不同浓度淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0433

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
淫羊藿苷：淫羊藿茎叶提取物总黄酮的主要成分，为淡黄色针状结晶粉末，相对分子质量为676.65，溶于乙醇、乙酸乙酯，难溶水。中医认为淫羊藿苷具有补肝肾、强筋骨、助阳益精、祛风湿等功效，现代药理研究发现，淫羊藿苷具有很强的生物活性，对多种器官、组织都具有显著作用，如骨组织、免疫系统、肿瘤组织、生殖系统、内分泌系统、心血管系统、神经系统等。
血小板衍生因子A多肽：最初从血小板中分离，因此得名，是多肽生长因子家族的一员，也是骨生长因子的一种，可促进成骨细胞早期DNA合成，使成骨细胞从静止期进入增生期，从而促进骨形成，并能协调其他因子促进骨损伤修复，在骨折愈合和修复过程中发挥积极促进作用。

摘要
背景：已有研究证明淫羊藿苷具有骨保护作用，但其在骨组织工程中作为生长因子的可行性却尚未确定。
目的：探讨不同浓度淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响及其可能作用机制。
方法：建立原代人骨髓间充质干细胞模型，采用MTT法确定淫羊藿苷处理人骨髓间充质干细胞的最适浓度范围，在此范围内梯度设置4个浓度组(10^-9，10^-8，10^-7，10^-6 mol/L)处理人骨髓间充质干细胞，采用碱性磷酸酶、矿化结节等方法确定淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞骨向分化的影响；采用Real-time PCR检测骨向分化过程中Runt相关转录因子2、成骨特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、血小板衍生因子α多肽的表达。
结果与结论：①与空白对照组相比，淫羊藿苷处理组碱性磷酸酶活性升高，钙化结节数增多，且存在剂量效应关系；②与空白对照组相比，10^-6 mol/L淫羊藿苷处理组Runt相关转录因子2、成骨特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、血小板衍生因子α多肽的mRNA表达增加；③结果表明，淫羊藿苷能有效促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化，成骨相关基因表达量升高可能是其促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制。

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ORCID: 0000-0002-5985-3812(吴曦)

关键词: 淫羊藿苷, 人骨髓间充质干细胞, 干细胞, 成骨分化

Abstract:

BACKGROUND: Icariin has been shown to have osteoprotective effects, but its feasibility as a growth factor in bone tissue engineering has not yet been determined.
OBJECTIVE: To investigate the effect of different doses of icariin on osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs), and to explore the possible mechanisms involved.
METHODS: The primary hBMSCs model was established. MTT method was adopted to select the optimal concentration range of icariin for the treatment of hBMSCs without obvious cytotoxicity, and within this range, four concentration groups (10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 mol/L) were graded to treat hBMSCs. Effects of icariin on the osteogenic differentiation of hBMSCs were confirmed by alkaline phosphatase (ALP) staining and mineralized nodule formation. Expression levels of Runt-related transcription factor 2 (Runx2), osterix (OSX), ALP, bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and platelet-derived growth factor alpha polypeptide (PDGFA) during osteogenic differentiation were detected by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Treatment with icariin increased the activity of ALP and the number of calcified nodules in a concentration-dependent manner compared with the control group. (2) After treatment with 10^-⁶ mol/L icariin, mRNA expressions of Runx2, OSX, ALP, BMP-2 and PDGFA were higher reative to those in the control group. That is to say, icariin can effectively promote the osteogenic differentiation hBMSCs, probably by enhancing the expression of osteogenesis-related genes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Epimedium, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

吴曦，彭锐. 不同浓度淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 669-674.

Wu Xi, Peng Rui. Icariin with different concentrations promotes osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 669-674.

