2.1 种子细胞  种子细胞是组织工程研究最基本的要素，目前研究较常见的主要包括成体细胞与干细胞两大类。 2.1.1  成体细胞 应用于泌尿系组织工程学研究中的成体细胞主要有尿路上皮细胞和平滑肌细胞。两者是再生医学的理想细胞来源之一，利用这些细胞将有效的防止组织排斥、减轻炎症反应。成人上皮细胞有很多重要的功能，如对尿中毒性物质的屏障作用和适应膀胱的体积变化的膨胀能力。另一方面，平滑肌细胞在排尿过程中起到关键作用。这两种类型的细胞均已通过膀胱活检成功地获得。自体组织细胞经过体外培养扩增后，增殖到一定数量即种植于支架材料上，最终形成组织或器官替代材料。 Atala等[2]首次将组织工程学技术应用于临床治疗，治疗7例脊髓脊膜膨出伴发膀胱功能异常的患者。采用胶原和聚羟基乙酸为支架，复合扩增的膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞对患者行膀胱重建术，组织工程膀胱的功能和形态均获得了持续改善。Raya-rivera等[3]在5例尿道缺损的病例中，将组织活检获得的上皮细胞和平滑肌细胞扩增并接种到聚乙醇酸的管型支架上，然后行尿道重建。从患者完成的国际尿控协会的调查问卷、尿液分析与镜检、膀胱尿道造影和尿流量测定结果显示良好的替代性。 然而，由于成体细胞在体外的寿命相对较短，可能难以将它们扩增到大量。并且将患者暴露于额外的因素，可能会对其造成危害。另一个问题是，需要组织工程治疗的患者多存在着泌尿道组织和器官的缺损，这就造成了成体细胞的取材不便。这些缺陷限制了成体细胞在研究及临床治疗中的运用。 目前，有研究显示，颊黏膜上皮细胞也可以作为尿路上皮再生的一个潜在来源为。Lu等[4]将猪颊黏膜移植到缺陷膀胱中，研究表明颊黏膜细胞在膀胱微环境中可以反向分化为膀胱上皮细胞。 2.1.2 干细胞 干细胞是一种多潜能细胞，根据发育阶段不同可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，其特性是体外培养可以无限增殖、自我更新和多向分化。胚胎干细胞在体外培养时，能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型，是组织工程学研究应用的最理想的种子细胞。但是，其来源问题及社会伦理学问题限制了其应用，本文不做过多涉及。而成体干细胞是指存在于已分化组织中的多能干细胞，主要有间充质干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、脂肪源性干细胞、神经干细胞、尿源性干细胞等。成体干细胞与胚胎干细胞相比较，其优势在于：①获取相对容易；②致瘤风险很低；③所受伦理学争议较少。 间充质干细胞一直是成体干细胞中的一个研究热点，Joo等[5]研究表明，肌源性间充质干细胞可以调节调节性T细胞的免疫反应，这使得肌源性间充质细胞作为种子细胞跨越同种异体移植的免疫障碍成为可能。Yuan等[6]研究发现接种脐间充质干细胞的膀胱无细胞基质在促进缺陷膀胱再生方面要优于未接种组，证明脐间充质干细胞可以是膀胱组织工程的潜在的细胞来源。 骨髓干细胞也是成体干细胞的热点，Sharma等[7]的研究表明，自体来源的骨髓间充质干细与CD34+的骨髓干细胞的结合可以为尿路上皮细胞以及血管的快速再生提供了原动力，甚至可以成为膀胱再生各个方面自体替代的细胞来源。 以上几种干细胞虽研究较早，但由于其具有来源较少，提取困难，提取过程对患者痛苦较大等诸多缺点，极大地限制了其在临床的应用。本文主要涉及几种近年来比较热门、较多应用于组织工程研究中的干细胞。 脂肪干细胞：脂肪干细胞是存在于脂肪组织中的间充质干细胞，具有多向分化的潜能。脂肪干细胞作为种子细胞具有以下优势：①能够在体外稳定增殖，其培养条件相对简便；②分化表型稳定，衰亡率低，细胞可传至15代或更多代数；③取材容易，对机体损伤小，体内储备量大。因此，脂肪干细胞是一种具有应用前景的种子细胞，有重要的研究价值，逐渐成为近年来新的研究热点之一。 分离：脂肪干细胞由Zuk等[8]于2001年首次从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离获得。