2.1 正常稳态下小肠干细胞的命运与调控  小肠干细胞位于隐窝的基底部，通常情况下，小肠干细胞在原位通过自我复制、更新，维持一定的常备小肠干细胞数量。此外，大部分小肠干细胞随机产生过渡扩增细胞，过渡扩增细胞经历4-6次快速分裂后，跨越隐窝-绒毛界限向上迁移并逐渐分化为成熟的上皮细胞[5]，主要包括4种细胞类型：吸收型肠上皮细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和潘氏细胞。与其他3种向上迁移至绒毛顶部的细胞不同，潘氏细胞形成后是向下迁移至隐窝基底部，与小肠干细胞间隔排列。小肠上皮隐窝内存在两种类型的小肠干细胞：隐窝基底部的柱状细胞和+4位(从隐窝底部算起的第4个细胞位置，位于潘氏细胞之上)的标记滞留细胞，柱状细胞是镶嵌在潘氏细胞之间的快速分裂细胞，标记滞留细胞是在潘氏细胞之上存在DNA标记滞留现象的细胞[6]。 小肠干细胞的命运受多种信号通路的调控，研究比较明确的有Wnt/β-catenin、BMP、Notch和EGF信号通路，这些信号通路之间相互协调，能根据机体的需要，精确调控小肠干细胞的自我更新和分化成熟，维持正常的肠道功能状态[4]。Wnt/β-catenin是调控小肠干细胞分裂增殖最重要的信号通路，而潘氏细胞分泌的Wnt3a是Wnt配体的主要来源。当Wnt配体运送至靶细胞，与Frizzled受体以及Lrp5/6跨膜共受体结合后，可抑制Axin2、APC、CK1和GSK3β等组成的降解复合物，导致β-catenin在细胞核中聚集，并通过Tcf/Lef转录因子调控转录过程，促进小肠干细胞分裂增殖[7]。与Wnt/β-catenin信号通路作用相反，BMP信号通路促进上皮细胞的分化并负向调节小肠干细胞数量。在隐窝基底层和周边细胞会分泌Noggin和Chordin等抑制因子，抑制小肠干细胞中的BMP信号，维持小肠干细胞的自我更新能力[8]。Notch是另一条调控细胞分化的信号通路，小肠干细胞表面表达该信号的受体，而潘氏细胞分泌的Dll1和Dll4等充当配体。邻近的Notch受体细胞和Notch配体细胞间的相互接触导致Notch胞内段的释放。Notch胞内段与转录因子CSL相互作用，导致Notch靶基因，如Hes1的转录激活。Hes1激活后会抑制分泌型细胞分化的关键转录因子Math1的表达。因此，激活Notch信号可以阻止小肠干细胞向分泌型细胞分化，维持小肠干细胞的自我更新和增殖状态[9]。EFG和它的直系同源物，如肿瘤坏死因子α和上皮调节蛋白是上皮组织的共同生长因子。与EGFR结合，EGF可激活Ras/Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt信号通路，促进上皮细胞的增殖[10]。 多年来，由于能直接证明小肠干细胞特性的特异性标志物不能确定，限制了人们对小肠干细胞生物学行为的认识，相关的基础研究进展缓慢。近年来，小肠干细胞特异性标志物研究不断取得进展，加之细胞谱系示踪技术的应用，小肠干细胞的研究才有了新的突破与进展。细胞谱系示踪技术可以示踪来源于同一细胞的所有子代细胞，是在成体哺乳动物组织中研究干细胞特性的一种重要工具。Barker等[11]利用细胞谱系示踪技术发现了Lgr5可特异性地标记柱状细胞，证实了Lgr5+柱状细胞可长期自我更新和具有多向分化潜能，为深入研究小肠干细胞奠定了基础。