研磨处理可注射牙髓细胞外基质促进牙髓再生

doi:10.12307/2025.447

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (22): 4663-4670.doi: 10.12307/2025.447

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研磨处理可注射牙髓细胞外基质促进牙髓再生

杨毓茜，李文俊，赵健，陈岗

大连医科大学附属第一医院口腔科，辽宁省大连市 116011

收稿日期:2024-04-07 接受日期:2024-06-01 出版日期:2025-08-08 发布日期:2024-12-05
通讯作者: 陈岗，博士，副主任医师，大连医科大学附属第一医院口腔科，辽宁省大连市 116011
作者简介:杨毓茜，女，1999年生，浙江省诸暨市人，汉族，大连医科大学在读硕士，主要从事牙体牙髓再生研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81600818)，项目负责人：陈岗；辽宁省教育厅项目(LJKZ0855)，项目负责人：陈岗

Injectable dental pulp extracellular matrix prepared by grinding treatment for dental pulp regeneration

Yang Yuqian, Li Wenjun, Zhao Jian, Chen Gang

Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China

Received:2024-04-07 Accepted:2024-06-01 Online:2025-08-08 Published:2024-12-05
Contact: Chen Gang, MD, Associate chief physician, Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China
About author:Yang Yuqian, Master candidate, Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81600818 (to CG); a grant from Liaoning Provincial Department of Education, No. LJKZ0855 (to CG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞外基质：是存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分，属胞外微环境而不属于任何细胞。细胞外基质主要包括纤维成分、连接蛋白、填充分子等。
牙髓再生：是指通过植入生物材料、细胞或生长因子等来促进损坏或缺失的牙髓组织的再生和修复过程。这项技术通常用于治疗牙髓炎、牙髓坏死、牙髓损伤等问题，旨在保护牙齿的健康并避免牙齿的拔除。

背景：可注射细胞外基质材料用于牙髓组织再生时，首先需要经过胃蛋白酶消化，再与其他基质成分如水凝胶结合使用，而这也意味着天然细胞外基质材料所保留的微环境遭到破坏。
目的：探讨研磨处理条件下制备的可注射牙髓细胞外基质材料用于牙髓组织再生的效果。
方法：①将获取的猪牙来源牙髓组织经过脱细胞处理后制备成牙髓脱细胞基质材料，经过液氮冷冻、高速研磨处理后，制备成可注射牙髓细胞外基质材料，比较可注射牙髓细胞外基质材料和天然牙髓细胞外基质在细胞黏附效率和微结构方面的差异，免疫组化分析可注射牙髓细胞外基质中的细胞外基质蛋白质成分；②将接种有牙髓干细胞的可注射牙髓细胞外基质材料注入到牙本质基质材料构建的牙髓腔中，植入裸鼠皮下1，3，5周后取材，观察可注射牙髓细胞外基质材料的体内改建速率及其在裸鼠皮下的异位牙髓组织再生能力。

结果与结论：①与天然牙髓细胞外基质相比，可注射牙髓细胞外基质材料显著提高了细胞黏附率，并保留了与天然牙髓细胞外基质相似的多孔胶原结构；②与天然牙髓细胞外基质相比，免疫组化染色显示可注射牙髓细胞外基质材料中层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和整合素β1的表达没有显著变化，而纤连蛋白的表达显著下降；③体内实验显示，可注射牙髓细胞外基质材料具有优异的成血管能力，并促进了牙髓样组织的形成。结果表明，研磨处理的可注射牙髓细胞外基质材料可促进牙髓再生。

https://orcid.org/0000-0002-3416-0585 (陈岗)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 研磨, 人牙髓干细胞, 细胞外基质, 可注射, 牙髓组织再生, 支架材料