随着对脂肪干细胞生物学特点的逐渐掌握，其分离技术也不断完善从而获得更多数量的细胞。目前最常用的分离方法是将脂肪组织反复冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，剪碎后加入等体积的0.075%Ⅰ型胶原酶。在37 ℃水浴摇床消化90 min接着用1 200 r/min离心5 min，弃上清，最后用含有体积分数10%胎牛血清的培养基重悬脂肪干细胞团，放置培养皿培养。 鉴定：脂肪干细胞尚未发现特异性的细胞表面标志物。因此，免疫组化染色和流式细胞术检测对脂肪干细胞确认只有辅助作用，最主要的方法还是确认其多向分化能力。 分化：脂肪干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，且能分泌多种细胞因子。2005年Jack等[9]研究发现，在人造鼠模型的膀胱及尿道中注射脂肪干细胞，经过术后连续的观察发现：在第8周时注射点附近发现了脂肪干细胞表达平滑肌-肌动蛋白。2006年Rodriguez等[10]成功的在体外将脂肪干细胞扩增分化为平滑肌细胞。以上2组实验结果表面脂肪干细胞在体内外均有分化为泌尿系统平滑肌的潜能。目前，脂肪干细胞向平滑肌细胞诱导的方法已经较为成熟：Brzoska等[11]将脂肪干细胞的体外培养和扩增过程总结如下：将脂肪干细胞在   37 ℃，体积分数5%的CO2条件下，置于平滑肌感应介质(由MCDB131培养基中加入体积分数1%胎牛血清和    100 U/mL肝素组成)中培养3-6周。α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白以及肌球蛋白重链等平滑肌标记物被用来研究基因表达。3-6周分化后，通过PCR检测这些基因的表达。   脂肪干细胞来源于中胚层，向骨、软骨、肌细胞等来源于中胚层的组织细胞分化较为容易。但Brzoska等[11]的研究发现，脂肪干细胞能够在全反式维甲酸的诱导下，表达细胞角蛋白18，且波形蛋白表达减少，这些都是脂肪干细胞向上皮细胞方向分化的表现。Shi等[12]将人脂肪干细胞与尿路上皮细胞一起置于Transwell小室共培养体系上进行间接的共培养，结果表明，脂肪干细胞可以通过间接共培养被有效地诱导成尿路上皮谱系。Li等[13]在体外三维培养体系(3D culture system)中诱导兔脂肪干细胞的上皮细胞分化，诱导后，观察到兔成体干细胞显示出分层上皮样形态，表达早期上皮特异性蛋白。然后将悬浮兔成体干细胞在含有体积分数2%胎牛血清，2.5 μmol/L全反式视黄酸，20 μg/L的表皮生长因子，10 μg/L的肝细胞生长因子，10 μg/L的角质细胞生长因子和0.5 mg/L氢化可的松的LG-DMEM培养液中以3×104/cm2的接种浓度培养，12 d后可用于体内研究。  虽然脂肪干细胞应用于泌尿外科治疗方而取得了一定的进展，但仍存在着较多的问题：①脂肪干细胞的分离及培养模式尚未统一；②缺少特异性细胞表面标记物；③虽然可向多种组织如上皮组织定向分化，但其分化机制未研究明确；④脂肪干细胞的扩增是否会引起癌性病变尚无实验数据证实；⑤现今脂肪干细胞的治疗实验还停留在动物实验的阶段，无临床数据的支持。 尿源干细胞：作为一种新型的干细胞来源，具有良好的多向分化潜能，与其他干细胞比较，尿源性干细胞取材容易，没有创伤性，供应充足可以反复取材，具有良好的多向分化潜能和高度自我更新能力，不会引起伦理上的争议，是一种理想的成体干细胞。 提取：尿源干细胞最早是由Wake Forest大学再生医学实验室分离得到。根据尿源干细胞的分离培养的主要参考文献[14]，总结大致步骤如下：尿源性干细胞取材于人新鲜尿液离心后所得细胞，接种于特殊培养基中，尿源性干细胞在经过二至三代扩增后细胞倍增速度可以达到31.3 h。尿源干细胞虽然取材方便，但目前其组织来源尚未明确，目前有关其来源的研究表明，在接受过男性肾脏肾移植的女性尿液中，提取到的干细胞含有Y染色体，这意味着肾脏可能是这些干细胞的来源。 分化：在体外诱导分化过程中，加入表皮生长因子诱导14 d后，高达90%以上的尿源性干细胞可以表达上皮细胞表面标志物细胞角蛋白7、AE1/AE3及尿路上皮细胞特异蛋白Ⅲ、Ⅰa。