图/表（结果） 1

2.1 人骨髓间充质干细胞的形态学及生长特征 镜下观察发现，接种后24 h内可见少量细胞贴壁，呈短小棒状(图1A)；第3，4天可见贴壁细胞数量增多，形成大小不同、散在分布的细胞集落，相比于贴壁初期，细胞呈细长梭形，伪足增长；第7天集落迅速增加、明显增多，细胞多呈梭形，排列紧密(图1B)。第14天细胞间相互紧密贴附生长，可达90%融合，呈漩涡状排列(图1C)。传代时，细胞经消化重新接种后4 h开始贴壁，初期呈圆形，逐渐伸展呈细小短棒状，最终完全舒展，恢复成梭形。传代后分裂增生速度明显加快，5-7 d传代1次，细胞均匀分布，不再以集落的方式生长，融合后再次呈典型漩涡状生长。

2.2 淫羊藿苷处理人骨髓间充质干细胞的合理浓度选择 以MTT方法来确定淫羊藿苷的合理工作浓度范围，将细胞以5×10³/孔的密度接种96孔板，贴壁后，分别使用一系列梯度浓度(从10^-9至10^-2 mol/L)的淫羊藿苷处理细胞24 h，根据吸光度值绘制细胞相对活力曲线，结果发现淫羊藿苷在10^-9 mol/L至10^-6 mol/L范围内，人骨髓间充质干细胞存活均超过90%，即淫羊藿苷浓度在10^-9 mol/L至10^-6 mol/L范围内时，对人骨髓间充质干细胞的活力基本无影响(F=10.167，P=0.689)，见图2，故后续实验均采用这几个浓度的淫羊藿苷处理细胞。

2.3 淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞增殖的影响 细胞以5×10³/孔的密度接种于96孔板，贴壁后，换成无血清培养液培养24 h，使细胞周期同步化，选择0，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6 mol/L的淫羊藿苷来处理人骨髓间充质干细胞5 d，观察其对细胞增殖能力的影响。如表1所示，随着时间延长，人骨髓间充质干细胞吸光度值逐渐升高，即细胞生长状态良好(P < 0.013)；此外，淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞有轻度促增殖作用，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 如表2所示，人骨髓间充质干细胞用含不同浓度淫羊藿苷的诱导分化培养基诱导后，与空白对照组相比，碱性磷酸酶活性升高，且碱性磷酸酶相对活性(淫羊藿苷组/空白对照组)随着淫羊藿苷处理浓度的加大而逐渐增强：10^-⁹ mol/L淫羊藿苷处理组碱性磷酸酶活性是空白对照组的1.867倍，10^-⁸ mol/L淫羊藿苷处理使碱性磷酸酶活性升高到3.033倍，10^-⁷ mol/L淫羊藿苷处理使碱性磷酸酶活性升高到4.500倍，10^-⁶ mol/L淫羊藿苷处理使碱性磷酸酶活性升高到6.000倍。

此外还观察了不同浓度淫羊藿苷处理组的矿化结节数(图3)，茜素红染色结果表明：淫羊藿苷处理人骨髓间充质干细胞21 d后，细胞聚集生长、细胞外钙盐沉积，并形成点状的钙化结节，结节数目随着淫羊藿苷处理浓度的增加而增加，空白对照组有少量钙化结节，表明淫羊藿苷具有诱导人骨髓间充质干细胞骨向分化的作用。

2.5 淫羊藿苷上调Runt相关转录因子2、成骨特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、血小板衍生因子Α多肽表达 当细胞在基础培养基中达到80%融合后，用成骨诱导分化培养基联合10^-6 mol/L淫羊藿苷诱导培养9 d，提取RNA，荧光定量PCR检测相关基因表达水平，结果发现，与空白对照组比较，Runt相关转录因子2、成骨特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、血小板衍生因子A多肽表达水平均有所增加(表3)。

参考文献

[1] Mäkinen TJ, Abolghasemian M, Watts E, et al. Management of massive acetabular bone defects in revision arthroplasty of the hip using a reconstruction cage and porous metal augment. Bone Joint J. 2017;99-B(5):607-613.

[2] Reddy BR, Sudhakar J, Rajesh N, et al. Comparative clinical and radiographic evaluation of mineralized cancellous bone allograft (puros®) and autogenous bone in the treatment of human periodontal intraosseous defects: 6-months follow-up study. J Int Soc Prev Community Dent. 2016;6(Suppl 3):S248-S253.

[3] Naito K, Sugiyama Y, Obata H, et al. Screw Fixation and Autogenous Bone Graft for an Irreducible Distal Ulna Fracture Associated with Distal Radius Fracture. J Hand Surg Asian Pac Vol. 2017;22(2):236-239.

[4] Wongwitwichot P, Kaewsrichan J. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells is impaired by bone morphogenetic protein 7. Adv Med Sci. 2017;62(2):266-272.

