2.1   微环境对干细胞的增殖、分化、抗衰老的影响   2.1.1   微环境与干细胞的关系  干细胞在机体组织中生存的微环境，被称为“干细胞巢”，“巢”中包括营养支持细胞、胞外基质、大量生物活性物质以及微血管网等。干细胞“巢”微环境之所以可以通过不同信号途径调控干细胞，维持生理及病理状态下干细胞的生长、增殖、分化、更新、迁移的稳态，是基于干细胞对其微环境的适应性以及微环境对干细胞的潜在影响。微环境中氧气的体积分数对干细胞有决定性的影响，在严重缺氧、缺血状态下，微环境释放大量有毒物质、炎症递质及促凋亡因子，导致归巢时受损组织的干细胞无法分化成足够数量的目标细胞，严重者还会加速干细胞的凋亡或死亡[2-3]；但是，如果在短时间内一次或多次短暂的将干细胞暴露于非致死性的低氧环境中，对干细胞具有一定的促进作用，如低氧预适应的骨髓间充质干细胞能高表达并分泌血管内皮保护因子等，通过自分泌和旁分泌效应促进移植干细胞的存活、迁移和再生修复能力。SONG等[4]建立大鼠脑卒中模型，低氧预处理后骨髓间充质干细胞移植治疗可诱导血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、基质细胞衍生因子1α及生长相关蛋白43表达升高，有效减少脑梗死面积。WEI等[5]经静脉注射的骨髓间充质干细胞可以在归巢到缺血区后分化为神经细胞，低氧预处理对神经元分化具有明显的促进作用。干细胞与微环境中其他细胞相互作用，细胞间黏附分子及细胞外基质之间交互影响，通过自分泌、旁分泌、内分泌等调节方式保持干细胞的更新，替换组织的衰老细胞，供机体组织循环使用。因此，平衡协调微环境内各成分之间的相互作用，维持微环境的稳态，对干细胞进行低氧或中药预处理，增强干细胞对缺血缺氧微环境的适应能力，在缺血性心脑血管疾病的治疗中起着关键的作用。 2.1.2   缺血缺氧微环境直接影响干细胞的增殖、分化   缺血缺氧微环境直接影响干细胞的增殖能力、多向分化潜能、凋亡水平以及损伤修复等生物学进程。临床研究显示，脑梗死或心肌梗死后，梗死区微环境缺血缺氧、血流异常导致能量代谢异常和氧自由基损伤，原心肌细胞和神经元细胞大量死亡，新生血管再生困难，严重者会造成永久性损伤[6-10]。骨髓间充质干细胞由于其取材简单、低免疫原性、伦理争议小等特点，在再生医学中有良好的应用前景。体外实验研究显示，骨髓间充质干细胞移植可以明显促进缺血区域血管的生成，改善神经功能转归。标记追踪移植细胞的实验发现，部分干细胞进入脑内可分化为神经元和内皮细胞的形态，并可能替代坏死的神经元，支持血管的再生。新血管的生成还可以为受损部位提供血液、氧气、葡萄糖及营养物质，从而加速受损中枢神经再生修复。在大鼠脑卒中模型中，骨髓间充质干细胞与特异性基因联合诱导并移植治疗，大鼠神经功能恢复良好、脑梗死面积减小、神经功能评分方面明显改善和脑水肿明显消退，同时可促进损伤边缘区血管生成，有效改善损伤处血流[11]。但由于受损部位严重缺血缺氧等恶劣微环境的限制，移植干细胞存活率和分化率明显降低，大部分干细胞移植后3 d内存活率大于70%-80%，4 d后存活率不足1%，骨髓间充质干细胞向损伤部位的有限迁移限制了其治疗效 果[12-14]。因此，通过调控微环境，使用不同的信号分子组合来改善干细胞的自我更新和增殖，纠正恶劣的缺血缺氧微环境，可能对提高干细胞的增殖和分化能力、恢复干细胞的功能状态、减少干细胞的凋亡有积极的作用。 2.1.3   缺血缺氧微环境加速干细胞的衰老   随着年龄的增长，衰老伴随着分子、细胞、组织和器官的损伤不断累积，导致机体功能减退，从而更易受疾病侵害甚至机体死亡[15]。干细胞生存微环境的变化，影响细胞分泌的炎性因子、趋化因子、细胞外囊泡以及信号通路的改变，可能是加速干细胞衰老的重要因素。