随后，陆续有研究用细胞谱系示踪的方法确定+4标记滞留细胞的特异性标记物，如Bmi1、Hopx、mTert等，但对于研究的结果出现了不同的解读[12]。到目前为止，+4标记滞留细胞的特异性标记物仍未能最后确定，+4标记滞留细胞的确切身份及其与Lgr5+柱状细胞之间的关系尚未完全明了。 2.2  Lgr5+柱状细胞在放射性肠损伤后肠上皮再生过程中的作用   放射性肠损伤是一种特殊类型的肠损伤。首先，小肠上皮细胞对放射线的敏感性极高，研究证实放射照射可迅速引起肠上皮细胞出现大量凋亡、坏死、脱落。更为严重的是，放射照射还可引起位于隐窝基底部的Lgr5+柱状细胞的损伤，表现为Lgr5+柱状细胞数量急剧下降，肠上皮细胞自我更新和再生的来源受到严重抑制。这二者的叠加导致放射性肠损伤的程度不断加重，并给损伤后的修复带来极大困难。急性放射性肠损伤主要表现为呕吐、腹泻、胃肠道出血、内毒素血症、继发细菌感染等，若不进行及时有效的治疗，可迅速导致患者死亡。临床上也常见放射性肠损伤逐渐演变为慢性放射性肠炎，肠壁出现纤维化、慢性溃疡和出血，导致肠瘘和肠梗阻的发生，常需反复外科手术，甚至小肠移植治疗。 从理论上分析，放射性肠损伤修复的根本来源只能是Lgr5+柱状细胞，通过Lgr5+柱状细胞自身的复制、更新，再分化为各类功能性的肠上皮细胞，逐步恢复受损的肠上皮。如果急性放射照射的剂量不大，或是慢性的放射照射，那么放射照射后肠隐窝内可能残存一些Lgr5+柱状细胞，由它们复制、更新和分化，修复肠损伤。当放射照射剂量超过一定限度，Lgr5+柱状细胞可能几近消亡，这种严重的情况下Lgr5+柱状细胞的来源就更加艰难，那么此时，作为肠修复的“种子”或称为“储备干细胞”又从何而来？近年来，有学者另辟蹊径，提出了在一定条件下Lgr5+柱状细胞可以经隐窝内其它类型细胞转变而获得内源性补充的新理论。这些细胞对放射照射有一定耐受性，放射照射后能够部分存活并具备一定的功能，当Lgr5+柱状细胞大量丢失时可作为储备干细胞及时转变补充，并获得Lgr5+柱状细胞功能，参与肠损伤的修复。 2.3  储备干细胞来源一：+4标记滞留细胞 寻找确切的储备干细胞的研究工作才刚刚起步，早期研究重点关注的是+4标记滞留细胞，这是因为人们认为小肠隐窝内的Lgr5+柱状细胞分裂增殖活跃，对放疗敏感，主要担负小肠上皮的日常更新任务，而+4标记滞留细胞相对静止，对放疗有一定的耐受能力，而且+4标记滞留细胞的位置与Lgr5+柱状细胞相近，推测其可能在肠损伤后的修复中起一定作用。 Sangiorgi等[13]利用mRNA原位杂交技术发现Bmi1标记的细胞恰好位于小肠隐窝的+4位置，细胞谱系示踪技术证实+4Bmi1+细胞在正常组织稳态时具有干细胞特性，而且利用靶向白喉毒素消除Bmi1+细胞可导致肠道隐窝快速死亡，干细胞区域消失。在另一项实验中，Yan等[14]利用细胞谱系示踪技术研究发现，小鼠放射性肠损伤后隐窝内的Lgr5+柱状细胞快速消失，而Bmi1+细胞能够转变为Lgr5+柱状细胞并快速分裂增殖，参与小肠上皮的修复过程。因此，该项研究结果表明相对静止的Bmi1++4标记滞留细胞对放射性损伤相对耐受，可能作为一种“储备干细胞”在放射性肠损伤后的肠上皮再生过程中发挥重要作用。 有学者利用Hopx-lacZ小鼠模型发现Hopx——一种编码非典型同源盒蛋白的基因，主要表达于小肠隐窝的+4位置。