[5] 谢婷婷,杨乃龙,徐丽丽,等.尿酸影响人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中BMP-2表达[J].现代生物医学进展,2015,15(12):2251-2256.

[6] Blázquez-Prunera A, Díez JM, Gajardo R, et al. Human mesenchymal stem cells maintain their phenotype, multipotentiality, and genetic stability when cultured using a defined xeno-free human plasma fraction. Stem Cell Res Ther. 2017;8(1):103.

[7] Moll CW, Schmiedinger T, Moll MA, et al. Extracellular matrix mimicking scaffold promotes osteogenic stem cell differentiation: A new approach in osteoporosis research. Biomed Mater Eng. 2017; 28(2):87-103.

[8] Um S, Kim HY, Lee JH, et al. TSG-6 secreted by mesenchymal stem cells suppresses immune reactions influenced by BMP-2 through p38 and MEK mitogen-activated protein kinase pathway. Cell Tissue Res. 2017;368(3):551-561.

[9] Zhang Y, Weng S, Yin J, Vitamin K, et al. Vitamin K2 promotes mesenchymal stem cell differentiation by inhibiting miR?133a expression. Mol Med Rep. 2017;15(5):2473-2480.

[10] Wu T, Shu T, Kang L, et al. Icaritin, a novel plant-derived osteoinductive agent, enhances the osteogenic differentiation of human bone marrow- and human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Int J Mol Med. 2017;39(4):984-992.

[11] Kim DR, Lee JE, Shim KJ, et al. Effects of herbal Epimedium on the improvement of bone metabolic disorder through the induction of osteogenic differentiation from bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Mol Med Rep. 2017;15(1):125-130.

[12] Telang NT, Li G, Katdare M, et al. The nutritional herb Epimedium grandiflorum inhibits the growth in a model for the Luminal A molecular subtype of breast cancer. Oncol Lett. 2017;13(4): 2477-2482.

[13] Han YY, Song MY, Hwang MS, et al. Epimedium koreanum Nakai and its main constituent icariin suppress lipid accumulation during adipocyte differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. Chin J Nat Med. 2016;14(9):671-676.

[14] Huang W, Khaldun AB, Lv H, et al. Isolation and functional characterization of a R2R3-MYB regulator of the anthocyanin biosynthetic pathway from Epimedium sagittatum. Plant Cell Rep. 2016;35(4):883-894.

[15] Xie JP, Xiang JM, Zhu ZL. Determination of Five Major 8-Prenylflavones in Leaves of Epimedium by Solid-Phase Extraction Coupled with Capillary Electrophoresis. J Chromatogr Sci. 2016; 54(4):664-669.

[16] 成魁,陈克明,葛宝丰,等.淫羊藿苷与金雀异黄酮骨保护作用的比较研究[J].中国药理学通报,2014,30(9):1315-1319.

[17] Li X, Hou R, Yue C, et al. The Selenylation Modification of Epimedium Polysaccharide and Isatis Root Polysaccharide and the Immune-enhancing Activity Comparison of Their Modifiers. Biol Trace Elem Res. 2016;171(1):224-234.

[18] Burim RA, Sendyk DI, Hernandes LS, et al. Repair of Critical Calvarias Defects With Systemic Epimedium sagittatum Extract. J Craniofac Surg. 2016;27(3):799-804.

[19] Saha MK, Agrawal P, Saha SG, et al. Evaluation of Correlation between Salivary Calcium, Alkaline Phosphatase and Osteoporosis- A Prospective, Comparative and Observational Study. J Clin Diagn Res. 2017;11(3):ZC63-ZC66.

[20] Sartor O, Coleman RE, Nilsson S, et al. An exploratory analysis of alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase, and prostate-specific antigen dynamics in the phase 3 ALSYMPCA trial with radium-223. Ann Oncol. 2017;28(5):1090-1097.

[21] Pettengill M, Matute JD, Tresenriter M, et al. Human alkaline phosphatase dephosphorylates microbial products and is elevated in preterm neonates with a history of late-onset sepsis. PLoS One. 2017;12(4):e0175936.

[22] Wannhoff A, Rauber C, Friedrich K, et al. Von Willebrand factor and alkaline phosphatase predict re-transplantation-free survival after the first liver transplantation. United European Gastroenterol J. 2017; 5(1):86-93.

