2.1   谷胱甘肽参与维持干细胞的干性    2.1.1   谷胱甘肽参与干细胞的活性氧代谢   干细胞的氧化还原状态是由活性氧与细胞抗氧化体系共同决定的，当活性氧的产生超过由氧化还原酶和其他抗氧化分子组成的细胞抗氧化体系的处理能力时，干细胞就会发生氧化应激。因而，干细胞自身抗氧化性主要是通过增加活性氧的清除能力和减少活性氧分子的产生来维持，而谷胱甘肽可以通过参与这2种途径来降低细胞内的活性氧水平，从而维持干细胞内活性氧的低水平状态。谷胱甘肽水平较高的干细胞将会得益于这一较高的抗氧化状态[16]。已有研究表明，较低水平的活性氧有利于维持干细胞的自我更新及防止可能发生的不利突变，而这些不利突变往往会损害到遗传基因组的完整性[17]。活性氧对干细胞的损伤机制主要是通过诱导信号蛋白中巯基氧化，导致与细胞正常生理功能相关蛋白的活性发生改变。而还原型谷胱甘肽可以通过巯基与羟自由基等活性氧分子直接反应，使其转化为易被代谢清除的惰性产物，从而将这些活性氧分子排出体外[18-19]。在完成对活性氧分子的清除后，细胞中的还原型谷胱甘肽自身可以在谷胱甘肽过氧化物酶的催化下生成氧化型谷胱甘肽，然后通过谷胱甘肽还原酶消耗还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine  dinucleotide phosphate，NADPH)将其还原为还原型谷胱甘肽，以保证谷胱甘肽的抗氧化作用在干细胞内持续发生以及细胞抗氧化系统的维持[20]。通过谷胱甘肽的代谢循环，维持了干细胞的低活性氧水平，防止了干细胞的氧化损伤，保证了干细胞多种功能的正常进行。由于细胞内活性氧分子主要来源于NADPH氧化酶，故有研究发现还原型谷胱甘肽也可以通过抑制NADPH氧化酶的活性来减少活性氧的产生[21]。通过活性氧清除能力的增加以及活性氧生成能力的减少，谷胱甘肽有效保证了干细胞的正常功能活动。 2.1.2   谷胱甘肽能防止干细胞的损伤，促进干细胞的自我更新   作为细胞凋亡早期的一个潜在的激活信号，还原型谷胱甘肽可以通过调节氧化还原信号影响DNA的合成、转录和修复，故还原型谷胱甘肽的消耗会导致DNA损伤甚至细胞凋亡，导致众多疾病的发生[22-23]。增加谷胱甘肽在细胞内的含量有利于防止干细胞的损伤，促进干细胞的自我更新。在干细胞的体外培养、保存、移植的实验中发现，还原型谷胱甘肽能保护干细胞的生物活性，提示了还原型谷胱甘肽在细胞培养和干细胞移植等研究方面的重大应用前景[24-25]，这种保护机制主要是还原型谷胱甘肽通过维持细胞生物膜稳定性来进行的，具体机制可分为2个方面：一是还原型谷胱甘肽的降解产物甘氨酸具有稳定细胞膜的作用，阻止了细胞膜通透性的改变，限制了细胞膜上物质进出孔的扩大[26]；二是谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽的清除作用，清除活性氧攻击生物膜后所产生的脂类过氧化物，减轻了脂类过氧化物对细胞膜造成的损害，保证了生物膜的完整性[27-29]。正是因为这些机制，临床上还原型谷胱甘肽已经成为病毒性肝炎新的治疗手段，配合抗病毒药使用，在抑制病毒活性的同时，也可以有效改善肝细胞内的氧化应激反应，达到延缓肝细胞损伤的目的[30]。除了防止生物膜的损害作用外，谷胱甘肽也参与了DNA的保护作用。在一组诱导性多能干细胞与成纤维细胞的对照实验中发现，较高水平表达的还原型谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶介导了诱导性多能干细胞的DNA损伤保护作用[31]；另一组研究也发现，添加了还原型谷胱甘肽的诱导性多能干细胞也表现出了更强的增殖能力，促进了干细胞的自我更新[32]；而半胱氨酸作为合成还原型谷胱甘肽所必需的合成原料，其进入胞内也可以诱导干细胞快速增殖，缩短细胞周期，增加染色体端粒长度[33]。