多次超数排卵对小鼠和人卵母细胞发育潜能的影响

doi:10.12307/2024.125

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (19): 3018-3023.doi: 10.12307/2024.125

• 细胞相关实验/试验研究Cell related experimental/trial studies • 上一篇下一篇

多次超数排卵对小鼠和人卵母细胞发育潜能的影响

李崇1，沈小力1，杨静薇1，郭晶2，谢娟1，黄国宁1，李竞宇1

1重庆医科大学附属妇女儿童医院生殖医学中心，人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆市 400013；2 吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省长春市 130118

收稿日期:2023-02-14 接受日期:2023-04-04 出版日期:2024-07-08 发布日期:2023-09-26
通讯作者: 李竞宇，博士，副研究员，重庆医科大学附属妇女儿童医院生殖医学中心，人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆市 400013 黄国宁，主任医师，重庆医科大学附属妇女儿童医院生殖医学中心，人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆市 400013
作者简介:李崇，男，1990年生，汉族，2016年华南农业大学毕业，硕士，助理研究员，主要从事早期胚胎发育方面的研究。沈小力，女，1986年生，汉族，2015年瑞士巴塞尔大学毕业，博士，副主任医师，主要从事辅助生殖技术方面的研究。
基金资助:
重庆市自然科学基金面上项目(cstc2021jcyj-msxmX0823)，项目负责人：李崇；重庆市妇幼保健院院级课题面上项目(2020YJMS03)，项目负责人：李崇

Effects of repeated superovulation on developmental potential of oocytes in mice and humans

Li Chong1, Shen Xiaoli1, Yang Jingwei1, Guo Jing2, Xie Juan1, Huang Guoning1, Li Jingyu1

1Key Laboratory of Human Embryo Engineering, Center for Reproductive Medicine, Hospital for Women and Children, Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China; 2College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin Province, China

Received:2023-02-14 Accepted:2023-04-04 Online:2024-07-08 Published:2023-09-26
Contact: Li Jingyu, MD, Associate researcher, Key Laboratory of Human Embryo Engineering, Center for Reproductive Medicine, Hospital for Women and Children, Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China Huang Guoning, Chief physician, Key Laboratory of Human Embryo Engineering, Center for Reproductive Medicine, Hospital for Women and Children, Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China
About author:Li Chong, Master, Research assistant, Key Laboratory of Human Embryo Engineering, Center for Reproductive Medicine, Hospital for Women and Children, Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China Shen Xiaoli, MD, Associate chief physician, Key Laboratory of Human Embryo Engineering, Center for Reproductive Medicine, Hospital for Women and Children, Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Chongqing, No. cstc2021jcyj-msxmX0823 (to LC); Special Research Project of Chongqing Health Center for Women and Children, No. 2020YJMS03 (to LC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

超数排卵：通过给雌性供体注射外源性促性腺激素，诱发卵巢和多个卵泡的发育，并排出具有受精能力卵母细胞的方法，广泛应用于生殖生物学、胚胎工程学以及辅助生殖技术。
形态动力学参数：应用时差(time-lapse)图像评估的胚胎形态动力学参数，包括2细胞、4细胞、8细胞、桑葚胚、囊胚形成的时间，对评估胚胎的发育潜能有一定参考价值。

背景：超数排卵是辅助生殖技术中常见的治疗方法。在临床实践中，一些患者需要经过多次超数排卵怀孕。

目的：探讨多次超数排卵对小鼠和人卵母细胞发育潜能的影响。
方法：采用动物实验和临床回顾性研究。动物实验选择90只SPF级ICR 8周龄雌性小鼠，随机分为3组，分别进行1次、3次和5次超数排卵。在临床研究中共纳入306例接受3个体外受精周期的患者，比较不同周期的获卵数和胚胎发育情况。

结果与结论：①在动物实验中，多次超数排卵不影响小鼠胚胎的发育率和发育速度，且对小鼠囊胚细胞凋亡、DNA损伤、内细胞团和滋养外胚层的形成均无显著影响(P > 0.05)；②在临床研究中，3个周期内获得的卵母细胞数(8.60±5.04，8.58±4.87及8.38±4.63，P=0.81)和可移植胚胎数(2.42±1.99，2.40±1.92及2.64±2.00，P=0.26)均无显著差异；③对于年轻组(< 35岁)和高龄组(≥ 35岁)，胚胎质量不受超数排卵次数的影响(P > 0.05)；④结果显示：多次超数排卵不影响小鼠和人卵母细胞的发育潜能。

https://orcid.org/0000-0003-0136-532X (李竞宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 多次超数排卵, 体外受精, 卵母细胞, 发育潜能