[23] Oladipo OO, DeCrescenzo AJ, Marquez CP, et al. Increased Alkaline Phosphatase in a Child. Clin Chem. 2017;63(6):1174-1175.

[24] Sun L, Yan ZH, Yang XT, et al. Osteogenic Ability Detection of Human Bone Morphogenetic Protein-2 Gene-activated Nano Bone Putty by Reusable Double-Cavity Bone Harvest Chamber. Orthop Surg. 2017;9(1):123-128.

[25] Song R, Fullerton DA, Ao L, et al. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-β1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. J Biol Chem. 2017;292(21):8657-8666.

[26] MacIsaac ZM, Henderson SE, Shakir S, et al. Biomechanical Integrity in Craniofacial Surgery: Calvarial Reconstruction in Favorable and Infected Defects with Bone Morphogenetic Protein 2. Plast Reconstr Surg. 2017;139(5):1141-1150.

[27] Aksel H, Huang GT. Combined Effects of Vascular Endothelial Growth Factor and Bone Morphogenetic Protein 2 on Odonto/Osteogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells In Vitro. J Endod. 2017;43(6):930-935.

[28] Hindoyan K, Tilan J, Buser Z, et al. A Retrospective Analysis of Complications Associated With Bone Morphogenetic Protein 2 in Anterior Lumbar Interbody Fusion. Global Spine J. 2017;7(2): 148-153.

[29] Li P, Li Y, Zhou AH, et al. Association Study of a Proliferation-inducing Ligand, Spermatogenesis Associated 8, Platelet-derived Growth Factor Receptor-alpha, and POLB Polymorphisms with Systemic Lupus Erythematosus in Chinese Han Population. Chin Med J (Engl). 2016;129(17):2085-2090.

[30] Stegmann C, Hochdorfer D, Lieber D, et al. A derivative of platelet-derived growth factor receptor alpha binds to the trimer of human cytomegalovirus and inhibits entry into fibroblasts and endothelial cells. PLoS Pathog. 2017;13(4):e1006273.

[31] Feng R, Feng L, Yuan Z, et al. Icariin protects against glucocorticoid-induced osteoporosis in vitro and prevents glucocorticoid-induced osteocyte apoptosis in vivo. Cell Biochem Biophys. 2013;67(1):189-197.

[32] Lee JH, Kim K, Kim NR, et al. The complete chloroplast genome of a medicinal plant Epimedium koreanum Nakai (Berberidaceae). Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal. 2016;27(6):4342-4343.

[33] 方晔,邹斌,赵劲民,等.α-玉米赤霉醇在雌激素缺乏所致骨质疏松症中的研究进展[J].广西医科大学学报,2014,31(5):870-872.

[34] 赵艳威,李宗旻,宋光明,等.葛根素促进人成骨样MG-63细胞分化的分子机制研究[J].中草药,2014,45(4):536-540.

[35] Wan Y, Zhuo N, Li Y, et al. Autophagy promotes osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cell derived from osteoporotic vertebrae. Biochem Biophys Res Commun. 2017;488(1):46-52.

[36] 李亘,贺韬,张超,等.瘦素促进骨髓间充质干细胞成骨分化并增加内植物-骨界面骨生成[J].上海医学,2016 39(3):156-159,194.

[37] Gu R, Lei B, Jiang C, et al. Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper Suppresses ICAM-1 and MCP-1 Expression by Dephosphorylation of NF-κB p65 in Retinal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017;58(1):631-641.

[38] Li A, Xia X, Yeh J, et al. PDGF-AA promotes osteogenic differentiation and migration of mesenchymal stem cell by down-regulating PDGFRα and derepressing BMP-Smad1/5/8 signaling. PLoS One. 2014;9(12):e113785.

[39] 代志鹏,许伟华,杨述华,等.人骨髓间充质干细胞的生物学特性及成骨诱导分化的研究[J].中国矫形外科杂志,2014,22(15):1402-1407.