Abstract: BACKGROUND: In the preparation of injectable extracellular matrix materials, most of the materials require pepsin digestion followed by combination with other matrix components like hydrogels for pulp tissue regeneration, which also means the destruction of the microenvironment retained by natural extracellular matrix materials.
OBJECTIVE: To investigate the effect of injectable dental pulp extracellular matrix prepared by grinding treatment on the regeneration of dental pulp tissue.
METHODS: (1) The dental pulp tissue from pig teeth was prepared into acellular dental pulp matrix materials after acellular treatment. After freezing in liquid nitrogen and high-speed grinding, the injectable dental pulp extracellular matrix was prepared. Then, the differences in cell adhesion efficiency and microstructure between the injectable dental pulp extracellular matrix and natural dental pulp extracellular matrix were compared. Immunohistochemical analysis was used to analyze extracellular matrix protein components in injectable dental pulp extracellular matrix. (2) Injectable dental pulp extracellular matrix material inoculated with dental pulp stem cells was injected into the dental pulp cavity constructed from the dentin matrix material. The samples were obtained after 1, 3, and 5 weeks of subcutaneous implantation in nude mice to observe the in vivo conversion rate of injectable dental pulp extracellular matrix materials and the regeneration ability of ectopic dental pulp tissue under the skin of nude mice.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the dental pulp extracellular matrix, the injectable dental pulp extracellular matrix significantly improved the cell adhesion rate and retained the porous collagen structure similar to that of natural dental pulp extracellular matrix. (2) Compared with the natural dental pulp extracellular matrix, immunohistochemical staining showed that there was no significant difference in the expression of fibronectin, collagen type I, and integrin β1 in the injectable dental pulp extracellular matrix, while the expression of fibronectin was significantly decreased. (3) In vivo experiments show that the injectable dental pulp extracellular matrix has excellent angiogenesis ability and promotes the formation of pulp-like tissues. The results exhibit that the milled injectable dental pulp extracellular matrix can still be used as an effective scaffold for the regeneration of dental pulp.

Key words: grind, human dental pulp stem cell, extracellular matrix, injectable, pulp tissue regeneration, stent material

中图分类号:

杨毓茜, 李文俊, 赵健, 陈岗. 研磨处理可注射牙髓细胞外基质促进牙髓再生[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(22): 4663-4670.

Yang Yuqian, Li Wenjun, Zhao Jian, Chen Gang. Injectable dental pulp extracellular matrix prepared by grinding treatment for dental pulp regeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(22): 4663-4670.

图/表（结果） 5

2.1 可注射牙髓细胞外基质的制备与表征牙髓细胞外基质经过研磨、收集和灭菌处理后被制成可注射牙髓细胞外基质，其流动性和可塑性均得到有效改善，见图2A。对可注射牙髓细胞外基质中保留的层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、整合素β1和纤连蛋白等细胞外基质成分进行分析，见图2B。其中，层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和整合素β1这3种蛋白质的表达没有显著变化，而纤连蛋白的表达在研磨后显著降低(P < 0.05)。

2.2 可注射牙髓细胞外基质显微结构应用扫描电子显微镜观察到可注射牙髓细胞外基质的胶原纤维结构与牙髓细胞外基质所不同，呈被压缩状态，但仍保留了与牙髓细胞外基质相似的结构，见图3A-D。
2.3 可注射牙髓细胞外基质的生物相容性从人类牙齿中提取的牙髓干细胞呈典型的纺锤状，在培养过程中状态良好，具有贴壁的生长特性，细胞形态稳定，具有良好的增殖能力，见图3E。制备的牙髓细胞外基质呈白色半透明，且保留了天然牙髓组织的整体形状，见图3F。为观察细胞黏附情况，将牙髓干细胞分别接种于牙髓细胞外基质和可注射牙髓细胞外基质上，得到细胞黏附率分别为(63.7±12.5)%和(85.0±4.1)%，可注射牙髓细胞外基质显著提高了细胞黏附率，见图3G。为观察细胞分布情况，制备牙髓细胞外基质/牙髓干细胞和可注射牙髓细胞外基质/牙髓干细胞切片用于DAPI染色，以正常牙髓组织的染色结果作为对照组，结果显示可注射牙髓细胞外基质中的细胞分布更均匀，且与牙髓组织中正常的细胞分布相似，而牙髓细胞外基质中的细胞主要局限于材料表面，见图3H-J。

2.4 可注射牙髓细胞外基质用于异位牙髓再生效果分析为评估可注射牙髓细胞外基质作为牙髓再生支架的可行性，将接种牙髓干细胞的可注射牙髓细胞外基质注入牙本质基质并植入裸鼠皮下，分别于1，3，5周取材，见图4A。结果显示，裸鼠皮下移植部位的皮肤无坏死和其他并发症，植入物表面可见丰富的血管组织，证明其具有良好的生物相容性。苏木精-伊红染色结果显示组织正在逐渐从体内植入的材料两端重建，见图4B。图4C展示了血管再生的过程。

