Demineralized bone matrix as a bone tissue engineering scaffold material

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.03.016

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Demineralized bone matrix as bone tissue engineering biological scaffold material is more researched currently, which has osteoinductive and osteoconductive.
OBTECTIVE: To summarize the development of demineralized bone matrix as bone tissue engineering scaffold material and to prospect its trend.
METHODS: The relative literatures addressing demineralized bone matrix as bone tissue engineering scaffold material published between January 1965 and May 2013 in PubMed database, Chinese Biomedical Database, Wanfang Database and FMJS database were searched by the first author. The key words were “demineralized bone matrix, scaffold material, growth factor, cells, drugs” in English and Chinese. According to the inclusion criteria, repetitive researches were excluded, and finally 34 articles were included.
RESULTS AND CONCLUSION: Scaffold material is the key composition of tissue engineered bone, and only demineralized bone matrix has both osteoinductive and osteoconductive properties which cannot only provide space for bone repair, but also can be combined with bioactive factors, living cells, antibiotics in vitro to construct bone graft thereby promoting healing of bone defects. However, this technique is also facing some problems to be solved such as the ratio of demineralized bone matrix and various substances, disinfection, preservation of osteogenetic activity and antigenicity elimination. Sufficiently understanding demineralized bone matrix as bone tissue engineering scaffold can provide a theoretical basis for its clinical service.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: biocompatible materials, bone matrix, stem cells, tissue engineering, braces

CLC Number:

R318

Chen Hai-xia, Xie Zhi-gang . Demineralized bone matrix as a bone tissue engineering scaffold material [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(3): 426-431.