而向平滑肌诱导的尿源性干细胞则可以表达平滑肌分化特异性抗原smoothelin。这表明尿源性干细胞可以诱导向尿路上皮细胞和尿道平滑肌细胞分化。Bodin等[15]将在体外经过诱导的尿源性干细胞种植于细菌纤维素支架上，进行3D动态培养2周，发现诱导的尿源性干细胞在支架上形成多层细胞并长人支架中，将种植有细胞的支架移植到裸鼠体内，细胞能继续表达尿路上皮细胞和平滑肌细胞的特异性标志物。表明尿源性干细胞可能作为种子细胞应用于再生医学，随着支架材料的发展，可用于尿道修复及膀胱再造等。 目前对于尿源性干细胞的研究和运用仍然面临不少难题尚待攻克，首先就是尿源干细胞的来源目前尚未明确，只有明确了细胞的来源，才能在尿源干细胞的获取，培养等方面有更清楚的认识；其次是干细胞诱导分化为上皮细胞及平滑肌细胞的过程中条件的选择尚未统一以及移植到体内后长期生物安全性的问题仍未解决；当然，将来尿源干细胞应用于临床的过程中还存在合适的支架材料的选择问题。 近几年来，其他可用于形成泌尿组织的干细胞类型的主要有毛囊干细胞、子宫内膜干细胞、羊水干细胞。Drewa等[16]从毛囊球区域分离出毛囊干细胞并播种到膀胱非细胞基质。其结果显示移植播种毛囊干细胞的区域肌肉层的再生要优于非细胞移植区域。Shoae-hassani等[17]成功将子宫内膜干细胞分化成为平滑肌细胞，并以水凝胶为支架材料应用于女性膀胱壁的再生而不产生任何免疫并发症。然而，由于研究较少，利用这些类型干细胞作为泌尿组织工程学细胞来源是否可行仍需要科研工作及临床工作者进一步的研究与探讨。 2.2 支架材料 组织工程支架材料的选择是另一个重要环节，它是组织细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响种子细胞的生长与分化以及所构成的组织形态和功能。理想的支架材料应具有以下优点：①良好的生物组织相容性，移植到体内后不引起炎症反应和毒性反应；②有可塑性，可塑为任意的结构，植入后在体内仍可保持特定形状具有记忆金属所特有的特性；③有可降解性，能在体内降解然后由自身组织所取代；④降解速率可根据不同细胞再生速率而进行调整；⑤表面无毒性和表面微结构利于细胞的黏附和生长。 应用于泌尿系组织工程的生物支架主要分3大类：①人工聚合材料如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸及聚L-乳酸等；②天然支架材料，如胶原、网状纤维、糖蛋白、蛋白多糖等；③细胞外基质及其衍生物如膀胱细胞外基质、尿道细胞外基质、膀胱黏膜、小肠黏膜下层等。上述3类材料的生物相容性，已通过这些材料与上皮细胞和平滑肌细胞共同培养所测试。各种材料有各自的优缺点。 2.2.1 人工聚合材料 人工聚合材料目前研究最多的有聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸等，这些材料的优点是：具有一定的生物相容性及良好的可塑性；降解速率可以通过改变晶体形状而改变，在体内逐步地分解成小分子如乳酸、羟基乙酸等；其孔径可人为调整，且易通过热塑方式形成人们所需要的形状。其但缺点在于缺少细胞外基质中的各种生物学信号；组织相容性较差，可引起不同程度炎症反应等。Shi等[12]将分化的脂肪干细胞接种到聚乳酸/胶原输尿管支架，并在体外培养1周。支架的生物相容性用扫描电子显微镜和MTT分析进行测试。最后，将细胞/支架移植物皮下植入4周大的雌性无胸腺小鼠，接种到聚乳酸/胶原输尿管支架上的分化细胞存活7 d并在体外维持增殖，这表明该支架具有良好的生物相容性。   静电纺丝技术：是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝，可以生产出纳米级直径的聚合物细丝。其直径小于细胞，可以模拟天然的细胞外基质的结构和生物功能；电纺原料具有很好的生物相容性及可降解性，可作为载体进入人体，并容易被吸收；加之静电纺纳米纤维还有大的比表面积、孔隙率等优良特性，因此，引起了研究者的持续关注，并在生物组织工程等方面得到了很好的应用。