2.1 骨髓造血干/祖细胞自身抗体的产生机制 骨髓造血细胞自身抗体是由于B淋巴细胞功能异常而产生的一系列针对骨髓造血细胞的抗体，它的发现合理的揭示了免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓造血功能异常的机制，同时为免疫相关性全血细胞减少症与再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、阵发性血红蛋白尿等骨髓衰竭性疾病的鉴别诊断提供了可靠的理论依据。   2005年有学者利用流式细胞术从骨髓B淋巴细胞及其亚群入手，通过检测免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓B淋巴细胞的数量、CD5+ B淋巴细胞占B淋巴细胞比例以及骨髓B淋巴细胞功能发现：免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓中，B淋巴细胞百分含量明显增多、CD5+ B淋巴细胞所占比例也明显高于正常对照及其他病例对照组；而且B淋巴细胞和CD5+ B淋巴细胞的增多程度均与免疫相关性全血细胞减少症病情呈显著正相关。随后他们在核对了免疫相关性全血细胞减少症患者B淋巴细胞的克隆性发现：免疫相关性全血细胞减少症患者B淋巴细胞尽管数量、亚群及功能异常，但不是单克隆的恶性细胞。通过以上结论得知免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓造血细胞自身抗体的产生与抗体产生细胞和良性的B淋巴细胞数量、亚群异常及功能亢进有关[1]。后牛占恩[2]采用相同的方法检测了免疫相关性全血细胞减少症初诊组、完全缓解组和正常对照组骨髓总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞的数量，最终提出免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓B淋巴细胞数量及亚型明显异常，即总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞数量增多，可能是免疫相关性全血细胞减少症患者的B淋巴细胞功能亢进，持续产生自身抗体的重要因素，同时认可了流式细胞术是鉴别诊断免疫相关性全血细胞减少症的可靠检测手段，这更进一步的证实了前面的结论。   2.2 骨髓造血干/祖细胞自身抗体的引发机制  T淋巴细胞调控作用：目前认为骨髓造血细胞自身抗体是由于T淋巴细胞调控失衡导致B淋巴细胞数量、亚群、功能异常，进而由B淋巴细胞产生的[3]。曾慧等经测定骨髓单个核细胞中Th1细胞的代表因子γ干扰素、白细胞介素2与Th2细胞的代表因子白细胞介素4、白细胞介素10的基因表达来追踪患者Th1细胞与Th2细胞平衡时发现，免疫相关性全血细胞减少症患者Th1细胞与Th2细胞平衡明显向Th1细胞降低倾斜，即Th1细胞途径的抑制性负调控减低，Th2细胞途径的刺激性正调控增强，细胞功能亢进，可能是免疫相关性全血细胞减少症免疫发病环节之一，更有研究显示免疫相关性全血细胞减少症骨髓中Th2细胞高于Th1细胞达3倍[4]。其中，Th2细胞分泌的白细胞介素4、白细胞介素10等增多，这些因子可以促进B淋巴细胞生长、分化和增殖，白细胞介素4和白细胞介素10可特异性抑制Th1型淋巴细胞的激活而促进激活的B细胞DNA大量合成，诱导其分化成为浆细胞，从而产生大量的IgM、IgG和IgA抗体。在多种自身免疫性疾病均已发现外周血白细胞介素4、白细胞介素10 水平明显增高并且与自身抗体的水平呈正相关[5]。   