Technology progress in the in vitro construction and culture of tissue-engineered bone

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.46.018

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: The in vitro construction, maturation and differentiation of cell scaffold complexes into tissue- engineered bone is the necessary process of bone tissue engineering construction, but there are no uniform methods and standards.
OBJECTIVE: To summarize the basic method and technology to build bone tissue engineering at present and to discuss the related development.
METHODS: A compute-based online search was conducted on the PubMed database and CNKI database for the articles related to the in vitro construction and culture of bone tissue engineering bone from January 1997 to January 2013 with the key words of “bone tissue engineering, cell biological scaffold, cell inoculation, seeding density, culture in vitro, bioreactor” in English and Chinese. Finally, 44 articles were included according to the inclusion and exclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: As the carrier of bone tissue engineering seed cells, the primary prerequisite of biological scaffold is sterile, because the sterile biological scaffold can be able to survive. Sterilization of biological scaffolds includes ultraviolet sterilization, 60Co γ-ray sterilization, soaking in ethanol with the volume fraction of 75%, autoclave method, and ethylene oxide sterilization. 60Co γ-ray sterilization is the common method in the biological scaffold sterilization. The inoculation density of seed cells is the key factors that influence the adhesion growth and proliferation of seed cells on the scaffolds. The adhesion between cells and scaffold materials will be affected by the affinity of scaffolds, cell adhesion and gravity, and other factors. The method for the inoculation of bone tissue engineering seed cells includes static inoculation and dynamic inoculation. Each construction method has its advantages and disadvantages. Overcomeing these disadvantages, forming a uniform construction method and fully clinical application are the direction of future development.

Key words: cell culture technology, stents, tissue engineering, review

CLC Number:

R318

Liu Yan-xiao, Bei Kang-sheng. Technology progress in the in vitro construction and culture of tissue-engineered bone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(46): 8090-8095.