缺血缺氧产生一种有毒的细胞内环境，在这种内环境下细胞线粒体呼吸遭受抑制，钙信号失调导致线粒体损伤。缺血细胞产生活性氧，过量的活性氧及过氧化剂防御不足之间的失衡又可导致氧化应激[8]。有研究显示，氧化应激是加速干细胞衰老的重要因素，会诱导干细胞早衰，细胞形态发生改变，如细胞大而扁平；或是丧失自我更新的能力；或是出现不可逆的细胞周期阻滞等，这些均会抑制干细胞的再生能力[16]。线粒体功能障碍及氧化应激造成干细胞的衰老、凋亡或死亡，进一步发展导致机体衰老[17]。作为干细胞生存的土壤，微环境的优渥与否，决定了干细胞的功能结构是否正常。 近年来通过研究干细胞衰老与微环境的关系，从分子生物层面分析细胞核内miRNA可能是参与调节衰老微环境的关键信号分子[17-18]；除Nrf2(nuclear factor)转录因子、活化蛋白激酶 (Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)、Wnt/β-catenin信号通路、p53/p21等经典分子通路外，LEE等[19]研究指出在缺氧环境下通过直接调节MAPK/COX-2/PGE2和MKP-1/p38 MAPK信号通路，认为B淋巴瘤莫洛尼氏鼠白血病病毒插入区1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site-1，BMI1)具有缺氧免疫抑制特性，可以增强干细胞的增殖活性，缓解衰老状态。与微环境关系密切的细胞外基质在预防干细胞的衰老中起到决定性的作用，如衰老的人成纤维细胞在来源于年轻的细胞外基质环境下培养，衰老细胞恢复至与年轻细胞一致的状态，延迟了细胞端粒缩短[20]。另外，中医药在调控干细胞生存的微环境、延缓干细胞的衰老方面作用显著。张阳阳等[21]研究得出活血化瘀方药可以改良缺血缺氧微环境，补肾化瘀生新方可以下调衰老相关因子p16INK4a、p53、p21的表达，促进骨髓间充质干细胞的再生，提高骨髓间充质干细胞出髓效率，延缓其衰老。因此，在改变干细胞生存微环境的基础上，调控细胞组分或细胞外信号通路从而干预干细胞衰老进程是重要的研究方向。 2.2   缺血缺氧微环境、细胞自噬与中医理论体系关联性   2.2.1   缺血缺氧微环境对细胞自噬能力的影响   自噬是细胞衰老的一种表现形式，是细胞用来适应外界复杂恶劣微环境、保持细胞活性的一种能力，干细胞的自我更新和分化能力可能是利用细胞的自噬来对抗衰老的一种表现。自噬在细胞的调节过程中呈双向性，一方面，自噬是维持细胞内环境稳态的手段，在清除受损的细胞器、降解转化细胞分泌产生的代谢物或蛋白、维持细胞良好状态的过程中发挥着重要作用；另一方面，过度的自噬可能会导致自噬体大量的堆积，引起细胞的程序性死亡[22]。研究缺血缺氧微环境对细胞自噬能力的影响，对提高干细胞抗衰老能力有很大的帮助[23]。 微环境中氧气的体积分数及缺血的损伤程度影响干细胞自噬的水平。有研究显示，在5%的氧气体积分数下，可以激活骨髓间充质干细胞的自噬，向成骨细胞分化，这可能与抑制MAPK和PI3K-AKTmTOR信号通路促进细胞自噬有关；在1%的氧气体积分数下，通过激活骨髓间充质干细胞中的AMPK/mTOR途径增加细胞凋亡[24]。由此可见，在轻度缺血、缺氧、营养匮乏等应激条件下，自噬通过降解受损细胞器产生腺苷三磷酸，可以保持干细胞活力及能量供应。但在严重缺血条件或缺血时间延长等情况下，会引发过度自噬及内质网应激，加速干细胞的凋亡和死亡，损伤干细胞周围细胞及微环境，从而导致机体组织和脏器的一系列损伤[24-25]。  2.2.2   中医辨证理论体系与细胞自噬   从中医的理论体系角度探讨细胞自噬，可以从传统角度与微观角度出发。胡朋言等[26]从传统角度研究认为，自噬与中医辨证论治具有相关性，①以阴阳辨证理论体系为主，有关阴阳对立制约、相互转化、阴阳消长、自和平衡等研究较多。