接着，研究者们通过构建Hopx-ires- CreERT2小鼠模型和运用体内细胞谱系示踪技术，进一步发现这些Hopx+细胞在正常稳态时相对静止，对放射性损伤耐受，并且具有对放射性损伤迅速反应和增殖的能力。体外实验发现Hopx+细胞的子代细胞高度表达Lgr5和其他柱状细胞的标记基因，而Lgr5+柱状细胞也可以产生Hopx+细胞。因此，该项研究结果表明快速增殖的Lgr5+柱状细胞与相对静止的Hopx+干细胞位于隐窝内的不同位置，并且可相互转化[15]。 高度表达端粒酶被认为是干细胞的一个重要特征，可维持干细胞染色体末端端粒长度，阻止细胞衰老。通过构建mTert-GFP小鼠模型发现小肠隐窝内存在少量GFP+细胞，并且这类细胞存在核苷标记滞留现象。Montgomery等进一步研究发现mTert可标记与Lgr5+柱状细胞不同的分裂缓慢的小肠干细胞，但是可和Lgr5+柱状细胞一样分化形成所有类型的小肠上皮细胞。为了证实mTert+小肠干细胞在小肠放射性肠损伤后的再生过程中发挥作用，研究者将mTert-CreER小鼠暴露于不同剂量的电离辐射(0，1，10，15 Gy)，在肠道再生反应达到高峰时(4 d)分析隐窝发现LacZ标记的小肠隐窝以正常稳态下8-10倍的速度增殖。因此，该项研究结果表明mTert标记的细胞在正常稳态时增殖缓慢，对放射性损伤耐受，并以剂量依赖性的方式在放射性肠损伤后的再生过程中发挥重要作用[16]。 Itzkovita等[17]采用高度敏感的单个mRNA分子荧光原位杂交技术，发现Bmi1 mRNA表达于所有处于分裂增殖的隐窝细胞中，包括Lgr5+柱状细胞，通过Bmi1蛋白的抗体也发现了同样的表达规律。这些新的研究证据似乎取消了Bmi1作为+4细胞标记物的资格。与Bmi1相似，陆续有研究发现mTert，Hopx等也表达于整个肠道隐窝内，而不是仅仅表达于少量增殖缓慢的+4标记滞留细胞细胞中[18]。因此上述标记的细胞是否就是+4标记滞留细胞？它们与Lgr5+柱状细胞之间究竟是转变关系，或仅是同类细胞间的不同状态目前尚难定论。由于无法准确区分这二类细胞，从+4标记滞留细胞寻找“储备干细胞”的研究暂时陷入停滞。 2.4 “储备干细胞”来源二：早期分泌型祖细胞   近来，寻找“储备干细胞”的研究目标从+4位转向+5位，尤其关注的是早期分泌型祖细胞。早期分泌型祖细胞位于干细胞/潘氏细胞区域上方的“+5”位置，正常稳态下只能产生包含分泌型细胞系的短期克隆，已失去了干细胞的特性。与+4标记滞留细胞不同的是，Dll1标记分子可特异性区分早期分泌型祖细胞与Lgr5+柱状细胞，这为在体内和体外研究这两类细胞的相互关系提供了极大的方便。Van及其研究团队通过对Lgr5+柱状细胞进行细胞谱系示踪发现，注射Cre诱导剂tamoxifen一二天后首先在LacZ标记区域出现Dll1+细胞，由于Lgr5+柱状细胞大约每24 h分裂一次，因此Dll1+细胞恰好在Lgr5+柱状细胞经过一二次细胞分裂后出现，推测Dll1+细胞是Lgr5+柱状细胞的直接子代细胞。进一步研究发现与Lgr5+柱状细胞产生包含各种细胞系的长期克隆不同，位于+5位置的Dll1+细胞只能产生包含分泌型细胞系的短期克隆。而放射性肠损伤后Lgr5+柱状细胞大量消失、小肠隐窝组织结构严重破坏，此时再次对Dll1+细胞进行谱系示踪，发现LacZ标记的染色体带源自隐窝基底部，持续表达且同时包含分泌型细胞系和吸收型细胞系[19]。