2.1  淫羊藿苷对软骨的作用  在关节软骨中软骨组织包围在蛋白多糖的基质中，胶原保持软骨细胞的稳定，软骨细胞与基质之间持续存在合成与降解的平衡，而代谢平衡又受生长因子和酶的调节。细胞、基质、体液、滑液及软骨来源的介质的改变均可引起骨性关节炎。 由于软骨的神经、血管和淋巴供应不良，以及软骨细胞成熟度高，再生能力差，关节软骨的损伤通常很难修复或自我愈合。关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质构成, 软骨细胞能够合成细胞因子及外基质成分, 正常生理状态下维持关节软骨代谢平衡。所以提高软骨细胞的数量和促进细胞外基质的分泌成为治疗骨性关节炎的一个重要突破点。 2.1.1  淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用  骨髓间充质干细胞是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经以及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，骨髓间充质干细胞成软骨分化可以从根本上增加软骨数量，有利于软骨缺损修复。在正常细胞环境下，骨髓间充质干细胞向不同细胞系的分化保持平衡，贺宪等[2]发现在体外培养下骨性关节炎家兔骨髓间充质干细胞软骨定向分化能力下降，而脂向分化能力增强，提示骨髓间充质干细胞的分化紊乱可能会导致骨性关节炎, 同时也发现淫羊藿苷能有效地促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化并能提高软骨细胞特有的蛋白质产物。JIAO等[3]的研究结果表明淫羊藿苷通过MAPK信号通路诱导肌动蛋白应激纤维形成，从而促进骨髓间充质干细胞向软骨缺损区的聚集。WANG等[4]在淫羊藿苷在自组装肽纳米纤维水凝胶支架中促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞稳定分化的研究中：通过检测Ⅱ型胶原和Sox9等软骨分化标志物，发现淫羊藿苷能促进骨髓间充质干细胞的软骨分化并抑制软骨细胞肥大分化。黄荷等[5]发现相比于淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组和未诱导组，淫羊藿苷高剂量组与加入诱导液的对照组的Ⅱ型胶原和糖氨聚糖含量丰富，且两组间差异无统计学意义，说明淫羊藿苷跟诱导液一样能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。因此骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化可能是药物治疗骨性关节炎的重要途径之一，淫羊藿苷能有效修复软骨病损。 2.1.2  淫羊藿苷对软骨细胞增殖与凋亡的作用  骨性关节炎软骨细胞的增殖和凋亡与骨关节炎的发生具有重要关系。有研究表明, 骨关节炎组织中发现软骨细胞大量凋亡，较正常软骨组织中的凋亡率明显升高[6]。赵晓燕[7]通过研究淫羊藿苷对人骨关节炎软骨细胞增殖凋亡的影响发现各种浓度的淫羊藿苷都能使凋亡率明显下降。桑敬伟等[8]通过淫羊藿苷作用于TDP-43慢病毒载体转染后的人软骨细胞，证实淫羊藿苷可以干预TDP-43基因的过表达介导的炎性因子分泌，抑制缺血缺氧应激依赖的JNK和p38MAPK信号通路的激活，从而阻止TDP-43导致的软骨细胞凋亡的发生。中药血清药理学在某种程度上能科学、客观地分析中药单体及其复方的物质基础和中药复方配伍规律等。张君涛等[9]研究发现单纯淫羊藿苷原液对兔软骨细胞生长有抑制作用，而低剂量仙灵骨葆胶囊含药血清和低浓度淫羊藿苷含药血清都能促进兔软骨细胞大量增殖和糖胺聚糖的分泌，两者在统计学上无差异，但低浓度淫羊藿苷含药血清组的增殖趋势更大。 骨膜细胞是软骨细胞的前体细胞，李红明等[10]发现淫羊藿苷可以通过增殖骨膜细胞来间接增加软骨细胞数量。路丰军[11]将软骨细胞接种在3D打印制备的含有淫羊藿苷的复合支架上，根据MTT实验和糖氨聚糖分泌检测情况得出：淫羊藿苷在0.1-100 mg/L浓度范围内均能促进软骨细胞的增殖、分泌，其中低浓度的效果更明显，而浓度过高反而会抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，这也与何李乐等[12]的研究结论相仿。