Abstract: BACKGROUND: Superovulation is a common therapy in assisted reproductive technology. In clinical practice, some patients experience repeated superovulation to get pregnant.
OBJECTIVE: To explore the effect of repeated superovulation on the developmental potential of oocytes in mice and humans.
METHODS: Both animal experiments and retrospective clinical research were conducted. The animal study involved 90 SPF grade ICR 8-week-old female mice, who were randomly divided into three groups for 1, 3, and 5 superovulations, respectively. The clinical study involved 306 patients who had undergone three consecutive in vitro fertilization cycles. The number of ovules obtained and embryonic development in different cycles were compared.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The animal study indicated that repeated superovulation did not affect the embryonic development or developmental speed of mouse embryos. Similarly, there was no significant difference in the mouse blastocyst apoptosis, DNA damage, or the formation of inner cell mass and trophectoderm (P > 0.05). (2) The clinical study also revealed no significant differences in the number of retrieved oocytes (8.60±5.04, 8.58±4.87, and 8.38±4.63, P=0.81) and transferable embryos (2.42±1.99, 2.40±1.92, and 2.64±2.00, P=0.26) over the three cycles. (3) In both the young group (< 35 years) and the old group (≥ 35 years), the embryo quality was not affected by repeated superovulation (P > 0.05). (4) These findings show that repeated superovulation does not affect the developmental potential of oocytes in mice and humans.

Key words: repeated superovulation, in vitro fertilization, oocyte, developmental potential

中图分类号:

李崇, 沈小力, 杨静薇, 郭晶, 谢娟, 黄国宁, 李竞宇. 多次超数排卵对小鼠和人卵母细胞发育潜能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3018-3023.

Li Chong, Shen Xiaoli, Yang Jingwei, Guo Jing, Xie Juan, Huang Guoning, Li Jingyu. Effects of repeated superovulation on developmental potential of oocytes in mice and humans[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(19): 3018-3023.

图/表（结果） 6

2.1 多次超数排卵对小鼠胚胎质量的影响
2.1.1 多次超数排卵对小鼠胚胎发育率的影响为了研究多次超数排卵对卵母细胞发育潜能的影响，收集超数排卵1次、多次超数排卵3次、多次超数排卵5次小鼠的成熟卵母细胞进行体外受精，见图1A。结果显示，3组间的受精率(61.46%，71.02%和66.67%，P=0.50)、2细胞率(86.51%，93.53%和89.68%，P=0.74)、4细胞率(97.25%，97.87%和93.81%，P=0.25)、8细胞率(92.66%，92.02%和87.61%，P=0.26)和囊胚形成率(71.36%，74.62%和66.88%，P=0.59)均无显著差异(P > 0.05)，见图1B，C。

2.1.2 多次超数排卵对小鼠囊胚细胞数目的影响收集小鼠囊胚进行免疫荧光染色，分别用OCT4和CDX2对囊胚内细胞团和滋养外胚层进行标记。结果显示，多次超数排卵不影响小鼠囊胚细胞总数(81.55±10.01，83.50±15.96和81.71±17.07，P=0.94)、内细胞团数目(19.82±8.15，19.50±4.62和20.14±4.60，P=0.98)、滋养外胚层数目(61.73±10.63，64.00±16.05和61.58±13.94，P=0.90)，同时对内细胞团/滋养外胚层比例(0.24±0.09，0.24±0.06和0.25±0.04，P=0.97)也无显著影响(P > 0.05)，见图2。

2.1.3 多次超数排卵对小鼠胚胎形态动力学的影响胚胎的发育形态动力学参数在一定程度上代表了胚胎的质量，利用胚胎延时培养系统对3组小鼠胚胎的发育速度和形态进行评估，结果表明多次超数排卵不影响胚胎的形态及发育速度，见图3。

2.1.4 多次超数排卵对小鼠胚胎细胞凋亡和DNA损伤的影响利用免疫荧光检测小鼠囊胚中细胞凋亡和DNA损伤的水平。结果显示，3组囊胚的凋亡细胞比例[(2.22±2.09)%，(3.49±2.65)%和(2.31±1.89)%，P=0.36]和DNA损伤阳性γH2Ax点位数目(84.81±23.87，86.14±16.21和92.33±12.03，P=0.53)无显著差异，见图4。