因此，该项研究结果提示正常稳态下已失去干细胞特性的Dll1+早期分泌型祖细胞在放射性肠损伤后，可以重新逆转分化成为Lgr5+柱状细胞。 Ki67是在G1-S-G2-M期特异性表达而在G0期不表达的核蛋白，是观察细胞是否处于增殖状态的理想标记物。Basak等[20]利用Lgr5-GFP，Ki67-RFP双基因敲入小鼠分选出四种类型的隐窝细胞：Lgr5highKi67+分裂干细胞，Lgr5highKi67-静止干细胞，Lgr5lowKi67+增殖隐窝祖细胞和Lgr5lowKi67-静止隐窝祖细胞。体外培养实验提示Lgr5highKi67+和Lgr5highKi67-培养形成肠道类器官的能力相似，Lgr5lowKi67+的能力较弱，而Lgr5lowKi67-则已失去干细胞克隆增殖的能力。进一步研究发现Lgr5lowKi67-表达多种与分泌型细胞分化相关的转录因子，且这类细胞几乎不表达Notch1mRNA，却富含可以在胰腺形成过程中抑制Notch信号通路的St18。标准化的富集评分发现Lgr5lowKi67-细胞和Dll1+细胞具有很高的相似度。因此，该项研究结果提示Lgr5lowKi67-细胞属于早期分泌型祖细胞，这类细胞在正常稳态下增殖缓慢且对放射性损伤不敏感，是储备干细胞的良好来源。 在另一项研究中，Buczaki等[21]采用H2B-YFP识别和分离小肠隐窝内的标记滞留细胞，发现分离的标记滞留细胞呈现出一种混合的表型，表达的标记分子涉及潘氏细胞，肠内分泌细胞和+4小肠干细胞。该项研究接着利用谱系示踪方法，选择性地标记标记滞留细胞并且分别追踪这些细胞在正常稳态和放射性肠损伤两种情况下的分化行为。正如实验预想的一样，标记的标记滞留细胞在正常稳态时活动相对缓慢，只能分化形成潘氏细胞和肠内分泌细胞，属于早期分泌型祖细胞。然而，在放射性肠损伤后，这些细胞开始迅速分裂增殖，并且可分化形成所有类型的小肠上皮细胞，参与小肠上皮的再生反应，证明这些细胞已经获得了Lgr5+柱状细胞的特性。因此，标记滞留细胞在正常稳态时是只能分化形成潘氏细胞和肠内分泌细胞的早期分泌型祖细胞，但当放射性肠损伤后，这类细胞表现出可塑性，迅速逆转分化为Lgr5+柱状细胞并参与组织的再生。 总之，在小肠上皮隐窝中存在着比之前想象的多的、且对放射性损伤有一定耐受能力的细胞可以作为促进小肠上皮修复的储备干细胞。Dll1+早期分泌型祖细胞在一定条件下逆转分化为Lgr5+柱状细胞，因此可以通过人工干预的方法调控Dll1+早期分泌型祖细胞的逆转分化过程，获得内源性的Lgr5+柱状细胞，加速放射性肠损伤的修复过程。 2.5  放射性肠损伤后肠上皮再生反应的调控 越来越多的证据表明巢在干细胞生命过程中发挥着重要的作用[22-24]，干细胞的行为受细胞局部微环境的精细调控，这样可以使干细胞的分裂增殖活动与机体组织的需求相协调。干细胞巢由多种细胞与细胞外基质构成，释放多种信号维持其自我更新、增殖和分化能力。在小肠上皮中，Lgr5+柱状细胞位于隐窝基底部，被周围的基质微环境包围，基质包括多种成分和细胞类型，如细胞外基质，纤维母细胞，肌成纤维细胞，以及淋巴细胞等。每一类型细胞都可以分泌多种细胞相关配体和可溶性因子，构成复杂的调控网络，共同参与调控Lgr5+柱状细胞的行为[1]。在小肠隐窝中Lgr5+柱状细胞与潘氏细胞紧邻，此前已有较多的研究证明潘氏细胞可以产生多种关键信号通路的配体，如Wnt3a、Dll1、Dll4和EGF等，调控Lgr5+柱状细胞的自我更新，维持其正常的数量和功能[25]。 