引言

骨缺损在临床上比较常见，长期以来一直困扰着患者和医生。目前治疗骨缺损的方法主要有骨移植疗法(异体骨移植和自体骨移植)、组织工程技术等。骨移植目前已成功用于修复因肿瘤、感染、创伤造成的骨缺损，但仍有一定局限，如异体骨存在免疫排斥反应等^[1-2]，自体骨取材有限，而且会造成其他部位的骨缺损^[3]。因此，寻找、开发新的治疗方法成为该领域亟待解决的难题。在这样的背景下，骨组织工程技术应运而生。骨组织工程研究主要包括种子细胞、支架材料、细胞因子等^[4]。人骨髓间充质干细胞具有自我复制能力和多向分化潜能，可在不同条件下被诱导分化为不同的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞等^[5-6]。人骨髓间充质干细胞是细胞和基因治疗的理想靶细胞，是目前最为合适的骨组织工程的细胞来源。已有的一些研究发现，在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，成骨相关基因或信号通路的改变在其中起着重要作用，如骨形态发生蛋白2、骨成型蛋白受体1b、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路等^[7-9]。

淫羊藿是传统的补益中草药，淫羊藿苷是淫羊藿茎叶中提取的主要有效成分，具有祛风除湿、温阳补肾、强筋健骨的功效。现代药理学研究发现，淫羊藿苷具有调节内分泌、改善心脑血管功能、抗肿瘤等多重功效^[10-12]。淫羊藿苷具有雌激素样结构，可发挥类雌激素效应^[13-14]，近年来被视为一种植物雌激素广泛应用于骨质疏松和骨折的治疗，淫羊藿苷可直接抑制破骨细胞、促进成骨细胞增殖，改善骨组织微结构，但其中机制尚不清楚。

实验采用淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞进行干预处理，观察其对人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，并初步探讨作用机制，为其在骨组织工程中的应用提供实验依据。

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材料方法

1.1 设计 浓度梯度细胞药理实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年9月至2017年4月在十堰市人民医院药理研究所实验室完成。

1.3 材料 DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；淫羊藿苷、MTT(Sigma公司)；茜素红染料、碱性磷酸酶活性检测试剂盒(碧云天公司)；成骨诱导分化培养基(Cyagen，美国)；Real-time PCR试剂(诺唯赞公司)；酶标仪(BiotekBio Tek Elx800，美国)；实时荧光定量PCR仪(Roche Light Cycler480，瑞士)。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞分离、培养 该研究经医院伦理委员会批准，所有志愿者均获得知情同意。选取十堰市人民医院2016年9月至2017年3月期间收治的30例因创伤致骨缺损需要取自体髂骨移植的患者，年龄27-58岁，平均年龄(40.3±5.1)岁，在无菌条件下从髂嵴处抽取骨髓10 mL，立即注入经肝素处理的含培养液的离心管，通过100 mm的过滤器过滤后，与Hank’s缓冲液混合。然后将混悬液轻轻加入到预置等体积淋巴细胞分离液的离心管中，10 000 r/min离心30 min，底层是聚集和沉淀的红细胞，收集白膜层的单核细胞，DMEM培养液洗涤2次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，转移至培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，此为原代。24 h后在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，以后每隔2 d换液1次，待细胞接近90%融合时，用37 ℃预热的0.25%胰酶消化，按1︰2比例传代。选择第3代细胞进行实验。

1.4.2 MTT法检测细胞增殖情况 人骨髓间充质干细胞以5×10³/孔的密度接种于96孔板，共设置5组，每组均设置6个复孔。细胞贴壁后换成无血清培养液，撤血清24 h，使细胞周期同步化，分别用含0，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6 mol/L淫羊藿苷的完全培养液培养细胞5 d，每天检测增殖情况。具体方法为：每孔加10 μL的MTT溶液(5 g/L)孵育4 h，弃掉上清，每孔加150 μL的二甲基亚砜，振荡、溶解，于酶标仪上测量490 nm波长吸光度值。取每组6个复孔的吸光度值的均数，绘制细胞相对活力曲线。