2.2 多次超数排卵对人类胚胎质量的影响为了验证动物实验的结果，该研究纳入了306例完成了3个连续体外受精周期的女性患者进行了回顾性分析，每个患者都作为自身对照。患者的基本特征见表1。

患者3次周期的第3天血清促卵泡激素、黄体生成素、抗苗勒管激素及雌二醇水平均无显著差异(P > 0.05)。第3个周期开始时，这些患者年龄平均增加了2岁，每个周期年龄之间有显著差异(P < 0.05)，每2次周期之间的时间间隔无显著差异。在3个周期中获卵总数(8.60±5.04，8.58±4.87和8.38±4.63，P=0.81)和MⅡ获卵数(7.44±4.61，7.30±4.35和6.93±3.94，P=0.32)没有显著差异，每个周期平均获卵8.52枚，平均MⅡ卵母细胞7.22枚。此外，第3天可移植胚胎的数量(2.42±1.99，2.40±1.92和2.64±2.00，P=0.26)在3个周期内没有显著差异。在促排方案上，第1周期GnRH-激动剂方案占比80.7%，第2周期下降至38.6%，第3周期下降至24.8%，GnRH-拮抗剂方案相应增加。
为了研究年龄分组的影响，按照第1个周期开始时的年龄将患者分为2组：< 35岁(n=215)和≥35岁(n=91)。对于不同年龄分组，连续周期中的总获卵数、MⅡ卵母细胞获卵数和可移植胚胎的数量没有显著差异，见表2。