除了半胱氨酸，ALLAMEH等[34]也发现间充质干细胞添加N-乙酰-L半胱氨酸后，细胞增殖率显著提高，约为原有增殖率的5倍。 除了对干细胞的损伤保护作用以外，还原型谷胱甘肽还与干细胞的免疫调节功能密切相关。如ALLAMEH等[34]发现在骨髓间充质干细胞分化为肝细胞时，还原型谷胱甘肽耗竭会导致白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α等促炎因子的产生，促发细胞炎症反应；相反的是，还原型谷胱甘肽合成增加会诱导抗炎因子白细胞介素10等抑炎因子的产生，从而达到抑制炎症反应的作用。细胞内的谷胱甘肽水平还参与了炎性标志、信号的恢复，可以改善干细胞分化过程中细胞因子的不平衡状态。人胎盘间充质干细胞可以通过增加还原型谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶水平来降低活性氧的产生，进一步降低T细胞表面蛋白PD-1的表达，成功抑制了PD-1+T淋巴细胞的生成，从而减轻移植物抗宿主病小鼠的炎症反应[35]，在急性炎症状态下，可以通过增加N-乙酰-L半胱氨酸促进细胞内抗氧化分子谷胱甘肽的生成，增强骨髓间充质干细胞的抗氧化应激防御能力，提高抗炎活性并促进骨髓间充质干细胞移植后的骨再生过程[36]；临床上常用于重症急性胰腺炎等炎症的治疗，一是可以防止细胞损伤释放炎性因子间接发挥抗炎作用，二是通过直接影响炎性物质的表达来抑制炎症反应[37]。 2.1.3   谷胱甘肽抑制干细胞的衰老和凋亡   随着机体年龄的增长，还原型谷胱甘肽的水平也会逐渐下调，这一现象与部分老年神经疾病罹患率升高有关[38]；与之相反的是，氧化型谷胱甘肽含量会随着年龄的增长而逐步升高，两者之间的一升一降将导致机体内干细胞抗氧化能力的下降[39]，这预示着在机体衰老过程中谷胱甘肽表达含量与细胞衰老的机制密切相关。目前，已经有越来越多的证据表明，氧化还原稳态在抑制干细胞衰老方面起着重要作用[40-41]，特别是活性氧的过度产生将会导致干细胞的氧化应激状态改变，使胞内蛋白发生氧化。若这些胞内蛋白未得到应有的、及时的还原和清除，将会导致脂褐素等蛋白质聚集体的形成和聚集，促进细胞衰老，缩减细胞寿命[42]，而高水平的谷胱甘肽是干细胞在体外扩增过程中维持干细胞功能的必要条件[43]。添加外源性谷胱甘肽将有利于保护干细胞在扩增过程中其功能免受不利因素的影响。LIAO等[21]发现还原型谷胱甘肽可以通过减少活性氧分子的产生来保持脂肪间充质干细胞的干性，同时也发现了还原型谷胱甘肽能抑制长期传代的脂肪间充质干细胞内衰老相关基因的表达，延缓细胞衰老。谷胱甘肽过氧化物酶是细胞内主要的硫醇过氧化物酶，有部分研究认为这些酶类的过氧化与干细胞衰老之间存在潜在的作用机制[44]。另外，WATANABE等[36]发现用N-乙酰-L-半胱氨酸 (N-acetyl-L-cysteine，NAC)预处理间充质干细胞后可以显著提高其在细胞内的还原型谷胱甘肽水平，并阻止过氧化氢诱导的细胞内氧化还原失衡、细胞凋亡和衰老，提高间充质干细胞对氧化应激诱导的凋亡和衰老的抵抗力。同时，N-乙酰-L-半胱氨酸预处理间充质干细胞移植到体内，其移植部位周围细胞的凋亡水平均显著降低而细胞活力明显增加，再一次证实了谷胱甘肽对细胞衰老和凋亡的抑制作用。 