Figures/Tables 1

脱矿骨基质作为一种生物类支架材料，既可以自身释放骨形态发生蛋白及生长因子，又可以负载多种外源性物质，通过控释使受区受到成骨的生物学刺激，因其优势受到众多学者的青睐，成为近年来研究的热点。脱矿骨基质是一种经盐酸脱矿、消毒、冻干等处理的动物骨或人类骨，它是脱矿后的骨基质成分，保留了骨质本身的多孔网状结构。目前大量研究证实，脱矿骨基质具有骨诱导活性，因此，脱矿骨基质材料具有骨诱导性和骨传导性双重特性[1-4]。有学者利用其优势将脱矿骨基质与其他人工合成材料以一定比例混合制备成复合支架材料以发挥各自优势更好的修复骨缺损，刘晓明等[5]通过超临界二氧化碳合成法将脱矿骨基质与聚乳酸以一定比例合成，发现当脱矿骨基质与聚乳酸质量比为6/4时，材料的抗压强度及弹性模量达到了108.72 MPa及13.82 MPa，孔隙在200-400 μm之间，孔隙率达79.71%，细胞毒性评价0级或1级，基本达到组织工程支架材料的基本要求。徐伟俊等[6]研究发现将脱矿骨基质与海藻酸钠以质量比7∶3混合时材料可塑性强，不易离散，与小鼠成纤维细胞共培养检测发现2，4， 7 d的细胞增殖率均高于90%，细胞毒性级别1级。 2.1 脱矿骨基质自身含有生物活性物质并向植入床释放，具有骨诱导性骨诱导性是指诱导未分化间充质细胞经过形态发生期而分化为骨系细胞，进而形成骨或软骨的特性。脱矿骨基质通过外科手术的方式植入或注射入骨缺损区，可作为骨充填物并同时刺激新骨形成，修复骨缺损。早在20世纪70年代，Urist等[7-9]就发现脱矿骨基质可以在肌肉组织中异位成骨，并存在促进新骨形成和骨再生的骨形成蛋白。Pietrzak等[10]对20例经筛选的符合美国食品和药品监管局检测标准的人来源脱矿骨基质进行了测量，得出每克脱矿骨基质中含骨形态发生蛋白2约21.4 ng，骨形态发生蛋白4约5.45 ng，骨形态发生蛋白7约84.1 ng。有学者将人尸体来源含血管基质成分的脂肪细胞接种于脱矿骨基质上，发现骨髓间充质干细胞被筛选保留下来，且通过酶联免疫吸附法检测到骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7的存在[11]，间接说明了脱矿骨基质具有骨诱导潜能。Wildemann 等[12]对3种不同厂家生产的人脱矿骨基质产品中成骨相关的生长因子进行测定，胰岛素样生长因子1含量为 22 ng/g，转化生长因子β 含量为18 ng/g，血管内皮生长因子含量为1.9 ng/g。有学者将羟基磷灰石、脱矿骨基质/羟基磷灰石作为两组分别植入裸鼠肌袋模型中，碱性磷酸酶检测发现脱矿骨基质/羟基磷灰石组明显高于羟基磷灰石组，Micro CT及形态学观察发现脱矿骨基质/羟基磷灰石组肌袋内形成矿化组织，而羟基磷灰石组则未发现[13]。以上实验研究均表明，脱矿骨基质自身含有生物活性物质，虽然作用机制尚处于研究阶段仍未明确，但脱矿骨基质可诱导异位成骨已得到证实。 2.2 脱矿骨基质作为骨组织工程支架材料复合外源性物质修复骨缺损 2.2.1 脱矿骨基质具备理想的骨组织工程支架材料应具备的基本条件适度的降解率、多孔的三维立体结构(孔隙率约达80%)、良好的生物相容性及一定的生物活性。李强等[14]通过体外观察脱矿骨基质发现其完全降解需10-12周，其孔隙率约为77.15%，且与骨髓间充质干细胞平均黏附率达到71.25%。唐少锋等[15]扫描电镜观察脱矿骨基质发现其表面不满大小不等的孔隙且各孔隙相互交通，与脂肪干细胞复合培养2周后发现增殖的细胞及分泌的胞外基质几乎将孔隙全部充填。Kirk等[4]证实脱矿骨基质有极高的孔隙率，将鼠成骨细胞与之共培养可检测到细胞大量增殖。 2.2.2 脱矿骨基质可以作为载体与活细胞、生物活性因子、小分子药物、转基因制剂等多种物质复合后植入骨缺损区脱矿骨基质作为活细胞的载体，二者于体外复合后植入骨缺损区：组建组织工程化骨常用的种子细胞有间充质干细胞、成骨细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、胚胎干细胞、基因修饰细胞等，这类具有多向分化潜能的细胞已具备较成熟的分离增殖培养技术，可大批量生产，负载于脱矿骨基质可快速有效地作用于骨缺损区。由于间充质干细胞已被证明具有免疫调节功能[16]，这种技术的取材有望不只局限于自体宿主细胞，有可能扩展到异种细胞源。将骨髓源性多能成体祖细胞与同种异体脱矿骨基质共培养，检测到骨髓源性多能成体祖细胞在脱矿骨基质上表达碱性磷酸酶，分泌细胞外基质，并且有钙等矿物质的沉积；同时将其植入到鼠肌袋模型中，组织切片发现异位成骨现象[17]。例如有研究观察人脱细胞骨复合经诱导骨髓基质细胞的实验效果，观察细胞的黏附和生长情况，并对其成骨活性进行检测。实验用过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分，消毒后制备人脱细胞骨。取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养，细胞纯化后加入β-甘油酸钠，地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导，并进行对照培养。通过碱性磷酸酶和骨钙素检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况，将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行培养，8 d后通过光镜和电镜等形态学观察，以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性。结果显示：①人髂骨块细胞清除干净，骨基质保存良好。②诱导8 d后的骨髓基质细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量明显高于对照组[诱导后骨髓基质细胞：(181.54± 40.01)nkat/L。(7.2±1.3) μg/L。对照组：无法测到。P < 0.05]。③骨髓基质细胞在人脱细胞骨支架内附着紧密，生长良好。表明人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能，是一种较为理想的骨组织工程材料。