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引言

由于环境污染、不良生活方式及生殖卫生保护缺失等因素，不孕症人数逐年上升。中国不孕不育率从2007的12%攀升到2020年的18%左右，患者人数超过4 000万[1-2]。越来越多的患者借助辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)来治疗不孕症。辅助生殖技术的第一步是超数排卵，即通过使用外源促性腺激素诱导卵泡生长和卵母细胞成熟[3-4]。尽管在过去40年中辅助生殖技术取得了一系列的突破，但辅助生殖技术的成功率及每个移植胚胎的平均出生率依然很低，约为23%[5-6]。因此，在临床上许多患者可能需要经历多个排卵周期才能获得足够多的可移植胚胎[7-8]。高剂量外源激素的使用改变了人体自然的激素环境，多次反复刺激对女性生殖来讲可能存在一些风险[9]。基于此，对多次超数排卵的安全性进行评估十分有必要。
关于超数排卵对生育力的影响，不同研究一直存在不同观点。动物研究表明，超数排卵尤其是多次使用激素会对卵巢功能产生不利影响[10-12]。在小鼠研究中发现，多次超数排卵引起的卵巢刺激会诱导卵巢氧化损伤、诱发线粒体DNA突变及损伤颗粒细胞线粒体功能，导致卵母细胞质量下降、DNA甲基化模式紊乱、组蛋白修饰水平改变等[13-16]。然而，多项临床研究表明，多次超数排卵后患者卵巢反应和获得的卵母细胞数量没有显著下降，通过调整治疗方案后患者的优质胚胎率和妊娠结局显著升高[17-19]。前期关于多次超数排卵影响的研究多集中于比较激素刺激和自然状态下的卵巢差异，对于应用辅助生殖技术的患者，很少有研究关注多个超排卵周期之间卵巢储备是否存在影响。
该研究旨在探讨多次超数排卵对卵母细胞发育潜能的影响。利用小鼠建立多次超数排卵模型，探讨多次超数排卵对胚胎发育、囊胚DNA损伤、细胞凋亡、内细胞团和滋养外胚层形成的影响。此外，对306例进行了3次体外受精周期的患者进行了回顾性分析，评估多次超数排卵对人卵巢储备和卵母细胞发育潜能的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验和临床回顾性研究。
1.2 时间及地点动物实验于2021年1-10月在重庆市妇幼保健院人类胚胎工程重庆市重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级8周龄雌性ICR小鼠90只和10周龄雄性ICR小鼠30只均购自斯贝福(北京)生物科技有限公司，体质量25-30 g，饲养于重庆市妇幼保健院实验动物中心。实验动物使用许可证号：SYXK(渝)2021-0004，动物合格证号：1103242200104034725。每日光照12 h，黑暗12 h，自由饮食，雌雄分笼饲养。该研究经重庆市妇幼保健院实验动物福利伦理委员会批准(批准号：CQFY2020001)。
1.3.2 临床数据收集收集2016年1月至2021年12月在重庆市妇幼保健院接受连续3个体外受精周期的患者资料进行回顾性分析。共纳入306例首个体外受精周期年龄在22-45岁之间的患者，接受GnRH-激动剂方案或GnRH-拮抗剂方案，经阴道取卵并进行随后的胚胎培养。排除标准：多囊卵巢综合征、卵巢功能减退、卵巢子宫内膜异位囊肿、卵母细胞玻璃化冷冻、植入前基因检测周期和染色体异常。该研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则，经重庆市妇幼保健院伦理委员会批准(批准号：2022-RGI-12)。所有患者均签署知情同意书。
1.4 实验方法
1.4.1 多次超数排卵雌性ICR小鼠随机分为3组，每组30只：①腹腔注射10 IU孕马血清促性腺激素(宁波激素二厂)，48 h后注射10 IU人绒毛膜促性腺激素(宁波激素二厂)超数排卵1次(S1)；②腹腔注射10 IU 孕马血清促性腺激素，48 h后注射10 IU人绒毛膜促性腺激素超数排卵3次，每次间隔7 d(S3)；③腹腔注射10 IU 孕马血清促性腺激素，48 h后注射10 IU 人绒毛膜促性腺激素超数排卵5次，每次间隔7 d(S5)。促排卵结束后，各组小鼠按照动物福利进行安乐死，取出输卵管用于后续实验操作。
1.4.2 体外受精和胚胎培养雌性ICR小鼠腹腔注射人绒毛膜促性腺激素14-16 h后在麻醉状态下通过颈椎脱位法处死。从输卵管壶腹部取出卵丘-卵母细胞复合体，放入含有获能精子的HTF培养基(Sigma公司)中。精子由雄鼠附睾尾部取出后在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱的HTF培养基中提前获能1 h。卵丘-卵母细胞复合体在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中受精6 h，收集具有2个原核的受精卵，在KSOM培养基(Sigma公司)中37 ℃、体积分数5%CO2条件下进行培养。使用Vitrolife EmbryoScope系统(丹麦Unisense Fertilitech)记录胚胎发育速度。以原核破裂时间记为0点，t2为2细胞分裂时间，t3为3细胞分裂时间，以此类推。
1.4.3 免疫荧光和共聚焦显微镜观察随机收集各组囊胚，在室温下用40 g/L多聚甲醛(Invitrogen公司)固定30 min，然后在含有0.5% Triton X-100(Sigma公司)和0.1%聚乙烯醇(Sigma公司)的PBS(Hyclon公司)中透膜15 min，用含3%牛血清白蛋白(Sigma公司)的PBS封闭1 h后，囊胚与含一抗[CDX2(1∶200)，CST公司；OCT4(1∶100)，Santa公司；γH2Ax(1∶200)，CST公司]的封闭液4 ℃孵育过夜，使用含0.1%吐温-20(Sigma公司)和0.01% Triton X-100的PBS清洗液洗涤3次，囊胚与荧光二抗[Alexa Fluor® 488山羊抗鼠(1∶500)，Invitrogen公司；Alexa Fluor® 488山羊抗兔(1∶500)，Invitrogen公司；CY3山羊抗兔(1∶200)，Sevicebio公司]室温孵育1 h，清洗液洗涤3次，囊胚用Hoechst 33342(Invitrogen公司)复染15 min，清洗液洗涤3次；最后，将囊胚放置在载玻片上的抗荧光淬灭剂(碧云天)中压片并使用激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)进行观察。免疫荧光的荧光强度用ImageJ软件进行计算。
1.4.4 细胞凋亡检测随机收集各组囊胚，在40 g/L多聚甲醛中固定30 min，在含有0.5% Triton X-100和0.1%聚乙烯醇的PBS中室温孵育15 min进行透膜处理，囊胚与一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂(碧云天)在37 ℃下孵育1 h，然后用含0.1%聚乙烯醇的PBS洗涤3次，囊胚用Hoechst 33342染色15 min，用清洗液洗涤3次，然后在载玻片上压片。使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。
1.5 主要观察指标小鼠胚胎发育率、形态动力学参数、囊胚细胞数目及凋亡情况。临床患者获卵数及胚胎发育情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 18.0进行数据统计分析。计量资料用x±s表示，采用t检验统计；计数资料用构成比或率(%)表示，采用χ2检验统计，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过重庆市妇幼保健院生物统计学专家审核。