1.4.3 碱性磷酸酶活性检测 人骨髓间充质干细胞以5×10³/孔的密度接种于96孔板，分别用含0，10^-⁹，10^-⁸，10^-⁷，10^-⁶ mol/L淫羊藿苷的诱导分化培养基诱导5 d，采用碧云天公司的碱性磷酸酶活性检测试剂盒，其检测原理：对硝基苯磷酸盐为常用的磷酸酶显色底物，在碱性条件下，可在碱性磷酸酶作用下生成对硝基苯酚，呈黄色，可以在400-415 nm波长处检测吸光度。颜色的深浅和样品中的碱性磷酸酶呈正相关。产物黄色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，据此比色分析计算碱性磷酸酶活性水平。根据说明书操作，大致如下：将所有试剂取出，恢复至室温使用。将标准品按照说明书进行稀释，制备标准曲线。细胞裂解液裂解细胞，离心取上清，加入50 μL检测缓冲液和50 μL显色底物。用枪头轻轻吹打混匀，37 ℃孵育10 min，每孔加入100 µL反应终止液终止反应，在405 nm波长处测定吸光度。以标准物的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的吸光度值由标准曲线查出相应的浓度，如有稀释，再乘以稀释倍数，即得样品的实际浓度。

1.4.4 茜素红染色观察钙化结节 将人骨髓间充质干细胞以2×10⁴/cm²的密度接种于24孔板，以基础培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液)进行培养，当细胞融合度达到80%时，用成骨诱导分化培养基诱导21 d，该培养基是在基础培养基中添加0.1 µmol/L地塞米松，0.2 mmol/L抗坏血酸磷酸盐和10 mmol/L β-甘油磷酸钠，同时分别给予0，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6 mol/L的淫羊藿苷，将处理好的细胞孔板取出，弃去培养液，PBS洗涤，体积分数为95%乙醇室温固定30 min，再用0.1%茜素红染色30 min，清水冲洗，拍照，观察。

1.4.5 Real-time PCR检测 将人骨髓间充质干细胞以5×10⁴/孔的密度接种于12孔板，以基础培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液)进行培养，当细胞融合度达到80%时，用成骨诱导分化培养基联合10^-6 mol/L淫羊藿苷诱导培养9 d。提取人骨髓间充质干细胞总RNA，经反转录得到cDNA后，用SYRB Green染料对靶基因Runt相关转录因子2(Runx2)、成骨特异性转录因子(OSX)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)和血小板衍生因子A多肽(PDGFA)的mRNA水平进行相对定量检测。Runt相关转录因子2的定量引物序列为：F： TGG TTA CTG TCA TGG CGG GTA；R：TCT CAG ATC GTT GAA CCT TGC TA。成骨特异性转录因子的定量引物序列为：F：GAG TAG GAT TGT AGG ATT GG；R：ATG GCG TCC TCC CTG CTT GAG GAG GAA G。碱性磷酸酶的定量引物序列为：F：TGG CTT CAG GTC AAG AGG CT；R：CTG CAC TCG TGT GGT GGT TA。骨形态发生蛋白2的定量引物序列为：F：CGC TGT CTT CTA GCG TTG CT；R：GGG GTG GGT CTC TGT TTC AG。血小板衍生因子Α多肽的定量引物序列为：F：GGT CGC TCC TGA AGC CAG；R：GGA GGA GAA ACA GGG AGT GC。内参引物β-Actin序列为：F：TCA TGA AGT GTG ACG TGG ACA T；R：CTC AGG AGG AGC AAT GAT CTT G。在实时荧光定量PCR仪上进行，反应程序为：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，1 min。重复第2步，共40个循环。采用2^-^??Ct方法表示靶基因相对表达量。进行6次独立实验后，进行统计分析。

1.5 主要观察指标 细胞增殖能力，碱性磷酸酶活性，钙化结节数，基因表达水平。

1.6 统计学分析 用SPSS 13.0进行统计学分析。数据以x(_)±s的形式描述，两组间的比较用成组t 检验，多组间的比较用单因素方差分析和两两组间LSD-t 检验，多时点重复测量资料则行重复测量方差分析，组间两两LSD-t 检验，时间两两差值t 检验(按Bonferroni法调整检验水准)。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨损伤由于其治疗窗口窄，成骨细胞分化的激活和维持较困难，扩增效率又低，是长期以来一直困扰着患者和医生的棘手难题。如何在骨损伤发生后快速产生足够多的成骨细胞和骨组织是如今面临的一个巨大的挑战。成骨细胞是蛋白分泌型细胞，能合成并分泌骨基质，产生Ⅰ型胶原，并能吸收、转移钙离子，是骨形成、再建的重要功能细胞。骨髓间充质干细胞在来源、分离方法及可分化组织类型上有着独特的优势，是目前最为合适的骨组织工程的细胞来源，具有广阔的发展前景和临床应用价值。骨髓间充质干细胞在特定条件下可向成骨细胞分化，但有关成骨诱导分化条件及作用机制的研究不是很多。