如中医认为向上的、升发的属阳，下降的、收敛的属阴，若将细胞的增殖、凋亡按照阴阳属性划分，则增殖属阳，凋亡或死亡属阴。人体发病的根本原因是机体的阴阳失衡，细胞的异常增殖可能与阴亏或阳盛阴衰有关，阴阳的平衡又受到外界因素的干扰，这与细胞的自噬调节有相似之处。②在脏腑辨证理论与细胞自噬的相关性研究中发现，自噬的调节功能与脏腑功能正常与否密切相关，这其中以肝、脾、肾三脏为主，如肝主疏泄理论认为肝气疏泄不及，则气机郁滞，疏泄太过，则气逆，这与细胞自噬的双向性相似。③卫气与细胞自噬存在一定的相关性，中医认为卫气运行于皮肤肌肉之间，抵御外邪入侵机体，护卫肌表，与自噬清除体内受损的细胞器，降解转化细胞分泌的代谢物或蛋白等方面具有相似性。 从微观角度研究，细胞自噬可能与中医的“气虚”“痰凝”“血瘀”密切相关[26]，正气不足，脏腑功能失调，痰由内生，日久则瘀阻脉络。这3者也是大多数缺血缺氧性心脑血管疾病的主要病机。“气”即“正气”，细胞过度自噬导致线粒体的损伤及能量代谢障碍，蛋白质与细胞器的过度降解导致细胞“正气”过度耗损，正气不足则外邪侵犯，加速细胞死亡。“痰”有“津液凝浊，生痰不生血”之说，痰为人体津液代谢失常的产物，而“精微滞留蓄积而为浊”认为精微物质无法输布全身凝集成浊，阻塞脉道，导致痰凝阻滞或痰凝血瘀。部分医家将“痰凝”与细胞自噬联合，认为脑缺血缺氧引起了一系列的细胞变化及微环境改变，浊物不断堆积，形成痰浊、瘀血的病理状态，导致细胞自噬功能受损引发不可逆性死亡，影响血脉运行。“瘀”是心脑缺血性疾病中最常见的病理表现，有研究显示，梗死区部位缺血缺氧[27]，而自噬广泛存在于缺血缺氧细胞中，自噬调节作用失调，导致细胞受损或废弃细胞器大量堆积，血流不畅，而瘀血阻滞导致血栓，脑组织血液供应减慢，加重脑损伤。中医药改善细胞自噬水平的研究已初现成效。临床研究显示，血管软化丸可有效升高脑梗死患者自噬因子微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(light chain 3 antibody Ⅱ，LC3-Ⅱ)、Beclin-1的表达，降低血栓相关因子同型半胱氨酸、血管性血友病因子(von wille brand factor，VWF)、血小板颗粒膜蛋白140(granular membrane protein，GMP-140)的表达，恢复患者自主能力，减轻患者神经损伤[28]；实验研究显示，龙蛭汤含药血清作用于缺血损伤细胞模型，结果显示自噬小体增多，自噬因子LC3-Ⅱ及Beclin-1蛋白表达增加，促进细胞增殖、迁移，细胞管型形成增多[29]；补阳还五汤具有补气、活血、通络的功效，在大鼠缺血模型中，补阳还五汤可以升高p-PI3K、p-Akt及p62蛋白，降低脑缺血半暗带自噬水平，保护脑神经[30]。因此，通过外界刺激调节细胞自噬水平，从而纠正机体阴阳的平衡，改善缺血缺氧性疾病多虚多瘀多痰的病机，可能成为抗衰老研究的有效措施。 从上述文献研究可以看出，探索微环境与细胞自噬的相关性研究仍处于起步阶段，尤其是将中医理论与细胞自噬相结合，无论是从中医传统的阴阳、脏腑、卫气等辨证理论出发，还是借助现代实验技术和量化指标等微观角度探讨气、痰、瘀与细胞自噬及缺血缺氧微环境相关性的研究都稍显稚嫩。停留在理论基础上的研究需要借助分子生物学等手段，对自噬相关分子、信号转导通路进行深入探索，将中医辨证理论体系进一步解读和细化，可能对中医药调控缺血缺氧微环境下干细胞的自噬能力有更深远的意义。 2.3   中西医调控缺血缺氧微环境下干细胞生存的方法   2.3.1   西医学对缺血缺氧微环境下干细胞增殖、分化的调控  国内外学者针对微环境影响骨髓间充质干细胞的增殖、分化和衰老，从不同层面进行研究并取得了很大的进展。