讨论

超数排卵广泛应用于人类和动物以获得更多可用的卵母细胞，许多不孕女性为了孕育一个健康的婴儿，会经历不止一次的外源性激素刺激周期[19]。同样，经济动物养殖中也采用多次超排卵的方法，以提高雌性动物的利用率[20-22]。与自然状态相比，经历多次超数排卵的外源激素反复刺激，雌性的输卵管及子宫内分泌受到影响，在体内完成受精过程的卵母细胞发育潜能也可能受到影响[23-24]。因此，该研究分别对小鼠进行1，3和5次超数排卵，采用了体外受精的方法避免了外源激素对受精环境的影响。为了排除精子相关因素对结果的影响，3组卵母细胞均采用同批精子进行体外受精，结果表明，多次超数排卵对卵母细胞的受精率及胚胎发育率无明显影响。TANG等[15]发现小鼠多次超数排卵与自然发情对比，会导致胚胎发育潜能降低，随着超数排卵次数的增加，小鼠的囊胚率显著下降。该研究使用的胚胎来自体内受精胚胎，这可能是多次使用大剂量外源激素对输卵管中的受精环境产生了影响。超数排卵动物的卵母细胞和胚胎在异常的内分泌条件下发育及受精，这与正常排卵的动物相比发育潜力会降低[23]。
胚胎形态动力学参数是与胚胎发育潜力相关的重要指标，利用胚胎动力学参数预测并筛选移植胚胎已成为辅助生殖领域的研究重点[25-27]。该研究首次探索了多次超数排卵对胚胎形态动力学参数的影响，结果表明多次超数排卵不会导致胚胎形态动力学或胚胎发育速度的差异。内细胞团和滋养外胚层的形成对于植入前和植入后的胚胎发育至关重要[28-29]。
CDX2是一种滋养外胚层特异性转录因子，通过抑制滋养外胚层中的内细胞团特异性基因来调控细胞命运决定[30-31]。在小鼠胚胎中，OCT4调节胚胎轴分化并防止早期卵裂球异位分化为滋养外胚层[32-34]。该研究评估了OCT4和CDX2阳性细胞的数目和比例，发现内细胞团或滋养外胚层未出现显著差异，与先前的研究中多次超数排卵后体内受精胚胎囊胚检测的结果一致[15]，这表明多次超数排卵不会导致小鼠囊胚的细胞成分变化。
有研究表明，多次超数排卵会引起小鼠卵巢的氧化应激和细胞凋亡[35-36]。细胞凋亡是囊胚的重要指标，而DNA损伤可诱导细胞凋亡[37-39]，过度细胞凋亡会导致胚胎发育停滞[40-41]。该研究检测了囊胚细胞凋亡和DNA损伤，结果发现多次超数排卵不会诱导过度细胞凋亡，这表明多次超数排卵不会导致DNA损伤或细胞凋亡增加。
多次超数排卵是否导致卵巢储备功能及卵母细胞发育潜能下降已成为重要的临床问题。卵巢储备功能的评价指标有年龄、激素水平(促卵泡激素、黄体生成素、抗苗勒管激素等)、获卵数以及成熟卵母细胞数[42-44]。为排除干扰的影响，该研究排除多囊卵巢综合征、卵巢功能减退、卵巢子宫内膜异位囊肿、卵母细胞玻璃化冷冻、植入前基因检测周期和染色体异常等患者。以每位患者作为自身对照，虽然3次周期患者年龄在增加，采取的临床方案有所调整，但综合分析发现多次超数排卵对接受3次体外受精周期的患者卵巢储备和胚胎质量无显著影响。这与多个生殖中心的回顾性分析结果一致[19，45]。为了确定多次超数排卵是否对不同年龄的患者有不同的影响，根据2个年龄组对数据进行分层和分析，在这2组中，胚胎质量没有显著差异。然而，在连续的体外受精周期中，高龄患者的卵母细胞数量略有减少，这表明多次超数排卵可能对高龄患者产生一定的负面影响。
尽管该临床数据量比较小，但结果表明多次超数排卵不会影响人类和小鼠卵母细胞的发育潜力。该研究患者以自身作为对照，2次周期之间的时间间隔接近1年，这可能是3次超数排卵周期对卵巢储备和卵母细胞发育潜能无显著影响的原因。鉴于样本量的局限性，多次超数排卵对卵巢功能及卵母细胞发育潜能的影响仍需多中心联合，收集更多的样本进行深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

多次超数排卵对小鼠和人卵母细胞发育潜能的影响

Effects of repeated superovulation on developmental potential of oocytes in mice and humans

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