在放射性肠损伤后肠上皮再生过程中，隐窝细胞的可塑性可能与残存干细胞巢释放的信号因子密切相关。有研究发现Dll1+早期分泌型祖细胞在Han Clevers体外标准培养系统下不能形成小肠类器官，表明该细胞已失去了干细胞的特性，但是当在体外标准培养系统中加入外源性Wnt3a后，观察到Dll1+早期分泌型祖细胞又可以与Lgr5+柱状细胞一样形成的小肠类器官，证明Wnt3a能够促进Dll1+早期分泌型祖细胞逆转分化为Lgr5+柱状细胞。因此，该项研究结果表明干细胞巢中的Wnt3a信号因子与隐窝细胞的可塑性密切相关[19]。 近年来，随着对基础免疫研究的不断深入，固有淋巴细胞的作用越来越受到人们的关注。根据表型特征和功能可将固有淋巴细胞分为3种类型：1型固有淋巴细胞，主要分泌γ干扰素；2型固有淋巴细胞，主要分泌白细胞介素5和白细胞介素13；3型固有淋巴细胞，主要分泌白细胞介素17和白细胞介素22[26]。研究证明固有淋巴细胞不仅参与调节免疫和炎症反应，抵御病原体的入侵和感染，还在组织修复、黏膜稳态维持中发挥重要作用[27]。早在1996年研究者就发现在肠道隐窝下方的固有层内存在数以千计的包含3型固有淋巴细胞的淋巴结。2012年，Hanash等[28]发现在移植物抗宿主反应的实验模型中，3型固有淋巴细胞可以与Lgr5+柱状细胞相互作用，并且通过分泌白细胞介素22保护Lgr5+柱状细胞免受T细胞介导的细胞死亡作用，降低肠道组织对免疫排斥反应的敏感性。Aparicio- Domingo等[29]在放射线和甲氨蝶呤诱导的小鼠小肠上皮损伤的实验中均发现3型固有淋巴细胞能够保持活性，并通过激活肠上皮细胞，在小肠上皮修复的过程中发挥作用，而3型固有淋巴细胞分泌的白细胞介素22是参与该过程的重要效应分子。Lindemans等[30]发现放射性上后隐窝内的白细胞介素22及白细胞介素22受体表达增加，提示3型固有淋巴细胞分泌的白细胞介素22参与组织损伤后小肠干细胞区域的调节，进一步研究发现白细胞介素22可能通过激活Lgr5+柱状细胞中的STAT3信号通路促进Lgr5+柱状细胞分裂增殖。上述结果揭示了3型固有淋巴细胞先前未被重视的功能，即这类细胞可与Lgr5+柱状细胞相互作用，参与调节小肠上皮对组织损伤的反应过程。 白细胞介素22是3型固有淋巴细胞分泌的重要细胞因子，是白细胞介素10细胞因子家族的一个成员[31]。近年来，白细胞介素22在上皮损伤中的保护作用越来越受到关注，该细胞因子由淋巴细胞分泌，且主要作用于上皮细胞，被认为是淋巴细胞和上皮细胞之间的信使分子。之前的研究已经表明白细胞介素22在呼吸机相关的肺损伤，胰腺炎及肝损伤等小鼠模型中可保护上皮组织，促进上皮再生[32]。在小肠黏膜上皮，3型固有淋巴细胞分泌的白细胞介素22与潘氏细胞分泌的Wnt3a一样，可直接作用于Lgr5+柱状细胞，促进小肠上皮组织损伤后Lgr5+柱状细胞数量的恢复，促进肠黏膜屏障的修复。  这些研究证据进一步扩展了人们对Lgr5+柱状细胞巢的理解：不仅潘氏细胞和基质细胞可以通过分泌相关因子调节局部微环境，参与Lgr5+柱状细胞功能状态的调控，3型固有淋巴细胞也具有同样的作用。而且，从结构排列上分析3型固有淋巴细胞位于肠隐窝的内侧，对放射照射有很好的耐受能力。因此，3型固有淋巴细胞有可能作为放射性肠损伤修复过程中内源性途径补充Lgr5+柱状细胞丢失的调控新靶点。"