此外，付蓉等进一步研究调节性T细胞(Treg)的数量及功能状态发现，调节性T细胞数量减少和功能减低也可能是免疫相关性全血细胞减少症患者B淋巴细胞异常的原因之一，有研究显示免疫相关性全血细胞减少症患者存在Th2细胞数量增多、功能亢进，Th1与Th2比例失衡与Treg细胞数量减少有关；而且随着免疫相关性全血细胞减少症患者CD5+CD19+/总B淋巴细胞水平的增高，Treg细胞数量也相应减低[6]。   Th17细胞的免疫调控：最新研究发现，机体存在一种不同于T辅助细胞1和T辅助细胞2型的CD4+效应T细胞——Th17细胞，该细胞由天然的T细胞前体分化而来，具有独立分化和发育调节机制，能特异性产生白细胞介素17效应因子，在自身免疫性疾病和机体反应中具有重要意义[7]。Th17细胞主要通过其分泌的细胞因子白细胞介素17A、白细胞介素17F、白细胞介素6、白细胞介素21、白细胞介素22、肿瘤坏死因子α等发挥作用，其中最主要的是白细胞介素17。白细胞介素17受体分布广泛，几乎在所有类型的细胞上都有所表达。白细胞介素17与受体结合并被激活，导致趋化因子、集落刺激因子和黏附分子的表达或释放，招募炎症细胞尤其是中性粒细胞，进而发挥其生物学功能，引起细胞浸润和组织破坏，影响感染、肿瘤和自身免疫的病理过程[8]。白细胞介素17在炎症反应中对白细胞的迁移和活化、在骨质破坏反应中对破骨细胞的活化和骨质的吸收方面起重要作用[9]。   Romagnani[10]及Annunziato等[11]均阐明人类Th17细胞具有一定的增殖能力和细胞毒性，能介导B淋巴细胞产生IgG、IgM或IgA，而非IgE。Eddahri等[12]通过研究发现白细胞介素6在STAT3的表达下能促进初始T淋巴细胞转化为辅助性T细胞，进而激活B淋巴细胞产生抗体；同时白细胞介素6能促进白细胞介素21的分泌，而白细胞介素21同样具有促进初始T淋巴细胞分化进而激活B淋巴细胞产生抗体的作用。之后有学者通过对免疫相关性全血细胞减少症初诊患者、血常规恢复正常患者、正常人外周血、骨髓及骨髓上清液检测研究发现初诊患者Th17数量增多，随着治疗病情好转逐渐趋于正常，且Th17细胞在免疫相关性全血细胞减少症患者中数量增加、功能活跃。进一步研究发现，免疫相关性全血细胞减少症初治患者Th17细胞数量增多、功能亢进且与产生自身抗体的CD5+B细胞数量及功能状态呈正相关，与疾病的状态呈一定相关性[13]。   2.3 造血细胞干/祖自身抗体的研究  自身抗体IgG：付蓉等[14]用流式细胞术检测骨髓造血细胞结合的自身抗体的类型并进行分析发现，结合有IgG型抗体的患者其血红蛋白减少最为严重，且这组患者在有核红细胞和造血干/祖细胞上都有IgG的结合。后邵宗鸿等[1]进一步证实，以IgG为主的自身抗体主要通过激活巨噬细胞吞噬带有自身抗体的自身骨髓造血细胞导致骨髓造血衰竭。王一浩等[15]发现骨髓巨噬细胞增多患者绝大多数含有IgG型自身抗体(94.12%)，IgG型自身抗体针对骨髓造血细胞系列数愈多其骨髓巨噬细胞数量及活化抗原表达水平越高，且这部分患者骨髓增多的巨噬细胞多呈激活状态，而激活的巨噬细胞可能参与免疫相关性全血细胞减少患者早期造血细胞的破坏。又通过与巨噬细胞低水平组的外周血中血细胞、网织红细胞、胸骨骨髓象红系作比较后表明，巨噬细胞高水平组免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓内存在原位“溶血”，且这种“溶血”破坏程度与巨噬细胞数量和活化水平有关。其机制可能是自身抗体IgG通过其Fc片段与巨噬细胞表面的FcR相结合激活骨髓巨噬细胞，导致骨髓巨噬细胞数量增多，活性增高，功能增强，最终导致骨髓造血衰竭。   后又有学者利用流式细胞术和免疫荧光法研究红系造血岛(EI)过程中也发现，一些免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓中部分“EI”是巨噬细胞和幼红细胞通过自身抗体IgG连接构成，传统观念认为“EI”是由发育各阶段的幼红细胞围绕中间一个或数个巨噬细胞形成的一种滋养红系的造血龛，而这些“EI”不是滋养骨髓红系的造血龛，而是巨噬细胞吞噬、破坏幼红细胞的原位标志。