Figures/Tables 1

2.1 骨组织工程骨的构建骨组织工程是应用正常具有特定生物学活性的组织细胞与生物材料相结合, 在体外或体内构建组织和器官, 以维持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能。在骨组织过程中将种子细胞接种到生物支架后形成的具有生物活性的复合体，此复合体在体外培养一定时间后可成具有一定活性功能的骨组织工程骨。骨组织工程骨的构建主要是指如何将种子细胞接种于生物支架上并将其在体外培养分化成骨的过程。主要包括种子细胞和生物支架的选取及准备，种子细胞接种于生物支架，细胞支架复合物体外培养几个步骤。 2.2 生物支架的准备生物支架作为骨组织工程种子细胞的载体，首要的前提是无菌，无菌状态的生物支架细胞才能够存活。生物支架材料的灭菌有很多方式：紫外线灭菌法，60Co γ射线灭菌法，体积分数75%乙醇浸泡，高压灭菌锅法，环氧乙烷灭菌法。由于生物支架材料常常不耐高温，或者在与化学物质接触过程中材料性能发生改变，所以60Co γ射线灭菌方法在支架灭菌中成为较常选的方法。该方法用放射性同位素60Co放射的γ射线杀灭微生物和芽孢，此法不用提高产品温度，有足够的穿透力，灭菌效果好，对支架性能影响较小，但设备费用较高，对操作人员存在潜在的危险性。此外很多研究人员采用体积分数75%乙醇浸泡后紫外线照射灭菌的联合灭菌法，取得良好的效果。生物支架材料的选材及制造不同，灭菌方法多样化，需要根据不同生物支架选择与之相适宜的灭菌方法，才能有效的灭菌，否则不仅灭菌效果差，还会影响到生物支架的性能。王连才等[1]用60Co γ方法消毒聚醚酯类生物医用材料，发现聚醚酯在60Co γ照射过程中会发生降解，从而导致材料在特性黏度和力学性能上的下降，并且在降解的同时，材料会产生毒性物质(如对苯二甲酸、对苯二酚等)。此外生物支架需要具有良好的细胞黏附性，才能易于成骨细胞接触、附着，进而增殖。常用的做法是在灭菌前将支架置于无水乙醇浸泡，灭菌后放入无菌DMEM培养基浸泡，以提高生物支架的亲和性。此外用多聚赖氨酸修饰生物材料能更好的提高支架亲和力。多聚赖氨酸可使材料表面亲水性增强，表面正电荷增多，而且吸附溶液和血清中层粘连蛋白和纤维粘连蛋白，并保持其结构的能力最强[2]，多聚赖氨酸与细胞磷脂双层有直接的相互作用，提高了材料表面的活性，增加细胞的黏附[3]。路坦等[4]将脂肪干细胞分别接种到经过多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石和未经修饰的空白组，发现实验组的脂肪肝细胞数量较多，且分泌较多的细胞外基质，而两组的碱性磷酸酶活性无明显差异，说明多聚赖氨酸并不影响脂肪干细胞的成骨性能。 2.3 细胞的准备(接种密度) 种子细胞的接种密度是影响种子细胞在支架上黏附生长及增殖的一个重要因素。有研究表明组织工程骨的质量与细胞接种密度密切相关，植入物中的种子细胞需达到一定数量才能确保新骨形成[5]。Eyckmans等[6-7]的研究指出5.0×108 L-1的人骨膜细胞接种到生物支架后可在小鼠体内成功诱导成骨，而接种密度降低到5.0×107 L-1时发现成骨明显受阻。有研究大鼠间充质干细胞的接种密度与其在体内成骨能力的关系发现只有在细胞密度>5×108 L-1时, 才有明显的成骨[8]。高数量的细胞能够更好的促进成骨细胞在支架上的钙化，也可以迅速的贴附在材料表面，形成细胞集团。但并不是细胞密度越高就越有利于成骨[9]，高接种密度时，细胞数量过多，由于生长空间受限，相互抑制了细胞的伸展与增殖，加之三维支架内营养供给差和细胞代谢产物的蓄积，对细胞的生长和增殖产生负面作用。低浓度细胞接种可促进细胞增殖，高浓度的细胞接种由于营养等原因抑制细胞增殖[10]。只有适当的细胞密度，才能既保证细胞在支架材料上既得到充分的生长空间，又能保证得到充足的营养，进行良好的增殖。为了探究最佳的接种密度国内外进行了大量的相关研究。QI等[11]用0.25×108 L-1-8×108 L-1多个不同密度的人骨髓间充质干细胞接种到生物支架后检测DNA值，当接种密度为4×108 L-1时的DNA值最高，而继续增加接种密度时没有继续增高的趋势。李海丰等[12]通过将不同浓度的人骨髓间充质干细胞与人冻干松质骨复合后植入裸鼠皮下,发现稳定成骨的最低接种低密度是1×108 L-1, 植入物的骨量随接种密度的升高而增加, 接种密度上升到5×109 L-1 后骨量不再有显著变化。田志逢等[13]将大鼠骨髓间充质干细胞以不同的细胞密度接种到异种骨基质明胶上，发现骨髓间充质干细胞在骨基质明胶上的黏附率随着细胞接种密度的增高而增高，当密度为1×109 L-1时黏附率最高为(76.00±2.94)%，继续增加细胞密度其黏附率反呈下降趋势。秦辉等[14]将不同密度的羊间充质干细胞与同种异体FDBM 复合体外构建组织工程骨,发现当接种细胞密度低于2×109 L-1时, FDBM 上的间充质干细胞附着量随接种细胞密度升高而增加, 超过该密度后上架细胞数不再增加。Holy 等[8]将密度为(0.5-10)×109 L-1分别接种到三维生物之架上后发现密度1×109 L-1的成骨效应高于密度0.5×109 L-1组，且并不低于密度更高的其他组。 2.4 种子细胞在生物支架上的接种生物支架内的种子细胞达到一定数量才能成功构建骨组织工程骨。低接种密度时有较高的接种效率，随着接种密度增高接种效率迅速降低[15]。所以提高支架中的细胞数量难以单纯通过提高细胞接种密度，还要通过合适的接种方法提高接种效率。细胞与支架材料的黏附受支架材料亲合力、细胞黏附力及重力等多方面因素的影响，使得种子细胞与支架材料的复合效率较低。目前阶段骨组织工程种子细胞接种方法分位静态接种和动态接种。静态接种有传统的静置接种法，双相接种法[16]，负压接种法等[17]。实验室中最常用的静置接种法是利用细胞贴壁生长的特性，将一定浓度的细胞悬液滴入材料的孔隙中，经一定时间孵育，再加入新鲜培培养基培养。此法适用于各种细胞和支架，简单可行，方便操作。