最新研究显示， 骨髓间充质干细胞一方面可以通过刺激旁分泌因子促进血管生成，抑制细胞凋亡和衰老，减少瘢痕的形成[31]；另一方面，有学者认为RNA转录组学可能是探索微环境与干细胞内在联系的关键点之一。RNA是调控干细胞的重要因子，在细胞的增殖、分化、凋亡和自噬等方面起到了关键性的作用[32-33]；研究表明，通过上调miR-126因子，在缺氧条件下间充质干细胞中的血管内皮生长因子被释放，促进缺血条件下组织的血管生成，并在其维持血管稳态方面发挥重要作 用[34-36]；miRNAs是调控骨髓间充质干细胞增殖、分化和存活的重要表观遗传调控因子，与疾病和缺氧适应密切相关[37]，通过转录后可以调控靶基因表达，增强间充质干细胞中血管内皮生长因子的分泌。如miR-126及miR-210都具有促血管生成的特性[38]，在低氧条件下可以刺激细胞的表达，尤其是 miR-210是缺氧特异性微小RNA，在缺氧环境下miR-210对细胞增殖起抑制作用，且miR-120的过表达可以较长时间抑制线粒体的新陈代谢，减弱DNA损伤修复的能力。XIN等[39]发现结扎大脑中动脉诱导脑卒中后，给予间充质干细胞治疗可显著促进神经修复，miR-133b靶点结缔组织生长因子在缺血边界区的表达显著降低，并刺激正常组织和缺血微环境交界区的神经发生和血管生成。多种信号途径可调节干细胞自噬水平，mTOR和AMPK是哺乳动物调节自噬的2个主要途径[17]。mTOR是免疫抑制剂，可以用于免疫疾病与器官移植引起的排斥反应治疗，改善微环境的状态促使干细胞保持活性，提高细胞抗衰老的能力[22] 。 RNA转录组学的研究在体外实验中已经取得一定成绩，对很多难治性疾病的疗效也已经证实。但非编码RNA (ncRNAs)存在众多，对其生物学的理解还远远不够，尤其是长链非编码RNA (lncRNA)和环状RNA(circRNA)的作用和意义更复杂和广泛，它们的作用机制及其交互作用还没有完全被描述到[40]。干细胞的移植研究存在诸如诱导增殖、定向分化、安全性及疗效等问题，基因修饰或用细胞分子和药物干预骨髓间充质干细胞又存在诸多不良反应，成为现代医学需要攻克的难题。 2.3.2   中医学对缺血缺氧微环境下干细胞增殖、分化的调控  与西医学着眼于移植和从外部植入细胞的不同，国内外学者根据中医的理论基础，研究认为中药复方、中药单体或单体活性成分，以其潜在的成分-靶点相互作用来治疗各种疾病，在降低不良反应的同时最大化治疗效果，在优化微环境方面有显著的功效。改良缺血缺氧微环境使之更适合干细胞生存的思路与中医通过调整机体阴阳的大环境治疗疾病的观点不谋而合。中医药一方面可以直接作用于干细胞，提高骨髓间充质干细胞的增殖率、分化率及抗衰老能力。例如益肾通络方含药血清中、高、低剂量组可以促进骨髓间充质干细胞体外增殖的作用[41]，其中低剂量组作用最明显。淫羊藿苷可以保护心肌缺血再灌注损伤[42]，将淫羊藿苷诱导后的骨髓间充质干细胞经尾静脉注入心肌梗死大鼠体内，一定量的淫羊藿苷可以明显促进骨髓间充质干细胞活性及迁移能力，促进肌球蛋白重链(MHC)中α-MHC、β-MHC mRNA的表达，提高心肌特异性蛋白结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnT)、血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的基因表达，但高浓度的淫羊藿苷却对骨髓间充质干细胞的活性有明显抑制作用。银楠楠等[43]针对通窍活血汤对骨髓间充质干细胞的增殖分化机制作出研究，认为通窍活血汤可以促进骨髓间充质干细胞的增殖及向神经元样细胞分化，这一作用可能是因为激活了Wnt通路。