第5周的苏木精-伊红染色图像显示，可注射牙髓细胞外基质组软组织与牙本质基质交界处可以观察到成牙本质层样组织，见图5A，这与牙髓细胞外基质组观察到的结果相似[15]。通过Masson三色染色进一步证实，可注射牙髓细胞外基质组和牙髓细胞外基质组都可以产生丰富的新生血管组织，且每平方毫米的血管数量没有统计学差异，见图5B。结果表明，可注射牙髓细胞外基质既可以保持牙髓再生的能力，又不影响血管新生。

新生的牙髓样组织经免疫组化分析显示，牙髓细胞外基质组和可注射牙髓细胞外基质组牙髓样组织Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白、牙本质涎蛋白呈阳性表达，见图6。此外，两组均未检测到人线粒体的表达，考虑植入的牙髓干细胞在组织再生改建过程中消失的可能。磷酸盐缓冲液作为空白对照，免疫组化结果呈阴性。

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引言

牙髓再生被认为是一种有效修复牙齿受损结构的生物治疗方法[1]，这种实现牙髓组织再生的组织工程方法需要基于干细胞、三维支架材料和生化分子之间的相互作用。其中，支架材料不仅可以为干细胞生长提供临时的三维环境，还能模拟组织微环境，以增强干细胞的增殖能力[2]。细胞外基质是一种天然衍生支架材料，含有胶原蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、生长因子和细胞因子等多种天然成分[3-5]，这些天然成分能刺激细胞黏附、分化和增殖，促进血管生成，从而有效促进组织再生[6-8]。目前，许多异种或同种的细胞外基质产品如小肠[9]、心包[10]、真皮[11]、胶原蛋白基质[12]、骨基质[13]、软组织基质等已实现商业化[14]。
在以往研究中，牙髓细胞外基质(dental pulp extracellular material，DPEM)已被证明是一种具有良好组织特异性的有效支架材料[15-16]。目前，用于牙髓再生研究的牙髓细胞外基质主要包括两种形态：一种是保留原有牙髓组织形态的块状支架材料，具有原有的纤维组织空间结构，能促进牙髓组织再生[17]，然而这种形态的支架材料并不便于实际临床操作，同时存在支架材料髓腔充填后余留空隙的问题；另一种是可注射形态的牙髓细胞外基质支架材料，目前这种注射形态的支架材料大多需要经过胃蛋白酶消化处理并与其他材料结合使用，如可注射式水凝胶[18]、透明质酸水凝胶[19-20]、胶原蛋白水凝胶[21-22]、明胶水凝胶[23-24]、多肽水凝胶等[25-26]，这些可注射材料具有良好的适应性和塑形能力，更适用于复杂狭窄根管的注射[27]。但是胃蛋白酶消化处理可降低材料本身黏度和改变其流变性，导致更多细胞外基质蛋白的损失，改变组织微环境。因此，课题组拟通过研磨等物理处理措施获得一种可注射牙髓细胞外基质(injectable dental pulp extracellular material，In-DPEM)，并评估这种可注射牙髓细胞外基质对牙髓组织再生的效果[28]。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验与动物体内实验，组间比较采用学生配对t检验、单因素方差分析。首先使用猪牙髓组织制备牙髓细胞外基质，然后液氮冷冻，利用高速研磨机将其制备成可注射牙髓细胞外基质。将可注射牙髓细胞外基质与人牙髓干细胞混合，注入到预处理的牙本质基质模拟的牙髓腔中，移植到裸鼠皮下1，3，5周，以评估研磨处理的可注射牙髓细胞外基质对牙髓再生的影响。实验设计的示意图如图1所示。