Xu等[18]将聚L-乳酸共混物与输尿管细胞外基质通过静电纺丝技术混合制成组织特异性支架。 2.2.2 天然支架材料 包括胶原蛋白、弹性蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、血纤蛋白和透明质酸等。   胶原：胶原在人和动物体内含量丰富、易于提取，炎症反应和免疫排斥反应性很小，应用比较广泛。还具有一下优点：有很高的张力和弹性；胶原含有能促进细胞黏附的因子；其降解率具有可调节性。但也有比较大的缺点如其塑型性差，尚存在外来胶原产生免疫反应的问题等。其中牛Ⅰ型胶原由于其丰富的来源和成功的临床应用而被广泛用来制作组织工程支架。Geutjes等[19]制备的胶原与聚合物复合支架材料在动物模型上成功应用，通过将纯化后的牛Ⅰ型胶原与Vypro®Ⅱ型合成高分子聚合物网结合，得到长12 cm，直径为15 mm的管状结构。 纤维蛋白：纤维蛋白是最早使用的医学材料之一，也是应用较多的生物材料。纤维蛋白的优点：其本身作为天然细胞外基质成分，有较好介导细胞间信号传导及相互作用的性能。纤维蛋白凝胶具有良好的生物相容性和良好的可塑性。纤维蛋白凝胶来源于自身血液，避免了免疫原性问题，是较理想的细胞外基质材料。Zhao等[20]成功将丝素蛋白接枝到双层膀胱无细胞基质制成的膀胱支架运用到大鼠模型，显示出良好的组织相容性。 2.2.3 细胞外基质衍生物 生物衍生材料是运用化学、机械等方法除去组织中的细胞成分，仅保留细胞外基质的材料。生物衍生材料具有以下优点：①具有良好的组织相容性；②具有良好的促组织再生作用；③具有最接近人体的网架结构、生物力学性能、部分活性因子，有利于细胞黏附生长发挥生理功能。 膀胱无细胞基质：是一种理想的生物支架材料，其本质是脱细胞膀胱黏膜下层，一种天然的细胞外基质生物材料。其优点有：①作为生物支架材料生物相容性良好，支架材料可完全吸收；②异种移植生物安全性良好。但有研究表明较大面积的用于膀胱替代治疗可能会出现膀胱穿孔、支架材料萎缩及微结石形成等并发症。 脱细胞羊膜：羊膜是一种天然高分子生物材料，可以采用化学去污剂和酶消化的方法制备。优点是来源广泛，不违背伦理；用其作为膀胱移植物进行膀胱修补可以做到吸收降解迅速，与羊膜相比，既去除了可引起移植排斥反应的细胞成分，又保存了完整的三维结构，为良好的生物支架材料。有研究表明，负载骨髓间充质干细胞或血管平滑肌细胞后构建的组织工程膀胱是理想的替代修补材料。 小肠黏膜下层：小肠黏膜下层是一种新型的脱细胞基质材料。有以下优点：免疫原性低，能完全去除原组织中带抗原的细胞成分，不会引起免疫介导的炎性反应；同时小肠黏膜下层保留了天然的胶原纤维网状结构，并含有多种促组织再生和创面愈合的功能性生长因子。小肠黏膜下层的上述结构和功能特点使其在组织工程研究中得到了广泛的应用。 组织工程化心包：即脱细胞心包膜，是一种在体内和体外均可促进组织再生的富含胶原蛋白的基质。Kajbafzadeh等[21]研究证实，组织工程化心包作为支架材料在膀胱壁的体内培养过程中对细胞与细胞，细胞与基质之间的相互作用起到促进作用。自体细胞种植于组织工程化心包可显著提高其在膀胱壁再生中作用。   高分子支架材料：另外，随着纳米技术的发展，纳米技术逐渐被应用到组织工程领域，主要用作支架材料。纳米材料的一些独特效应如小尺寸效应和表面或界面效应使其能有效的诱导细胞生长和组织再生。许多研究证明种子细胞对纳米级表面结构和三维支架结构能产生应答。多孔高分子支架材料孔洞直径的大小对细胞的黏附、生长、增殖有直接的影响。Kloskowski等[22]应用纳米技术将聚L-丙交酯-共-己内酯制成电纺纳米纤维支架。Seifarth等[23]研究发现，无缝Optimax3D原型管状海绵是组织工程共培养过程中合适的支架材料。   组织工程支架材料在泌尿外科修复重建中需要解决的问题：①一些免疫排斥反应无法避免；②组织工程化组织与人体自身组织有较大差别，其生理功能不能完全替代病损组织；③满足各种需要的细胞外基质替代物仍有待研究；④已经替代的组织在体内是否会产生副作用或其他问题，还需长时间的观察和验证；⑤大块组织的移植由于不能尽快建立血液循环，将会发生缺血性坏死，最终导致移植的失败。 