王鹏珍等[13]研究发现淫羊藿苷能使软骨细胞向软骨组织演进，猜想可能是因为Gelfoam材料使软骨细胞聚集成团，形成一个相对缺氧的3-D环境。在这种环境下，淫羊藿苷刺激低氧诱导因子结合到乏氧反应元件(HRE)，激活其转录，从而诱发Sox9、蛋白聚糖和胶原蛋白Ⅱ的表达。BAHRAMI等[14]的研究发现淫羊藿苷与转化生长因子β3具有协同作用，均能增加细胞的增殖率和活力(P > 0.05)，并且sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达也显著增加。蔡希[15]将淫羊藿苷与壳聚糖(CHS)形成共价后再与透明质酸(HA)复合制备成Ica-CHS/HA支架，软骨细胞随着培养时间明显增殖，并且在14 d时一些细胞出现纤维化现象，说明该软骨组织工程支架通过酰胺键和酯键断裂持续缓慢释放的淫羊藿苷有利于软骨细胞的增殖和软骨细胞表型的维持。李伟等[16]在软骨缺损处分别植入协载淫羊藿素的多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物/磷酸三钙材料(实验组)、植入多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物/磷酸三钙材料(对照组)和不植入材料(空白组)，6个月后CT显示实验组膝关节材料构建骨形态结构良好，软骨组织色泽接近正常；对照组骨形态结构稍差，软骨色泽稍灰暗；空白组骨支架结构丧失，软骨色泽灰暗。刘益杰等[17]通过白细胞介素1β刺激软骨细胞, 模拟软骨细胞炎性损伤和退变的病理, 观察不同浓度淫羊藿苷对软骨细胞退变的干预作用。其实验结果与王鹏珍团队[13]一致：“短期”内高浓度的淫羊藿苷会抑制软骨细胞增殖，但随着时间的延长，各浓度的淫羊藿苷表现为促进作用。所以淫羊藿苷影响软骨细胞代谢的量效关系和作用机制, 仍有待进一步研究和探索。 2.1.3  淫羊藿苷对软骨细胞外基质的影响  细胞外基质主要由Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(aggrecan，Acan)构成。Ⅱ型胶原分布于软骨组织之中，发挥着吸收和分散压力的作用，蛋白聚糖覆盖于胶原纤维的表面, 对胶原纤维骨架起到良好的保护作用, 二者共同维持着软骨的生物力学性能。有文献报道，多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)/淫羊藿苷支架能保持关节软骨的功能形态，抑制软骨下骨小梁的吸收，促进细胞外基质的合成[18]。张君涛等[19]研究发现淫羊藿苷与透明质酸结合物能明显提高Ⅱ型胶原的表达。有研究发现基质金属蛋白酶能直接降解Ⅱ型胶原, 破坏软骨的骨架结构[20]，整合素蛋白亚型和凝血栓亚型的金属蛋白酶(ADAMTS蛋白酶) 在蛋白聚糖降解过程中起决定性作用[21]。李安琪等[22]发现淫羊藿苷能下调软骨细胞基质金属蛋白酶13、ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达, 促进Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成, 逆转白细胞介素1β造成的细胞外基质稳态失衡, 从而起到软骨细胞保护作用。有文献报道，Sox9是早期软骨发育的一个必不可少的转录因子,能直接激活软骨细胞外特异基质基因[23]。刘益杰等[17]研究发现淫羊藿苷能影响软骨细胞基质微环境, 促进软骨细胞表型基因表达。相比于炎症刺激组(白细胞介素1β诱导软骨细胞退变)，淫羊藿苷低、高剂量组的糖氨聚糖浓度均显著升高(P < 0.05), 而Ⅱ型胶原含量于淫羊藿苷低剂量组(ICA-L组)降低，而淫羊藿苷高剂量组(ICA-H组)升高, 但差异均无统计学意义(P > 0.05)。ICA-L组Acan/Sox9 mRNA表达升高(P < 0.01), ICA-H组Ⅱ型胶原mRNA水平升高而基质金属蛋白酶13 mRNA表达降低(P < 0.01)。LUO等[24]研究发现淫羊藿苷通过增加Ⅱ型胶原α1和降低X型胶原和基质金属蛋白酶13的表达来减轻软骨的退行性变。ZHANG等[25]发现含淫羊藿苷的血清与透明质酸联合应用不仅能促进糖氨聚糖分泌，还可以促进软骨缺损的修复，增加软骨的新生。