1.2 时间及地点实验于2018年3月至2023年1月在大连医科大学附属第一医院中心实验室和大连医科大学人类疾病基因工程动物模型研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞人牙髓干细胞来自因临床治疗需要拔除的智齿牙髓组织，后续实验使用的细胞均为复苏的第4-6代细胞，其生长特性、细胞表型、分化能力均符合间充质干细胞鉴定标准[12]。所用人体组织符合大连医科大学附属第一医院的相关伦理要求(PJ-KS-KY-2019-174)。在获得临床治疗需要拔除的智齿时均已告知患者本人并获得知情同意。
1.3.2 实验试剂 1%十二烷基硫酸钠(Bio-Rad，美国)；1% Triton X-100(Sigma，美国)；青霉素-链霉素溶液(Hyclone，美国)；牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)抗体(1∶100，Abcam，美国)；层粘连蛋白(laminin，LN)抗体(1∶50，Abcam，美国)；Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ，Col-1)抗体(1∶200，Bioss，美国)；纤连蛋白(fibronectin，FN)抗体(1∶200，Abcam，美国)；整合素β1抗体(1∶200，Abcam，美国)；Alexa Fluor 488/555山羊抗小鼠(1∶500，Invitrogen，美国)；人线粒体抗体(1∶100，Millipore，美国)；金喷雾涂层(ES-2030，日本东京日立)；胎牛血清(Omega，美国)；α-MEM培养基(HAKATA，美国)；2-(4-氨基苯基)-6-吲哚卡巴米定二盐酸(DAPI) (Beyotime，中国)；乙二胺四乙酸(Sigma，美国)；苏木精-伊红染色试剂盒和Masson三色染色试剂盒(巴斯诊断公司，中国)；DAB试剂盒(Gene Tech，中国)。
1.3.3 实验仪器显微外科剪刀(中国上海金钟)；细胞计数板(Qiujing，中国)；研磨机(中国上海静新)；冷冻干燥机(Boyikang，中国)；扫描电子显微镜(蔡司，德国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)。
1.3.4 实验动物雄性BALB/c-nu小鼠18只，SPF级，8周龄，体质量18-22 g，购于北京维通利华技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0006。动物实验方案经大连医科大学动物实验伦理委员会批准，审批号为AEE19095。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.4 实验方法
1.4.1 可注射牙髓细胞外基质的制备从市场购买的3个新鲜猪下颌骨(6-8月龄)的恒牙胚中提取牙髓组织后，用PBS清洗去除表面杂质，然后放入1%十二烷基硫酸钠中处理12 h，随后在含1% Triton X-100的蒸馏水中浸泡30 min，具体步骤见先前的研究[15，29]。将处理后的牙髓细胞外基质在青霉素-链霉素溶液中浸泡灭菌96 h，然后用显微外科剪刀剪成小块，经液氮冷冻2 min，高速研磨机研磨2 min，6 000 r/min离心收集得到可注射牙髓细胞外基质。
1.4.2 可注射牙髓细胞外基质的特性
(1)免疫组化分析可注射牙髓细胞外基质中的细胞外基质蛋白质成分：染色方法参照先前的研究[15]。首先，将样品在液氮中固定5 min，然后在-20 ℃切成5 μm厚的切片。将制备好的切片在室温下干燥15 min，经过阻断后与一抗共同孵育1 h，分别为层粘连蛋白抗体(1∶50)、Ⅰ型胶原蛋白抗体(1∶200)、纤连蛋白抗体(1∶200)、整合素β1抗体(1∶200)，PBS清洗2遍，在37 ℃下将切片与二抗(Alexa Fluor 488/555山羊抗小鼠，1∶500)共同孵育2 h，然后用DAPI进行染色，使用倒置显微镜拍摄图像，Image J软件测量平均吸光度值。
(2)扫描电镜分析可注射牙髓细胞外基质的表面结构：将制备好的样品在PBS中清洗15 min，然后用冷冻干燥机处理12 h，样本经金喷雾涂层处理，使用场发射扫描电子显微镜进行观察。