2.1.4   谷胱甘肽参与干细胞多能性的维持   SKANDALIS等[45]发现通过诱导激活SLC7A11和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit，GCLM)的转录，可以促进谷胱甘肽的合成，而谷胱甘肽再通过螯合MEK1所需的辅因子——铜离子，引发MEK1-ERK信号失活、FoxO3去磷酸化并发生核移位，促进多潜能性因子Nanog的转录激活。即使在SLC7A11T或GCLM基因敲除的情况下添加外源谷胱甘肽，也能诱导Nanog和OCT4信号分子的表达，以此维持干细胞的多能性。还原型谷胱甘肽主要通过保持干细胞的氧化还原状态来保障转录因子OCT4表达所需要的微环境[46]。同时，谷胱甘肽合成原料之一的谷氨酰胺的高水平代谢对于防止OCT4的降解也是必要的。还原型谷胱甘肽耗竭会引起干细胞内活性氧水平的升高，导致半胱氨酸残基的氧化，从而使OCT4的表达快速下调[46]。OCT4是调节人胚胎干细胞多能性的关键转录因子，不仅能诱导多能性相关基因的表达，而且可以沉默干细胞分化相关基因的表达[47]，OCT4下调将会导致分化相关信号分子的表达显著上调，引起干细胞的自发分化[48]。 2.2   谷胱甘肽参与干细胞分化的调控   还原型谷胱甘肽能诱导干细胞分化为成熟细胞[49]。谷胱甘肽-S-转移酶是依赖还原型谷胱甘肽的一种酶类，其亚型差异对干细胞分化具有一定影响。谷胱甘肽-S-转移酶-P是未分化人骨髓间充质干细胞所表达的主要谷胱甘肽-S-转移酶亚型，而谷胱甘肽-S-转移酶-A1则出现在分化的间充质干细胞中，这一分布的特异性目前被认为是谷胱甘肽-S-转移酶参与分化调控的一种机制[50]。未分化细胞中缺乏谷胱甘肽-S-转移酶-A1可能使干细胞易受损伤，谷胱甘肽-S-转移酶-A1在分化的间充质干细胞中相对较高的表达可以降低化学毒性物质对细胞损害的风险[51]。由此可见，谷胱甘肽-S-转移酶-A1的出现实际上代偿了还原型谷胱甘肽下调所减少的细胞保护作用，这可能是还原型谷胱甘肽通过相关酶类参与干细胞分化调节的一条线索。相关研究也表明，微粒体谷胱甘肽-S-转移酶1基因在小鼠造血干细胞和祖细胞中高表达，基因敲除后将抑制细胞分化，具有一定的胚胎致死性[52]。 CHAC1、CHAC2作为一对参与还原型谷胱甘肽生物合成的相关酶，二者对谷胱甘肽代谢具有十分重要的影响。CHAC1能特异性地降解还原型谷胱甘肽，而CHAC2则在未分化的人胚胎干细胞中高度富集，作为抗氧化反应主要调节因子Nrf2的上游调节器，CHAC2可以通过抑制CHAC1的功能来调控人胚胎干细胞多能性及还原型谷胱甘肽稳定性[53]。CHAC2下调可以促进干细胞分化，通过下调Nrf2抑制其下游蛋白谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)的表达，显著降低还原型谷胱甘肽水平，阻止其自我更新。值得注意的是，CHAC2在未分化的人胚胎干细胞中高度表达但不在分化成熟细胞中表达，而CHAC1在两种细胞中均能表达。CHAC2基因敲除导致的人胚胎干细胞自我更新能力下降可由CHAC1下调来挽救，这表明了CHAC2可能抵消掉了CHAC1降解谷胱甘肽的作用[53]。然而，CHAC2基因敲除同时也会导致Nrf2及下游蛋白GCLC、GCLM的下调，CHAC2下游蛋白的表达却不能被CHAC1下调所拯救，提示了CHAC2功能的发挥可能不是完全通过阻断CHAC1的作用实现的[46]。因此，CHAC家族和相关转录因子在调节未分化和分化干细胞中还原型谷胱甘肽水平方面起着关键作用。此外，CHAC2基因敲除也下调了OCT4表达，主要由还原型谷胱甘肽下调引起的OCT4半胱氨酸残基氧化所致。