这部分免疫相关性全血细胞减少症患者存在溶血征象即贫血程度重、血清间接胆红素水平升高、Ret比例增高、骨髓红系比例增高，且常见到红细胞被巨噬细胞吞噬。这提示这些形态学所谓的“EI”其实是骨髓幼红细胞被破坏的一种形式，其实质是巨噬细胞表面的FcR与幼红细胞表面自身抗体IgG Fc段结合，通过Fc-FcR介导进而吞噬和破坏幼红细胞，凡是细胞表面带有IgG的任何阶段骨髓幼红细胞都是巨噬细胞吞噬和破坏的对象[16]。   刘惠等[17]研究组在临床中发现：免疫相关性全血细胞减少症患者自身抗体体的存在可能影响了促红细胞生成素与促红细胞生成素受体的结合从而导致促红细胞生成素不能正常发挥作用，影响了红系的增殖和分化。为证实这一假设，他们用流式细胞术检测免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓红系造血细胞膜上的促红细胞生成素受体与自身抗体IgG的数量及IgG存在时促红细胞生成素受体的表达情况，分析显示促红细胞生成素受体与IgG呈显著负相关。他们推测很可能是这些自身抗体模拟了其配体，封闭了受体结合区，阻断了内源性配体与之结合，最终导致抗原功能受损，使得EPO与EPOR的结合受阻，从而导致EPO不能正常发挥作用，影响了红系的增殖和分化[17]。王一浩等[18]进一步研究证实：骨髓GlycoA(+)细胞膜上带有自身抗体IgG的免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓衰竭的原因可能系自身抗体IgG封闭了骨髓造血细胞膜上促红细胞生成素受体，导致造血细胞失去其生长必需的促红细胞生成素刺激，骨髓幼红细胞不能正常增殖分化成熟，最终导致外周血细胞减少尤其红细胞及血红蛋白下降。   自身抗体IgM：免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓造血细胞自身抗体以IgM最多且易致血管内溶血，研究发现有血管内溶血异常发现的患者都集中在IgM、IgG+ IgM 和IgG+ IgM+ IgA 型组, 它们的共同特点是造血细胞均有IgM 的结合。这与相关文献[19]报道相一致，即IgM是通过补体介导损伤红细胞膜，导致血管内溶血。以IgM为主的自身抗体(主要为IgM，少量为lgG)，其激活补体系统溶解自身骨髓造血细胞导致骨髓造血衰竭的机制在多种自身免疫性疾病中已经证实：自身抗体与靶细胞膜上C1q结合后，使抗体Fc段的补体结合部位暴露，补体C1与之结合并被激活。活化的C1s依次酶解C4、C2，形成具有酶活性的C3转化酶，后者进一步酶解C3为C3a、C3b，使补体C3大量减少。补体激活后最终形成膜攻击复合物C5b-9，其在胞膜上形成的小孔使得小的可溶性分子、离子以及水分子可以自由透过胞膜，但蛋白质之类的大分子却难以从胞质中逸出，最终导致胞内渗透压降低，细胞溶解。此外，末端补体成分插入胞膜，可能使致大量钙离子被动地向胞内弥散，并最终导致细胞死亡[20-23]。   陈瑾等[24]研究证实免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓造血细胞膜上存在自身抗体，其抗体类型主要是IgM和少量IgG，观察显示骨髓C5b-9水平与CD34+细胞膜IgG、IgM结合率均呈正相关，说明患者骨髓中抗体结合率越高，补体激活越明显，使补体C5b-9水平增高；自身抗体IgM阳性组C5b-9水平较阴性组高，结合以往结果，提示自身抗体主要是通过激活补体连锁反应，消耗C3，形成C5b-9，破坏骨髓细胞，造成血细胞减少。   