1.4.3 细胞实验
(1)牙髓干细胞培养：牙髓组织来源于临床上出于治疗目的拔除的人类牙齿。将牙髓组织在超净台上切成块状，PBS洗涤3次，将组织块放在含有体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基中，接种于25 cm²培养瓶，在37.5 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育，每2 d更换1次培养基，当人牙髓干细胞汇合度达到 80%-90%时，加入2 mL 0.25%Trypsin-EDTA消化3 min，于倒置显微镜下观察70%-80%细胞变圆缩小后立即加入α-MEM完全培养基终止胰酶消化，用移液器将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入2 mL α-MEM完全培养基，重悬细胞沉淀。将重悬细胞接种于2个75 cm²培养瓶中进行传代。实验中使用第4-6代细胞。
(2)可注射牙髓细胞外基质的细胞黏附性：通过计算培养基中未黏附细胞的占比来评估材料的细胞黏附能力。将5×104个牙髓干细胞分别接种于内含牙髓细胞外基质或可注射牙髓细胞外基质的24孔板中(n=4)，培养18 h后离心收集培养基中的细胞，使用细胞计数板计算获得非黏附细胞数，附着在支架上的细胞数量与接种细胞数量的百分比即为细胞黏附率。
(3)可注射牙髓细胞外基质上的细胞分布情况：将1×105个牙髓干细胞与1 mL可注射牙髓细胞外基质搅拌混合后离心5 min，然后于微量离心管中静置24 h，离心收集可注射牙髓细胞外基质/细胞团块，经液氮冷冻
2 min，冷冻包埋剂包埋，将其切成5 μm厚的冷冻切片。组织切片在PBS中洗涤2次，每次5 min，然后在室温下用体积分数3% H2O2阻断10 min，使用DAPI染色3 min，倒置荧光显微镜观察支架上细胞的分布情况。
1.4.4 动物实验
(1)处理后牙本质基质的制备：采用牙本质基质作为硬组织支架来模拟牙髓腔[30]。首先，用机械方法去除猪前牙中的牙骨质、前期成牙本质和牙髓，然后将其在蒸馏水中超声清洗300 s，用17%乙二胺四乙酸处理10 min，10%乙二胺四乙酸处理10 min，5%乙二胺四乙酸处理5 min，最后将牙本质基质浸泡在青霉素-链霉素溶液中，放置在37.5 ℃下灭菌96 h[31]。
(2)异位移植：用1 mL注射器将1×105个/mL牙髓干细胞与0.5 mL可注射牙髓细胞外基质注入牙本质基质模拟构建的牙髓腔中制备成牙髓再生复合体(n=3)，植入到裸鼠(8周龄)皮下1，3，5周，验证可注射牙髓细胞外基质用于牙髓再生的可行性。同时，牙髓细胞外基质复合牙本质基质(n=3)植入裸鼠皮下1，3，5周，作为对照。每组每个时间点3只裸鼠。
(3)组织学分析：取出裸鼠皮下的植入物，在40 g/L多聚甲醛中浸泡24 h，经过常规处理后，制成5 μm厚的切片，然后进行苏木精-伊红染色和Masson三色染色，使用Image J软件计算血管的数量。
(4)免疫组化分析：用于免疫组化染色的一抗包括牙本质涎蛋白(1∶100)、层粘连蛋白(1∶50)、Ⅰ型胶原蛋白(1∶200)、人线粒体(1∶100)。所有抗体均按照制造商的说明使用。阴性对照组用磷酸盐缓冲液代替一抗。将制备好的切片在室温下干燥15 min，经过阻断后与一抗共同孵育1 h，PBS清洗2遍，在37 ℃下将切片与二抗(Alexa Fluor 488/555山羊抗小鼠，1∶500)共同孵育2 h，DAB显色，使用倒置显微镜拍摄图像，Image J软件测量平均吸光度值。
1.5 主要观察指标 ①可注射牙髓细胞外基质中的细胞外基质蛋白质成分；②可注射牙髓细胞外基质的表面结构；③人牙髓干细胞的形态变化及增殖情况；④可注射牙髓细胞外基质的细胞黏附性；⑤可注射牙髓细胞外基质上的细胞分布情况；⑥可注射牙髓细胞外基质异位移植后的组织学分析和免疫组化分析结果。
1.6 统计学分析所有数据均以x±s表示。使用SPSS 11.5软件(SPSS，美国)进行统计学分析，用学生配对t检验和单因素方差分析确定显著性水平。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过大连医科大学医学研究院统计学专家审核。

