可导致miRNA表达异常，进而影响下游靶基因的表达[28]。miRNA的表达失调广泛参与了神经系统疾病、肿瘤等多种疾病的发生与发展[29-30]，目前在临床转化方面针对miRNA的治疗策略已经取得突破性进展，用于治疗丙型肝炎的miRNA靶向药物Miravirsen在临床Ⅱ期试验中显示出良好的安全性和有效性[31]。随着递送技术的进步和临床试验的深入，miRNA治疗有望在未来为多种疾病提供新的治疗选择。
大量研究表明，miRNA在中枢神经系统中表达丰富，并在其生理病理过程中发挥关键调控作用。近年来，不断有研究揭示miRNA参与多种中枢神经系统疾病的发生发展，在疾病的诊断、评估以及预后判别等方面展现出巨大的应用前景[32]。在神经系统发育过程中，特定miRNA通过调控神经干细胞增殖、神经元分化、轴突生长和突触可塑性等关键环节，在维持脑结构和功能的完整性方面不可或缺[33]。神经损伤后，miRNA可通过调控凋亡相关基因、神经营养因子和轴突再生相关分子的表达，在减轻继发性损伤、促进神经修复和功能重塑等方面发挥重要的神经保护作用[34]。此外，miRNA还可通过靶向调控炎症信号通路中的关键分子，在阻遏神经炎症反应、维护机体免疫稳态等方面发挥重要的调节功能[35]。
前期研究表明，miR-122-5p通过抑制类风湿关节炎滑膜细胞的增殖和诱导凋亡，在缓解关节炎症反应中具有潜在的治疗作用[36]。同时，也有研究发现，脑卒中患者发作时血清miR-122和miR-122-5p的表达水平均显著升高[25，37]，提示它们可能参与了脑卒中的病理过程。体外实验证实，抑制miR-122-5p的表达可减轻脂多糖诱导的PC12细胞凋亡和炎症反应[38]。
在大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型中，miR-122过表达可减轻脑梗死体积，该神经保护效应可能与抑制脑微血管内皮细胞和白细胞一氧化氮合酶2表达有关[39]。此外，有研究揭示miR-122可通过结合FOXO3，负向调控热休克蛋白70介导的核因子κB信号通路，进而抑制缺血诱导的神经元凋亡[40]。综上所述，miR-122-5p作为脑卒中发病机制和神经保护研究的新靶点，具有广阔的临床转化前景。
miR-122-5p不仅有望成为诊断和预测脑卒中预后的生物标志物，还为开发基于miRNA的脑卒中治疗新策略提供了新思路。
PC12细胞是来源于大鼠嗜铬细胞瘤的细胞系，呈现出多巴胺能神经元的特征，是研究神经元发育、分化和功能的重要体外模型之一。在神经生长因子等神经营养因子的诱导下，PC12细胞可分化为具有交感神经元形态和生理特性的细胞。此外，分化的PC12细胞在形态学和电生理学特性上与原代神经元高度相似，如突起生长、突触样结构形成和动作电位的产生等。鉴于上述特点，PC12细胞已广泛应用于研究各种神经毒性物质和应激因素诱导的神经元损伤及其机制[41-42]。慢病毒载体是一种高效、安全的基因递送工具，其独特优势在于：携带外源基因可以稳定整合入宿主细胞基因组，实现长期、稳定的目的基因表达；对分裂期和非分裂期细胞均有高效转导力，尤其适用于难以转染的细胞系[43]。目前缺血性脑卒中的治疗手段仍然有限，寻找新的干预策略迫在眉睫。基因治疗已成为一种有前途的选择，慢病毒载体介导基因干预技术的发展为脑卒中的治疗带来新希望[44]。基于上述特点，慢病毒载体已成为基因过表达和基因沉默研究中的得力工具。因此，PC12细胞和慢病毒载体为深入研究miR-122-5p在缺血性脑卒中发病机制中的作用提供了理想的研究平台。PC12细胞结合miR-122-5p的慢病毒载体表达系统，可准确、高效地评估其对神经元存活和功能的影响，并阐明其中的分子机制。
此次研究成功构建了miR-122-5p的慢病毒高/低表达载体，并利用慢病毒转导技术获得了稳定高/低表达miR-122-5p的PC12细胞株。RT-qPCR结果证实载体构建和细胞株筛选均获成功，miR-122-5p表达分别显著上调和下调，这为后续研究miR-122-5p在神经系统疾病尤其是缺血性脑卒中发病机制中的作用提供了可靠的细胞模型和实验平台。miR-122-5p高/低表达PC12细胞株的成功建立，为深入研究miRNA在缺血性脑卒中发病过程中的作用机制、阐明其对神经元损伤和血管重构的调控效应奠定了基础。这不仅有助于揭示miR-122-5p失调在脑卒中病理中的致病机制，也为筛选出特异、高效的分子治疗靶点提供了新思路。此外，miR-122-5p细胞株还可用于构建体外和体内脑缺血模型，进而开展神经保护药物的评价和开发。
未来作者计划以稳定高/低表达miR-122-5p 的PC12细胞株为研究对象，采用生物信息学和高通量筛选技术鉴定miR-122-5p在脑缺血中的关键靶基因，阐明其调控的信号通路及分子机制；进而利用miR-122-5p高/低表达载体，在脑缺血动物模型中深入研究miR-122-5p对脑缺血损伤和预后的影响，并探索它作为脑卒中诊断和治疗新靶标的可能性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

高/低表达miR-122-5p稳转PC12细胞株的构建和鉴定

Construction and identification of stable PC12 cell lines with high/low expression of miR-122-5p

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