同时，干细胞分化过程中还可以通过下调谷氨酰胺代谢导致的内源性还原型谷胱甘肽减少引起OCT4半胱氨酸残基的氧化[46]。 近些年来，谷胱甘肽通过参与干细胞的能量代谢调节干细胞分化的作用也日渐明晰。低氧环境能够保护干细胞免于有害活性氧的产生与积累，干细胞在低水平活性氧的微环境中，能有效维持其自我更新能力和细胞干性，而高水平的活性氧不仅会阻碍干细胞的自我更新，而且会促使干细胞发生分化[41]。事实上，为了满足能量需求，减轻活性氧依赖的DNA损伤的风险，多能干细胞与其分化后的细胞相比，多能干细胞主要依靠糖酵解代谢途径提供能量[54]。多能干细胞通过糖酵解和磷酸戊糖途径提高了NADPH的生成。NADPH作为维持硫氧还蛋白和还原型谷胱甘肽的关键因子，保障了干细胞以还原型谷胱甘肽为代表的抗氧化体系清除活性氧的能力，保护了干细胞基因组的完整性[9]。随着分化的进行，糖酵解逐渐被氧化代谢所取代，糖酵解相关基因表达受抑制，还原型谷胱甘肽水平下调，线粒体呼吸过程中产生的活性氧分子成为了DNA损伤的主要来源[55]。然后，活性氧积累产生的损伤会进一步影响干细胞的自我更新和分化能力[31]。在分化过程中，还原型谷胱甘肽受到持续抑制，使得干细胞的氧化还原状态难以维持，从而加剧了干细胞的分化。 总之，无论是通过还原型谷胱甘肽相关酶类和转录因子参与调节干细胞的分化过程，还是通过细胞能量代谢机制来参与调节，都表明了还原型谷胱甘肽水平在干细胞分化前后的变化和影响，可以预见的是，谷胱甘肽在干细胞的分化过程中扮演着“晴雨表”的作用。 2.3   谷胱甘肽在肿瘤干细胞中的作用   肿瘤由于其复杂的发生机制，现已经成为十分重大的医学研究难题[56]。肿瘤干细胞是肿瘤细胞的重要亚群，在诸多肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，与肿瘤的生长特性、异质性密切相关[57]。肿瘤干细胞与胚胎干细胞、成体干细胞相似，都具有高增殖能力的共同特点，但前者代表着巨大的社会经济压力与负担，后两者则象征着生命无限的希望。重要的是，肿瘤干细胞与胚胎干细胞、成体干细胞有着共同的代谢策略，以维持其特性和增殖能力，除此之外，肿瘤干细胞还存在一些特殊的代谢途径[58]。与正常干细胞的特性相类似，肿瘤干细胞中的活性氧水平也低于分化后的细胞，这提示肿瘤干细胞的干性与活性氧水平之间也存在的某种关系，通过维持低水平的活性氧水平同样有益于肿瘤干细胞的生存[59]。而谷胱甘肽除了在肿瘤干细胞中发挥着与正常干细胞中相似的抗氧化作用外，还可以通过参与一些信号分子的调节来影响肿瘤干细胞的生存。 近年来，随着对肿瘤干细胞的研究越加深入，胱氨酸/谷氨酸反转运体(cystine/glutamate exchanger，xCT)与肿瘤干细胞的表面标记蛋白之间的关系受到广泛关注，这一关系在肿瘤的增殖和侵袭进展中发挥着重要作用[60-61]。xCT是由SLC7A11基因编码的轻链亚基，可以通过转运胱氨酸进入胞内以支持含硫醇分子的半胱氨酸和谷胱甘肽的生物合成，从而参与氧化应激调节[62]。SLC7A11高表达于多种肿瘤细胞中，与肿瘤的发生发展以及耐药性存在密切的联系[63-65]。敲除SLC7A11基因可增加基础活性氧水平，减少还原型谷胱甘肽生成，促进氧化应激状态下的细胞死亡；SLC7A11基因过表达可以使肿瘤细胞抗氧化应激能力和耐药性增加[66-67]。xCT能够调节肿瘤细胞中谷胱甘肽的合成并抑制胞内活性氧的积累，表现出肿瘤干细胞样特性。同时，还原型谷胱甘肽还能与重要的抗癌药物顺铂形成共轭化合物从而排出体外，降低肿瘤治疗效果[68]。