其他自身抗体：利用流式细胞术检测进行BMMNC-Coombs 试验显阳性的患者发现：患者自身抗体以含IgM型最多见, 其次为含IgG型，含IgA型较少。有研究发现粒细胞结合的自身抗体IgA的量明显少于IgG、IgM，而与造血干/祖细胞结合的IgA的量显著高于与有核红细胞和粒细胞结合的IgA的量，这提示自身抗体IgA 数量较少但其更易与造血干/祖细胞结合，这也许能部分解释为何经典BMMNC- Coombs试验IgA检出率很低的现象[14]。此外，近期有结果证实，可能与免疫性血小板减少性紫癜及自身溶血性贫血等B细胞介导的自身免疫性疾病机制相似，部分抗体可作用于正常骨髓GlyCoA+、CD15+、CD34+细胞膜表面蛋白成分，这表明免疫相关性全血细胞减少症患者抗体的部分作用靶点可能为正常蛋白成分，进而导致造血细胞的破坏和抑制[25]。   2.4 骨髓造血干/祖细胞自身抗体的检测方法  骨髓单个核细胞库姆试验(BMMNC-Coombs)：BMMNC-Coombs不使用传统库姆试验中的成熟红细胞做库姆试验,取而代之的是将免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓单个核细胞作为被检靶细胞。仍然是应用经典的直接Coombs试验的原理：利用自身抗体能与附有相应抗原的靶细胞(BMMNC)结合，使靶细胞致敏而不发生凝集，一旦加入抗人球蛋白血清，抗球蛋白血清即与靶细胞上结合的抗体相结合，从而发生凝集。使用此方法检测免疫相关性全血细胞减少症患者的骨髓单个核细胞，结果会发生特异性(非免疫相关性全血细胞减少症患者及正常对照阴性)凝集，尤其是骨髓呈无效造血(增生活跃或明显活跃)者阳性率更高，这说明此类患者骨髓(数量)优势细胞(晚阶段细胞)有膜结合自身抗体。该方法的优点是无假阳性且主要测及结合在骨髓优势细胞群体的自身抗体，而且试验方法简单易行，费用低，在基层医院均可开展[26-27]。     流式细胞术双标法：此方法采用带荧光的抗人免疫球蛋白单克隆抗体及抗人红细胞GlyA、粒细胞CD15、造血干/祖细胞CD34 单克隆抗体对免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓细胞行双标流式细胞术检测。此方法能够明确GlyA+细胞、CD15+细胞及CD34+细胞上是否表达自身抗体及其表达类型和所占比例，目前阳性判定多参照天津医科大学总医院血液肿瘤科标准，各种自身抗体与各型造血细胞的结合率大于4%为阳性。流式细胞术双标法的优势在于检测骨髓造血细胞膜自身抗体的灵敏性明显强于BMMNC-Coombs试验[28]。有研究显示，因再生障碍性贫血、阵发性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征等血细胞减少症患者外周血总B淋巴细胞、CD5+ B淋巴细胞与正常人无明显差异，据此，应用流式细胞术检测外周血总B淋巴细胞、CD5+ B淋巴细胞易于将免疫相关性全血细胞减少症与其他全血细胞减少症加以鉴别，且外周血较骨髓标本采集也更简单易行[29]。 骨髓细胞抗体放散试验：因流式细胞术双标法仪器昂贵不易在基层医院开展，近年来有学者发现了一种基层医院易开展的骨髓细胞抗体放散试验，其实验原理是利用骨髓细胞上的抗原与血清中抗体在适合条件下发生凝集或致敏，但这种结合在56 ℃水浴振摇的物理条件下是可逆的，因而抗体从结合的细胞上放散，在放散液中加入酶处理的相应细胞，骨髓细胞经酶处理可增强吸附抗体的能力，此后经多次洗涤，用抗人球蛋白血清来促使凝集反应发生。骨髓细胞抗体放散试验的敏感性比BMMNC-Coombs试验高，且如果以红细胞、单个核细胞、血小板为致敏指示细胞，还可以测定其抗不同血细胞的抗体类型。这也有助于广义的免疫相关性血细胞减少症如特发性血小板减少性紫癜，自身免疫性溶血性贫血，Evans综合征的诊断，还有待于进一步的研究[30]。"