淫羊藿苷是一类具有药用价值和较高保健作用的中药单体，在体外和体内被证明有治疗骨质疏松症的作用^[15-18]，但淫羊藿苷在骨组织工程中作为生长因子的可行性却尚未确定。在本研究中，作者分离和纯化了需自体髂骨移植患者的骨髓间充质干细胞为靶细胞，对淫羊藿苷作为成骨分化诱导活性因子的可行性作了初步探讨。从细胞增殖曲线结果来看，淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞增殖几乎没有作用。增殖和分化是细胞生命活动的两个方面，增殖中的细胞其分化功能受到抑制，而分化中的细胞其增殖能力降低。因此，考虑淫羊藿苷可能是选择性地对人骨髓间充质干细胞分化能力调节，碱性磷酸酶和矿化结节实验结果检测证实了此推测。淫羊藿苷最佳促人骨髓间充质干细胞骨向分化浓度为1×10^-⁶ mol/L；在淫羊藿苷介导的人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，Runt相关转录因子2、成骨特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2和血小板衍生因子A多肽的表达升高可能是淫羊藿苷促进人骨髓间充质干细胞骨向分化的重要作用机制之一。

碱性磷酸酶广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织^[19-20]，在骨代谢研究领域，碱性磷酸酶活性是反映成骨细胞功能和分化程度的指标，碱性磷酸酶活性越高，细胞越成熟；碱性磷酸酶活性越低，细胞分化越低。骨形态发生蛋白是一种广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白，可在体内通过自分泌或旁分泌方式诱导骨形成，其中骨形态发生蛋白2是促进骨形成最重要的细胞外信号分子之一^[21-23]。骨形态发生蛋白2与多种细胞因子(如Smads、Runt相关转录因子2、成骨特异性转录因子等)形成骨形态发生蛋白2信号通路^[24-26]，是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的信号通路之一。骨形态发生蛋白2通过激活Smads信号调节成骨相关基因转录从而发挥作用^[27-28]。骨形态发生蛋白2可上调几十种基因表达，包括Msx2、Smad6，Smad7等在成骨过程中发挥重要作用的关键转录因子。血小板衍生因子A多肽最初从血小板中分离，因此得名，可促进成骨细胞早期DNA合成，使成骨细胞从静止期进入增生期，从而促进骨形成，并能协调其他因子促进骨损伤修复，在骨折愈合和修复过程中发挥积极促进作用^[29-30]。

淫羊藿苷具有雌激素样结构，近年来被视为一种植物雌激素广泛应用于骨质疏松和骨折的治疗^[31]。缺乏雌激素是绝经后骨质疏松的首要原因。雌激素在成骨细胞增殖、分化、功能表达、凋亡等过程中起调节作用。除淫羊藿苷外，目前发现可参与骨髓间充质干细胞成骨分化的植物类雌激素还包括金雀异黄酮、α-玉米赤霉醇、银杏叶提取物等^[32-33]。此外，葛根素、大豆苷元、异补骨脂素和山萘酚等也均被报道可参与成骨细胞活性调节^[34]，但是否可诱导骨髓间充质干细胞成骨分化值得进一步深入研究。研究还发现，瘦素也可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，可能是通过影响骨保护素/RANKL途径，促进成骨，发挥对骨代谢的调节^[35-36]。一些信号通路中的信号分子，如WNT、血小板衍生生长因子AA，甚至病毒如HIV等都能影响成骨分化^[37-39]。

淫羊藿苷性质稳定、易于储存，且来源广泛、价格低廉，为其在骨组织工程领域中的应用创造了有利条件。实验结果表明，淫羊藿苷能有效促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化，且存在最适诱导浓度(本研究中为10^-⁶ mol/L)，淫羊藿苷诱导成骨分化的能力以浓度依赖性方式增加，Runt相关转录因子2、成骨特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2和血小板衍生因子Α多肽的表达升高可能是淫羊藿苷促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制，淫羊藿苷可视为一种良好的骨诱导活性因子，这为其在骨组织工程中的应用奠定了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程