倪广晓等[44]研究发现隐丹参酮可诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，与激活了Wnt/β-catenin信号通路有关；另一方面中医药可以通过影响微环境，促进其存活及功能的建立。如益气复脉散通过改善心功能，修复组织受损结构，减少心肌梗死后心肌氧化应激、坏死、胶原沉积和心肌纤维化，从改善大环境到改良微环境治疗心血管疾病[45-47]。 加味丹参饮含药血清干预骨髓间充质干细胞，促进骨髓间充质干细胞的增殖分化，增强骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，可以有效改善微循环，促进梗死区血管新生，使缺血心肌得到保护[48]。张金生等[49-50]通过活血化瘀方药改善缺血缺氧微环境，提高干细胞的存活率、抗凋亡能力以及增殖分化效率，修复缺血组织损伤。此外，中医药还可以通过调节机体的免疫水平，改善机体的免疫排斥现象，同时调节机体的代谢水平，改善血管循环。有学者基于补肾化瘀生新理论提出了干细胞“肾属性”的观点，来探讨疾病与微环境的关系[51]。如年老肾虚，气化功能减退，导致机体气滞、血瘀、痰凝，这些病理产物会影响机体的代谢和免疫水平，从而加速衰老。随着年龄增长，元气耗损加速，则会加速肾气衰竭。若肾气衰退程度较轻，稍损正气，则血瘀、痰浊等病理产物产生缓慢，衰老缓慢；若肾气衰退程度较重，正气严重不足，痰浊、瘀血等病理产物会导致机体代谢减弱，免疫水平低下，从而加速衰老。因此，补肾填精使机体肾气充足，从而滋养后天之本，使脾胃健旺，气血生化充盈，进而提高机体的代谢水平以及免疫水平；活血化瘀可使机体血瘀消散，气机升降正常，气血通畅，濡养全身，亦可以提高机体的免疫水平，延缓机体的衰老。补肾法与活血化瘀法的结合，加速生新血、生新物、化旧生新的同时，还可以改善血管循环，从而提高机体免疫水平，延缓衰老。 采用中药单体改良干细胞生存的微环境是在中药复方基础上的进一步探索，中药单体与复方相比，其化学结构清晰，药效明确。最新药理学研究证实，随着中药提纯技术的进步以及血清药理学的不断发展，某些单味中药或中药提取物可以有效诱导干细胞定向分化为目标细胞，且无毒副作用，这为中医药作为诱导分化剂及治疗疾病提供新的理论依据[52]。三七具有化瘀止血、活血定痛的功效，是血塞通的主要成分，现代药理研究显示其还具有抗炎、促进造血、抵抗心律失常及止血等功能。三七总皂苷是三七的多种组分之一[50，53]，可以提高骨髓间充质干细胞的出髓效率，增加外周血中骨髓间充质干细胞数量，动员骨髓间充质干细胞归巢至受损心肌部位，向心肌细胞分化，修复缺血组织的受损程度。三七总皂苷的中、高剂量组可以有效促进脑梗死缺血区骨髓间充质干细胞的增殖活性[53-54]，这与过表达MAP-2、Ⅲβ-Tubulin型微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白等因子有关，且随着缺血时间的延长，三七总皂苷的作用越加明显。另一项关于三七总皂苷与红景天苷、黄芪有效组分相比较，3组药物均有动员骨髓间充质干细胞归巢的作用，具有活血化瘀功效的三七皂苷作用最明显。人参皂苷Rb2是三七总皂苷的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗氧化应激、抗疲劳、抗炎及免疫改善等多种药理活性，且在对抗缺血性心肌病方面，可以有效扩张血管、增加血氧容量、增强心肌收缩力[8，55]。但人参皂苷Rb2干预缺血缺氧微环境，改善干细胞的增殖、分化和抗衰老能力的研究尚少。 因此，运用中药复方、单味药或中药单体在体外对干细胞进行预处理，改善缺血缺氧微环境下干细胞的耐受性，提高干细胞的存活率；或改良缺血区的局部微循环，促进缺血组织再生和修复，具有重要研究意义。"