2.3 组织工程化组织构建 输尿管：Shi等[12]构建输尿管支架的方法。首先，将聚乳酸溶于氯仿，并蒸发，以产生0.8 mm厚和2 mm宽的聚合物膜。该膜围绕玻璃棒(8F)包裹以形成螺旋。混合、成形、切割、缠绕、干燥和修整处理之后，输尿管支架的内层形成一个螺旋形设计。支架的外层用网状结构包裹，网状结构的制造可以用聚乳酸和胶原共混物或只用聚乳酸，然后就可以得到一个圆柱状的输尿管支架。将向上皮谱系分化的脂肪干细胞以1×106/cm2的浓度接种到支架上并在培养条件保持2 d，即得到可用于病损替代的组织工程化输尿管。 血管化：组织工程化组织构建的关键是血管化进程。目前关于组织工程复合材料血管化的研究主要包括4大方面：①利用多孔支架材料复合多种相关的种子细胞；②在原有支架材料上复合促进血管长入以及生长的相关生长因子；③在体外或体内建立生物反应环境促使重建材料上血管生长；④上述方法的多重结合。目前研究最热门的方法是网膜包裹和生长因子的复合控释等。 网膜在血管化中的应用：网膜孵化可有如下的优点：①网膜可以使胶原组织快速血管化，为支架结构的早期血供得到保障；②网膜能起到屏障作用，防止包裹在内的胶原基质受到尿液影响而溶解或感染。El-hakim等[24]将种植膀胱上皮细胞的输尿管脱细胞基质包埋于网膜内以促进其血管化进程。由于重建管腔充分血管化的形成，可见输尿管壁内环形肌层和多层移行上皮构建。Baumert等[25]进一步在小肠黏膜下层输尿管支架上复合平滑肌和尿路上皮细胞，之后植入双层网膜内做初期培养，并未观察到明显的腹腔炎症和粘连反应，所有重建输尿管段都保持了原有的管径和长度。回植入体内后，小肠黏膜下层段逐渐与周围正常输尿管组织相融合，同时显示出良好的血管化表现。 生长因子在血管化中的应用：当前利用生长因子促进组织工程骨血管化主要有两种途径：一是将生长因子同支架材料相结合；另一种是将种子细胞和能够分泌所需生长因子的细胞一同移植到支架材料上进行共同培养。 Osborn等[26]研究表明，在组织工程移植物中预先存在的血管可以促进早期灌注、增强移植物再生和功能的长期有效，因此工程化血管移植和早期供体与受体的血管吻合可以保证早期的血液灌注以及膀胱移植的活力。 Vardar等[27]证明，流动生物反应器系统能够有效地提供一个类似于输尿管生理条件的动态环境，即流动生物孵化技术有效应用于组织工程组织的构建。  组织工程血管化的研究除网膜外，客观讲尚处在起步阶段，内皮祖细胞的分选鉴定及培养、生长因子的复合控释、相关基因的转录都有待于进一步解决。但不可否认血管化的应用使得泌尿外科组织工程的研究进一步完善，对其的研究势必成为泌尿外科采用组织工程技术进行修复重建中不可或缺的组成部分。 2.4  病损组织替代  组织工程化组织的植入是泌尿外科组织工程学成功应用的关键之一。 输出道：即尿流改道，改变尿液排出的原有通道。组织工程化组织的病损替代也可以应用尿流改道术。Geutjes等[19]将胶原与高分子聚合物网结合得到的组织工程化管道结构为尿流改道，该管道结构一端与输尿管行无张力端-侧吻合术，输尿管远端关闭，另一端皮肤造口，并放置8FR输尿管导管一根。21 d后去除输尿管导管。1个月之后胶原吸收，形成能承受3.92 kPa压力的腹膜后隧道。Liao等[28]将兔膀胱大部分切除，保留膀胱三角区。组织工程化管道近端与膀胱三角吻合，远端皮肤造口，术后结果显示成功为尿流改道。组织工程化管道的进一步研究与改进，有望逐步替代胃肠道组织为尿流改道。但是人造输尿管假体和生物体吻合的并发症比较常见如吻合口漏、尿外渗和移位等。目前解决办法主要是在输尿管假体外包裹多孔生物材料，如聚乙烯纤维、膨化聚四氟乙烯、涤纶绒等会有助于假体和输尿管的吻合固定及防止尿外渗。 支架管：生物材料替代输尿管失败的原因在于排斥、梗阻、感染、替代管缺乏蠕动功能、尿盐容易沉积或反流等，其中梗阻与反流是主要因素。故生物材料输尿管手术方法与技巧相当重要，目前应用较为突出的是支架植入(如双-J-管)和吻合器的应用。但内支架也有缺点，特别是在一些复杂情况如下尿路梗阻和感染等时禁用。在肾移植输尿管吻合术中，血管吻合器和钛钉均可使输尿管吻合，具有操作简单易行、不漏尿、管腔不易狭窄等优点。"