也有学者将脂肪干细胞接种于脱矿骨基质进行体外及体内培养，体外培养发现细胞黏附在脱矿骨基质上增殖并表达成骨标记物，在小鼠体内异位成骨的量比单独用脱矿骨基质成骨量多30%[18]。Pradel等[19]对比脱矿骨基质负载成骨细胞组成的组织工程骨移植材料与自体髂骨移植两种方法在儿童牙槽突修补术后6个月的成骨效果发现，二者在骨量及成功率上无显著性差别，说明组织工程骨有可能取代作为金标准的自体骨移植。近年来基因治疗与骨组织工程技术结合，将转染有生长因子基因的种子细胞-基因修饰种子细胞接种于支架材料，可使种子细胞表达内源性生长因子，刺激植骨区细胞向骨细胞方向转化，促进新骨形成。Castro-Govea等[20]将腺病毒载体介导的骨形态发生蛋白2基因转染到间充质干细胞，与脱矿骨基质复合进行体外及犬下颌牵张成骨模型体内成骨观察，体外观察发现转染组诱导形成成骨细胞的数量和矿化的细胞外基质多于对照组(未转染间充质干细胞+脱矿骨基质组)；10周后，通过对犬下颌解剖学和形态学观察显示转染组骨改建和形成更为成熟，且无炎性反应。Lieberman等[21]也曾将ad-BMP2转染到骨髓基质细胞并与脱矿骨基质复合，对裸鼠股骨缺损的修复效果远远优于单纯脱矿骨基质组。脱矿骨基质与生物活性因子复合向受区缓释并诱导骨形成：在骨折愈合过程中有多种生物活性因子表达，这种表达具有相对固定的空间和时间分布，各种生物活性因子相互作用，共同调节骨愈合过程。参与调节骨愈合的生物活性因子有许多，如骨形态发生蛋白、转化生长因子β、成纤维生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子等，它们在整个骨愈合期间均有表达[22]。临床前期和临床应用结果表明，外源性生物活性因子用于骨折延迟连接或骨不连有良好效果。Francis等[23]通过对55例牙槽突裂患者分别用脱矿骨基质复合骨形态发生蛋白对比自体髂骨骨移植后平均21个月的追踪回顾研究，发现用骨形态发生蛋白/脱矿骨基质修复牙槽突裂的成功率为97.2%，而自体髂骨修复的成功率为84.2%，脱矿骨基质复合骨形态发生蛋白有望成为修复骨缺损的一种可供选择的方法。有研究比较脱钙骨基质复合牛骨形态发生蛋白和单纯脱钙骨基质修复节段性骨缺损的能力。实验选取32只新西兰大白兔，采用桡骨15 mm节段性骨缺损模型，随机分为2组，A组植入异体脱钙骨基质与牛骨形态发生蛋白(10 mg)复合材料，B组植入异体脱钙骨基质。术后4，8，12，16周进行放射学检查、病理组织学检查和计算机图像分析新生骨面积。X射线和组织学检查显示异体脱钙骨基质与牛骨形态发生蛋白复合材料组的新骨生成、修复骨缺损能力优于异体脱钙骨基质组，组织切片的计算机图像分析提示脱钙骨基质+牛骨形态发生蛋白组修复新骨面积大于脱钙骨基质组，两者之间差异有显著性意义(4，8，12周P < 0.05；16周P < 0 .01)。表明异体脱钙骨基质复合牛骨形态发生蛋白材料通过骨诱导和骨传导两种方式修复骨缺损，其修复骨缺损的能力要优于单纯脱钙骨基质材料，是一种较为理想，具有高效成骨活性的植骨材料。转化生长因子β1联合脱矿骨基质修复犬胫骨开放性骨折模型，术后第5周骨缺损处大量骨痂形成，X射线显示转化生长因子β1/脱矿骨基质组再生骨的结构、密度优于脱矿骨基质组，组织学检查发现大量破骨细胞及间充质细胞[24]。血小板衍生生长因子主要作用是促进成骨细胞DNA合成和复制，加速骨组织形成，它由2条肽链形成3种二聚体结构：血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB，其中血小板衍生生长因子BB生物学功能最强。一种rhPDGF-BB与脱矿骨基质共价结合的注射型组织工程骨，在植入小鼠背部皮下后可显著增加血管密度和新骨形成[25]。也有报道将脱矿骨基质与富血小板血浆复合，利用其中富含各种生物活性因子的特点，促进矿化过程，加速骨缺损的愈合[26]。 Nel-like type 1 molecule(Nell-1)蛋白是近年来被发现具有成骨效能的生物活性因子，它与脱矿骨基质骨泥配比复合植入鼠脊椎损伤动物模型，与单纯脱矿骨基质骨泥组相比脊椎融合显著，形成大量新骨[27]。脱矿骨基质- Nell-1也能促进羊脊椎融合，且表现出比对照组更快的融合及更高的矿化密度[28]。脱矿骨基质负载抗生素等小分子药物植入骨缺损处：在整形外科手术中，一些传统的常规药物如抗生素、镇痛药和抗炎药可与脱矿骨基质以各种剂型混合，植入受区，使局部药物达到高浓度，同时利用脱矿骨基质缓释作用起到药效持久的作用。虽然外科手术中应用混有抗生素的脱矿骨基质有一段时间，但近年来才开始系统的研究脱矿骨基质作为抗生素药物缓释系统用以减少骨缺损手术的感染风险。Saraf等[29]建立兔股骨远端干骺端皮质下缺损并感染金黄色葡萄球菌模型，将浸有万古霉素的脱矿骨基质植入骨缺损区，发现其能有效对抗感染并促进骨缺损的愈合。Lewis等[30]将脱矿骨基质充分浸染庆大霉素，体外检测其释放浓度，发现可维持临床有效药物浓度至少 13 d，将其植入裸鼠肌袋观察28 d，发现并未影响其异位成骨能力。也有其他小分子药物如他汀类药物、二膦酸盐等，与脱矿骨基质充分浸染后用于骨缺损修复的报道。他汀类药物因其多种药理作用及生物活性已被用于骨质疏松的治疗。在啮齿类动物颅骨缺损模型中，应用脱矿骨基质结合他汀类药物可诱导形成新骨[31]。二膦酸盐是一大类小分子制剂的代表，因它对破骨细胞的抑制、促进成骨细胞的增殖被临床上用于治疗骨质疏松。但它较低的口服生物利用度和使用后可能引起的严重的系统性并发症(如下颌和踝关节骨坏死)，使得给药途径和剂量控制成为关注的重点。脱矿骨基质浸润二膦酸盐局部给药已有报道[32-33]，但这些研究对于该材料在受区的改建和对受区骨形成方面的结论并不一致，仍存在争议。脱矿骨基质复合转基因制剂：随着基因层面技术的发展，脱矿骨基质结合转基因制剂治疗骨缺损展现出极好的前景，将含有Nell-1基因片段编码的腺病毒按一定配比与脱矿骨基质复合植入鼠脊椎损伤模型，术后6周组织形态学结果发现Nell-1腺病毒-脱矿骨基质组比对照组(LacZ腺病毒组)形成的骨质更成熟，质量更高[34]。"

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