ZENG等[26]发现p38和ERK的抑制有助于淫羊藿苷对基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶3的抑制，而p38和JNK的抑制则有助于淫羊藿苷抑制基质金属蛋白酶13，从而提示淫羊藿苷可能通过MAPK途径抑制基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13来发挥软骨保护作用。T1ρ成像能对软骨基质内多种成分的理化改变进行定量反映，软骨细胞外基质中的蛋白多糖及胶原网对水分子有吸附作用。有文献表明当细胞外基质破坏时,结合水减少，自由水增加，T1ρ值发生改变。张景等[27]发现骨性关节炎模型的关节软骨T1ρ值升高，组织学检查提示软骨浅表层蛋白多糖减少。经过药物干预后，淫羊藿侧关节软骨T1ρ值较用药前减低(P < 0.05)，蛋白多糖含量增加。早发现、早诊断和早治疗可以延缓病情发展，MRI的T1ρ序列在骨性关节炎的早期诊断中具有一定的参考价值。从上述研究中可以发现淫羊藿苷能通过抑制软骨细胞外基质的降解来延缓软骨组织破坏。 2.2  淫羊藿苷对软骨下骨的作用  软骨下骨作为关节的重要组成部分，主要作用是吸收应力、为软骨提供营养、缓冲震荡以及维持关节形状等[28]。骨性关节炎骨端发生的病理变化主要包括骨重建及骨质硬化，包含软骨下骨密度增高、骨量增加。骨重建是指骨组织的形态和密度随着生物力学环境的改变而改变的生理行为，载荷高的地方骨的质量和密度增高。正常生理情况下，骨重建是通过成骨细胞的成骨活性和破骨细胞的降解活性来维持一个动态平衡。 2.2.1  淫羊藿苷对破骨细胞的作用  骨性关节炎的早期病理变化主要表现为骨吸收增强，破骨细胞溶骨作用增强，软骨下骨骨质疏松，骨量减少，骨小梁变薄[29]。彭晨健等[30]在手术后第12周对植入物行Masson和TRAP染色：磷酸三钙复合淫羊藿苷复合支架组的成骨细胞增殖低于自体骨组，但高于磷酸三钙组；磷酸三钙复合淫羊藿苷复合支架组的破骨细胞数少于磷酸三钙组，与自体骨组比较无差异。实验说明淫羊藿苷可促进成骨细胞增殖分化，抑制破骨细胞活性。核因子κB受体活化因子和核因子κB受体活化因子配体结合后激活信号通路，使破骨细胞前体分化，促使破骨细胞成熟，发挥骨吸收作用。相关研究表明骨保护素能阻断核因子κB受体活化因子与核因子κB受体活化因子配体的结合，抑制破骨细胞的成熟，从而抑制骨吸收作用。邓君等[31]研究发现淫羊藿苷能促进骨保护素的表达。WEI等[32]的研究表明淫羊藿苷通过降低核因子κB受体活化因子配体表达和增强骨保护素表达水平来抑制关节骨丢失，防止关节破坏。不难从上述研究中发现淫羊藿苷可抑制破骨细胞的破骨作用, 从而达到保护软骨下骨的目的。但这些实验仅限于动物实验, 在临床是否有效仍有待进一步研究确认。 2.2.2  淫羊藿苷对成骨细胞的作用  骨性关节炎早期破骨细胞溶骨作用增强，致使软骨下骨成骨及矿化障碍，正常的生物力学失去平衡，加速了骨关节炎的发生与发展。所以早期促进成骨和清除矿化障碍可能具有一定的积极治疗意义。《医经精义》：“肾藏精, 精生髓, 髓生骨, 故骨者肾之合也。髓者，肾精所生, 精足则髓足, 髓在骨内, 髓足则骨强”，明确指出肾中精气在骨的生长过中起了极其重要的作用。淫羊藿苷作为经典的补肾强筋壮骨中药的单体，其对成骨细胞的促进作用越来越被证实[33-34]。在补肾中药成分配伍对成骨细胞成骨活性影响的研究中[35]，发现淫羊藿苷组的成骨细胞增殖能力和碱性磷酸酶活性比对照组强。有研究发现，淫羊藿苷也能提高骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和增加钙化结节数，可以作为一种骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的诱导剂[36]。谢利娜等[37]在观察淫羊藿苷与骨形态发生蛋白2对体外培养成骨细胞增殖的影响时发现，淫羊藿苷能促进骨形态发生蛋白2、骨保护素的蛋白表达和上调骨形态发生蛋白2、骨保护素和碱性磷酸酶的mRNA表达，从而增加成骨细胞数量。涂艳等[38]通过研究淫羊藿苷对成骨细胞成骨分化的影响及Wnt/-catenin信号系统的关系，发现淫羊藿苷可以通过激活Wnt/-catenin信号通路，提高-catenin和Runx2的蛋白表达水平和Wnt10b、GSK-3、-catenin及LEF1表达水平来促进骨髓间充质干细胞成骨分化。