但接种效率低，不仅细胞流失多，细胞在支架内部的分布也不均匀。即使在接种后不加培养液的情况下静置孵育一段时间，可以更好的促进细胞与支架黏附，但仍会有大量的种子细胞脱落浪费，而且长时间的无培养基孵育也会使细胞受损[18-19]。为了解决传统静置接种的不足，可将细胞重悬于纤维蛋白原或胶原的溶液中，将此溶液灌注于支架中，再用促凝剂使溶液凝成凝胶，固定细胞于支架内，这就是双相接种法。该方法用凝胶类基质材料以液态的方式与种子细胞均匀混合，然后加以固化, 使种子细胞在凝胶其中呈稳定的三维均相分布。双相接种技术可以利用凝胶材料的高黏性使种子细胞在早期更好的黏附, 克服了普通方法存在的细胞大量脱落，黏附率低的问题。根据凝胶的不同又分为纤维蛋白凝胶接种技术，生物蛋白胶双相接种法等不同的接种方法。用富含血小板血浆替代纤维蛋白原和胶原作为双相接种媒介改进此法，可以更好的促进支架内细胞的增殖，进一步优化组织工程骨的构建[20]。动态接种是通过增加悬浮的细胞和生物支架材料之间相对流动, 使细胞与支架之间有更多的碰撞接触机会，从而提高细胞的接种效率和分布均匀程度。目前常用的动态接种有离心接种法，涡旋接种法，转瓶接种，搅动接种[21]，过滤接种[22]，灌注接种等。Kim等[23]在构建平滑肌组织时, 采用转瓶接种法将细胞接种到 PGA 材料中, 其细胞密度明显高于静态接种组, 细胞分布也更加均匀。Radisic等[24]在心脏组织工程构建中运用了灌注接种方式，在支架上见到均匀的细胞分布，而且有更高的细胞密度。Xing等[25]通过检测各组用不同方法接种的成骨细胞在聚乙烯支架上的碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原，骨钙素等值来对比动态的离心接种法和涡旋接种法与静态接种法，研究表明动态的离心与涡旋接种法提高了接种效率，涡旋接种法比另两种方法能够让细胞更好的在聚乙烯支架上分布。 2.5 细胞支架复合物的体外培养细胞接种到生物支架后需要进行体外培养，一般用生反应器来模拟体内环境，生物反应器是一种用来进行生物反应或生化反应的装置。目前实验室广泛应用的简单生物反应器：细胞培养瓶、培养板、培养皿和烧瓶。它们成本低、使用简单、操作方便, 可以提供无菌环境，属于传统的静态培养, 代谢产物容易聚集, 导致酸性环境, 对于组织培养十分不利。而且支架内细胞会向营养较好的周边区域聚集，导致分布不均匀。在静态二维培养时，靠单纯扩散作用足够交换营养和排出代谢物，但是在静态的三维培养时，单纯的扩散作用难以完成充分的营养交换和代谢物排除[26]。适当的力学刺激可以克服营养交换和废物排出不足这一问题，减少处于中心部位的细胞由于营养不良或代谢不畅而导致的生长迟滞甚至死亡。赵明艳[27]通过对支架上细胞加载了周期性的模拟力学刺激，发现一定的力学刺激能显著的提高细胞内碱性成纤维细胞因子的表达量,实验组细胞增殖指数显著高于对照组。张燕[28]在构建骨组织工程骨过程中对其进行力学加载下培养，发现合适的力学刺激作用下能明显促进支架上成骨细胞的增殖分化，还能促进细胞支架复合物的成熟及骨化。Kim等[29]的实验证实流体的机械刺激能够增加成骨细胞产生前列腺素，碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原蛋白的生成，并能够促进成骨细胞增殖和矿化。Rath等[30]的实验发现一定力量刺激使细胞支架复合物的骨形态发生蛋白2，Runx2，Smad5 等成骨转录因子及蛋白表达显著增加，并促进了碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原蛋白，骨钙素的表达。认识到力学刺激在骨组织工程中的重要性后，能够为细胞支架复合物提供力学刺激的动态培养模式快速发展起来，而动态培养需要复杂的生物反应系统。目前动态生物反应器有转瓶式、膜式[31]、旋转壁式, 并在可控的环境里进行三维培养, 促进支架内部营养物质及代谢产物的交换。同时各种反应器各有其独特的优点与不足，下面简单介绍几种较常使用的生物反应器。、气升式、旋转壁式、灌注式等多种多样。生物反应器能将细胞接种和长期培养整合于一个系统中进行，减少了操作步骤，预防污染，而且使细胞高效且均一地种于支架转瓶式反应器，原理是将生物支架材料悬挂在转瓶内，加入一定密度的细胞悬液,放置于CO2培养箱中以一定的速率转动支架接种并长期培养。Kim等[29]的实验发现通过转瓶培养的细胞支架复合物在14 d可形成矿化骨，而静态培养组需要在56 d才能看到矿化骨。Stiehler等[32]发现将人骨髓间充质干细胞接种到PLGA支架后用转瓶式生物反应器培养组的碱性磷酸酶活性和矿化能力明显高于静态培养方式的对照组，并且在骨钙素，Ⅰ型胶原，成骨相关转录因子抗体，骨形态发生蛋白2等的表达上有明显的上升趋势。旋转壁式生物反应器是美国航空航天局为在地面上模拟微重力条件下细胞的生长而开发出的一种新型细胞及组织培养装置[33-34]。大部分此类型反应器是由俩个共处于同一个轴的2个内外圆筒构成的，外面的圆筒装有培养液及培养物,可以旋转提供动态环境。而内筒采用透气不透液的多孔疏水性半透膜, 负责气体交换提供 O2排出CO2[35]。此种反应器能提供恒定培养环境，具有高效物质传递的，并减少了不必要的震荡，使液体剪切力明显降低。灌注式生物反应器是将支架悬吊于灌注系统中，培养液以恒定流量被泵送到反应器中，再连续地收集到反应器废液瓶，所以灌注反应器克服了机械混合产生的剪切应力，降低了对细胞的损伤,可以对细胞的周围环境包括 pH 值、温度、培养液的营养成分、代谢产物更为精确的监测和控制从而解决组织工程细胞或复合体的营养消耗和代谢产物之间的矛盾。并可通过调控细胞悬液流速来改变细胞受的机械刺激的力度和频率来更好的促进细胞的生理状态。灌注式培养可使细胞在生物支架上具有高度的一致的分布[35-36]，细胞的碱性磷酸酶活性和骨桥蛋白分泌量明显提高[37]，并能够更好的促进矿化[38]。"

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