胞内还原型谷胱甘肽耗竭可引发细胞内顺铂的蓄积，从而增加顺铂与DNA的结合量，使肿瘤细胞恢复放化疗敏感性[69]。RODMAN等[70]发现抑制还原型谷胱甘肽的代谢能够提高乳腺癌干细胞对放疗的敏感性。POLEWSKI等[66]也发现了肿瘤干细胞与xCT之间的相互作用。肿瘤干细胞的表面标记物可以维持细胞膜上的xCT亚基的稳定；相反，xCT也可以促进肿瘤干细胞表面标记物的表达。目前，研究较为深入的肿瘤干细胞表面标志物是CD44，它也是细胞内透明质酸的黏附分子之一，具有调节xCT的功能，对肿瘤干细胞的干性维持、黏附和迁移等特性都具有重要的调控作用[62]。CD44既有标准型的存在形式，还具有其他多种的变体存在形式，简称CD44v，在剪切过程中外显子插入位点的不同是CD44各变体之间的主要差别。当前的研究发现，CD44v能提高肿瘤干细胞的抗氧化能力，并能参与对肿瘤干细胞的生长调节过程，具体作用机制为通过维持细胞膜表面的xCT稳定性来促进还原型谷胱甘肽合成，以此达到下调肿瘤干细胞内活性氧水平的作用，同时还可以促进肿瘤干细胞耐药性的增强[71]。因此，CD44v在肿瘤微环境中可以保护肿瘤干细胞免受高水平活性氧的作用，同时CD44高表达可以使肿瘤干细胞内与抗氧化相关基因的表达上调，如谷胱甘肽过氧化物酶。此时，肿瘤干细胞的防御能力是由CD44v促进的还原型谷胱甘肽合成上调和抗氧化基因的高水平表达共同支持的这一研究结果为通过CD44v靶向治疗削弱肿瘤细胞的活性氧防御并使其恢复对现有化疗药物敏感性提供了理论基础[71]。CD44也能通过与肿瘤干细胞上的其他物质相互作用，共同对肿瘤干细胞的功能产生影响，如CD44的主要配体透明质酸[45]。HAGIWARA等[72]发现CD44v8-10的表达可以调节促进xCT摄取胱氨酸，进而调节谷胱甘肽的合成并抑制活性氧的积累，导致尿路上皮癌及乳腺癌的耐药性增强。CD44v9的表达与Nrf2的激活以及肝细胞癌患者较差的总体生存率有关，而Nrf2是调控干细胞内谷胱甘肽水平的重要上游信号因子[45]。 谷胱甘肽的前体——谷氨酰胺代谢也对肿瘤干细胞的生存具有重要影响，阻断谷氨酰胺可以减少肿瘤干细胞的表面标记物，这种反应常常是可逆的。但更重要的是，去除肿瘤干细胞的谷氨酰胺将引起细胞内谷胱甘肽的耗竭，导致抗氧化系统的衰减和细胞内活性氧的增加，从而引发细胞分化，导致肿瘤干细胞种群逐渐减少。在肿瘤干细胞内，还原型谷胱甘肽和谷胱甘肽合成酶均有较高表达[73]。高水平还原型谷胱甘肽和抗氧化酶的表达增加促进了肿瘤细胞的存活和对抗癌药物的抵抗[74]。依赖谷氨酰胺代谢来维持干细胞功能是肿瘤代谢的重要标志之一，而细胞表面xCT的表达对于胱氨酸的摄取至关重要，为了维持细胞内谷氨酰胺水平，肿瘤细胞需要增强xCT的表达以满足其快速增殖的需求[75]。在RAS癌基因高度活跃的细胞中需要稳定的谷氨酰胺和谷胱甘肽生成平衡氧化还原需求[76-77]。高表达的myc基因可以通过增加谷氨酰胺摄取和谷氨酰胺分解，推动肿瘤干细胞新生谷胱甘肽的合成[78]。目前，谷胱甘肽用于癌症治疗已有一定数量的研究证实了其有效性。如高兰等[79]发现还原型谷胱甘肽能够降低肝癌干细胞内的活性氧水平，并抑制其细胞活力及干性。还原型谷胱甘肽升高可以抑制肿瘤干细胞的生长，降低肿瘤干细胞在肿瘤细胞中的亚群比例[80]。 总之，谷胱甘肽是肿瘤干细胞增殖与耐药性的保护因子。通过与肿瘤干细胞内各类物质的联系，将整个肿瘤干细胞生长的调节功能联系在一起。但必须要指出的是，当前的研究还较为宽泛，谷胱甘肽在肿瘤干细胞的作用机制仍然局限于对活性氧的对抗作用，对谷胱甘肽下游的信号通路以及物质代谢调节仍知之甚少，值得进一步研究拓展。"