宋利格等[39]研究发现淫羊藿苷能快速激活成骨细胞中ERK和JNK信号而上调碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素基因的表达，进而在成骨细胞的各个阶段增加成骨能力。YANG等[40]研究Ica-HA/COL水凝胶促进骨软骨界面修复的潜力，发现其能通过上调RUNX2、碱性磷酸酶和骨钙蛋白等成骨基因而能同时促进软骨形成和成骨。LIU等[41]观察地塞米松诱导的大鼠关节软骨和软骨细胞对淫羊藿苷治疗的反应，发现淫羊藿苷不仅消除了地塞米松对软骨细胞miR-206表达的抑制作用，而且还消除了地塞米松对组织蛋白酶K表达的增强作用，能显著逆转地塞米松诱导的骨降解，并且促进骨再生。低氧诱导因子1α被认为是软骨细胞在软骨发育或修复过程中对氧供应波动做出反应的关键介质，这提示低氧诱导因子1α可能作为调节软骨细胞功能的靶点。WANG等[42]猜想淫羊藿苷可能通过竞争细胞铁离子抑制丙酮酸脱氢酶活性，因此它可能作为低氧诱导因子1α激活剂，通过调节软骨细胞增殖、分化和与软骨下骨形成的整合来促进关节软骨修复。综上，淫羊藿苷可以促进成骨细胞增殖，在骨性关节炎早期促进成骨及解除矿化障碍, 阻止软骨下骨的进一步病变。 2.3  淫羊藿苷对炎症因子致滑膜细胞炎症反应的作用  早期对骨性关节炎发病机制的研究着重于关节软骨与关节周围骨，忽略了周围软组织在病变过程中起到的作用。近几年研究发现，滑膜炎可能是骨关节炎的超早期表现，滑膜炎的发展可能影响骨关节炎的进展。目前研究已经证实，白细胞介素1和肿瘤坏死因子α可能是骨关节炎的始发因子。有文献报道骨关节炎患者血清和关节液中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1水平明显升高[43]，两者具有协同作用。白细胞介素1可以诱导基质金属蛋白酶3的合成, 基质金属蛋白酶3又可以促使软骨基质中的蛋白多糖高度裂解, 最终形成对关节软骨的破坏[44]。白细胞介素10则能够促进抗炎因子的释放, 经常被作为正向调节因子被应用于临床和实验研究[45]。肿瘤坏死因子α能诱导软骨细胞产生白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素12、活性氧和一氧化氮等炎症因子，MI等[46]研究发现肿瘤坏死因子α对软骨细胞的负面影响可通过淫羊藿苷部分阻断。淫羊藿苷通过调节NF-kappaB、MAPK和Akt信号通路来调节炎症细胞因子的产生，从而在骨性关节炎中发挥作用[47]。秦丰伟等[48]研究发现淫羊藿苷和骨髓间充质干细胞共育液能降低关节炎中白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3的表达，升高白细胞介素10的表达。吴迎春等[49]也发现干预后治疗组血清白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平较前明显减少(P < 0.05)。高堪达等[50]通过对淫羊藿苷治疗小鼠骨关节炎后血清学及组织学改变的实验研究发现，相比于早期生理盐水组，早期淫羊藿苷组白细胞介素6含量显著降低(P < 0.05)，并且软骨缺失程度明显改善。潘连红[51]的研究表明淫羊藿苷能够降低基质金属蛋白酶14、GRP78的基因以及蛋白的表达和白细胞介素1β的表达水平，抑制骨性关节炎滑膜细胞的迁移，从而减轻滑膜的继发性病变。HUANG等[52]发现淫羊藿苷通过调节TDP-43信号通路来抑制软骨细胞凋亡和减弱滑膜组织的新生血管形成。PAN等[53]从骨关节炎患者中分离成纤维细胞样滑膜细胞(OA-FLS)，用不同浓度淫羊藿苷进行体外培养。然后观察细胞活力、增殖和迁移情况，通过qRTPCR检测基质金属蛋白酶14、GRP78和白细胞介素1β基因表达水平。发现淫羊藿苷在10 μmol/L以下对OA-FLS表现出低细胞毒性，并在1和10 μmol/L浓度下抑制细胞增殖。淫羊藿苷在0.1-1 μmol/L浓度范围内抑制细胞迁移。不同浓度淫羊藿苷均可降低骨性关节炎发病过程中白细胞介素1β、基质金属蛋白酶14和GRP78三种细胞因子的表达。这些初步结果表明淫羊藿苷可能是治疗骨性关节炎疾病的有效化合物。 "