讨论

根据之前的研究，牙髓细胞外基质能够为细胞生长提供合适的空间结构和生化微环境[15，32]，从而有利于组织再生和修复。因为人类牙齿的牙髓腔具有丰富的形态特征，所以注射型的牙髓细胞外基质更适合于不同形态的牙髓腔内材料移植[18]。
研究显示，不同组织的胶原结构对材料的力学性能有重要影响，同时也会影响细胞行为[33]。牙髓细胞外基质中的胶原空间结构为牙髓再生提供了独特的微环境。该研究探讨了可注射牙髓细胞外基质的生物活性并观察了其超微结构。免疫组化结果显示，可注射牙髓细胞外基质能够保留如层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、整合素β1和纤连蛋白等重要蛋白质，但层粘连蛋白的分布和纤连蛋白的数量有所改变。值得注意的是，纤连蛋白作为一种关键的细胞外基质蛋白质，在可注射牙髓细胞外基质组显著下降，分析其原因可能因为机械应力作用，在组织冷冻研磨的处理过程中，机械应力导致纤连蛋白的结构性改变或破坏，使其含量显著减少。纤连蛋白减少对细胞黏附有一定影响，但对组织再生的影响需要进一步研究。胃蛋白酶处理虽然可以降低黏度和改善流变特性，减少抗原和免疫原性，但是也会丧失原有组织的空间结构，影响组织的再生和修复效果。扫描电子显微镜显示，可注射牙髓细胞外基质的胶原纤维结构比原始牙髓细胞外基质更为紧密，与化学溶解处理的牙髓细胞外基质不同[10]，后者不涉及细胞外基质空间结构[34-35]。研磨处理的可注射细胞外基质材料与现有的注射型细胞外基质材料相比，可能在保持天然结构和生物活性方面具有优势，但在质量控制和安全性方面还需进一步研究。
静态接种技术仅能使接种的细胞黏附在牙髓细胞外基质表面，使细胞向材料内部迁移生长过程缓慢[15]。初始细胞的接种密度和接种方式对细胞外基质合成和细胞分化具有显著影响[36]。与其他注射材料相似，可注射牙髓细胞外基质可以通过搅拌方式来接种细胞，从而加速细胞迁移并提高细胞黏附率。在牙髓再生领域，由于根管形态狭窄，全长根管内生成牙髓组织仍具有挑战性[37]。该研究制备的可注射牙髓细胞外基质可以容易且完整地注入管腔内，而在块状牙髓细胞外基质的管腔内能观察到明显的残留空间，这是可注射牙髓细胞外基质作为牙髓再生支架的优点之一。
牙本质基质被广泛应用于牙髓再生领域，是一种有效的牙髓再生硬组织支架材料。作为牙髓再生模型，为成功实现组织再生，可通过机械方法扩大牙本质基质的髓腔侧空间以便足够的血液和营养供应[27，38]。而可注射牙髓细胞外基质可以顺利注入狭窄的牙髓腔内，提高了材料的移植效率，组织学结果显示可注射牙髓细胞外基质植入体内从第1周到第5周逐渐发生改建，在第5周时能观察到完整且有血管的牙髓组织。由于血液供应有限，牙髓再生构建过程由根尖向材料内部逐渐完成，因此推测在早期植入材料内部的干细胞因营养供应不足出现凋亡，这也是免疫组化显示人线粒体阴性表达的可能原因 [38-39]。
可注射牙髓细胞外基质组软组织与牙本质基质交界处可以观察到成牙本质层样结构[15]。此外，蛋白质的分布和表达变化并未影响牙髓组织中血管的形成，因此诸如Matrigel等许多可注射材料得以用作牙髓再生支架[40]。该研究中，可注射牙髓细胞外基质在异位植入过程中产生了类牙髓组织，其中Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白和牙本质涎蛋白呈阳性表达。层粘连蛋白是基底膜的关键结构和生物活性组分，在前成牙本质细胞中表达，并能调节牙本质细胞的分化[41]。Ⅰ型胶原蛋白和牙本质涎蛋白在牙髓-牙本质复合体中表达[42]。综上所述，研磨处理的可注射牙髓细胞外基质是一种有前景可注射支架材料。
结论：①可注射牙髓细胞外基质材料显著提高了牙髓细胞外基质的细胞黏附率，并保留了与牙髓细胞外基质相似的多孔胶原结构；②免疫组化染色显示与牙髓细胞外基质相比，可注射牙髓细胞外基质材料中层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和整合素β1的表达没有显著变化，而纤连蛋白的表达显著下降；③体内实验显示，可注射牙髓细胞外基质材料具有优异的成血管能力，并促进了牙髓样组织的形成。结果表明，研磨处理的可注射牙髓细胞外基质材料可以作为牙髓再生的有效可注射支架材料。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

研磨处理可注射牙髓细胞外基质促进牙髓再生

Injectable dental pulp extracellular matrix prepared by grinding treatment for dental pulp regeneration

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