Tissue engineering technique to repair articular cartilage injury: Environment, material, safety and controllability

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.023

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: The traditional methods for cartilage defect repair have their limitations. The application of tissue engineering methods to repair articular cartilage defects has shown promising prospects.
OBJECTIVE: To review the progress of tissue engineering technique to repair articular cartilage at home and abroad in recent years.
METHODS: PubMed and CNKI databases were searched online by the first author for papers concerning applying tissue engineering technique to repair articular cartilage defects in 1990-2011. Totally 187 Chinese papers and 211 English papers were retrieved, and finally 49 papers were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The main method of cartilage tissue engineering is to apply the principle of engineering and life sciences to isolate, culture and proliferate needed seed cells. Then, the cells were implanted onto the appropriate biological scaffold, and the cytoskeleton was implanted into the defect site. Gradually, new cartilage tissues form under some inducing conditions. In recent years, the cartilage tissue engineering research focuses on the following aspects: (1) Selection of seed cells, including autologous chondrocytes, allogenic chondrocytes, embryonic stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells; (2) Cell induction and conditional culture, including cytokines, cell culture conditions, transgenic technology; (3) Selection and research of biological scaffold materials. The following aspects have become hotspots in the tissue engineering research: finding ideal seed cells, combination with cytokines, literally imitating microenvironment for cell survival, safety, high efficiency, and controlled transfection of gene engineering, and constructing ideal scaffold materials.

Key words: tissue construction, tissue construction review, seed cells, chondrocytes, allogeneic chondrocytes, embryonic stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, cell culture, induction, scaffolds, cytokine, microenvironment, provincial grants-supported paper

CLC Number:

R318

Kou Jian-qiang, Wang Qian-qian, Wang Chang-yao, Wang Ying-zhen. Tissue engineering technique to repair articular cartilage injury: Environment, material, safety and controllability[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.023.

Figures/Tables 1

2.1 种子细胞的选择理想的软骨组织工程种子细胞应具备以下特点：①来源广泛，取材方便，对机体本身造成的创伤小。②体外培养具有较强的增殖传代能力和良好的生物学活性。③植入受体后机体免疫排斥反应小。④植入体内能高质量地修复关节软骨缺损并能保持良好的远期疗效。 2.1.1 自体软骨细胞从组织学和免疫学角度，自体软骨细胞是最理想的软骨组织工程种子细胞。其细胞分化程度高，分泌功能旺盛，宿主不会对其产生免疫排斥而致移植失败等。自体软骨细胞的获取方法是采用关节镜或关节穿刺取关节非负重区软骨，在无菌条件下应用酶消化等方法分离软骨细胞，在体外加入软骨细胞培养基及动物血清进行增殖培养，以获取足够数量的细胞。目前自体软骨细胞移植(autologous chondrocyte implantation/transplantation，ACI /ACT) 技术已经获得美国食物药品管理局(FDA)的批准应用于临床。且研究表明，动物实验模型和临床应用效果都是基本令人满意的[4-7]。但自体软骨细胞取自机体正常组织，来源有限；取材不方便(需关节镜或手术取材)，易引起关节损伤或其他并发症；在体外培养时细胞增殖能力低，难以短期内获得足够数量的细胞；在体外增殖的过程中发生去分化，软骨细胞表型发生转变，由表达Ⅱ型胶原转而表达Ⅰ型胶原，丧失成软骨能力[8]，而细胞表型的改变，可能影响细胞移植到体内分泌软骨基质的能力，从而影响修复效果。这些都显著限制了这一技术的应用。 2.1.2 异体软骨细胞同自体软骨细胞移植相比，异体软骨细胞移植解决了来源不足的缺点，且异体软骨细胞经过体外分离、纯化和增殖，其抗原性逐渐减弱；其次，软骨组织工程中，常选取体外培养第2-5代的细胞作为种子细胞，这个阶段的软骨细胞不仅具有很强的增殖能力，而且已分泌出相当数量的细胞外基质成分，包裹细胞形成免疫隔离层，不易被机体免疫系统攻击，免疫排斥反应轻。这些结构和免疫学特点，使得异体软骨细胞在软骨组织工程中作为种子细胞来源成为可能。目前应用于研究的主要有来自胚胎或新生儿的软骨细胞、新鲜尸体的软骨细胞等，并有学者提出了永生化软骨细胞的方法。近年的动物实验、临床实验及多种免疫检查证实，来自新生儿或胚胎的软骨细胞较成人软骨细胞更易形成软骨组织，更能有效地生成Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖等软骨细胞外基质，有利于软骨缺损的修复，且胚胎软骨细胞的免疫原性也比异体成年软骨细胞低[9]。永生化软骨细胞是将携带有肿瘤基因的逆转录病毒，转导入原代软骨细胞，建立一种能够长期培养、表型稳定的永生化软骨细胞系[10]。但如何控制其表型稳定及其潜在的致癌性仍需进一步的研究。尽管有报道以异体软骨细胞作为种子细胞修复关节软骨缺损获得了良好的效果，且没有引起明显免疫排斥反应[1-14]，但同时伴随的伦理学问题及潜在的疾病传染等问题仍需谨慎考虑。 2.1.3 胚胎干细胞胚胎干细胞主要来源于胚胎期桑椹胚的卵裂球或胚泡的内细胞团，也可从体细胞核移植发育的胚胎获得[15]。胚胎干细胞属于全能干细胞，具有向3个胚层来源的细胞类型分化的潜能，可以在体外无限增殖并保持未分化二倍体的状态。已有学者证实，胚胎干细胞在一定的诱导条件下(化生长因子β、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4等)以分化为软骨细胞[16-17]，Wakitani等[18]将胚胎干细胞移植到免疫抑制大鼠的膝关节软骨缺损处，4周后缺损被软骨组织修复，并且证实修复的组织是由移植的细胞增殖分化而来。自20世纪80年代初，研究者利用早期胚胎的内细胞团或上胚层细胞建立胚胎干细胞系后，胚胎干细胞便成为软骨组织工程新的种子细胞来源。但是，胚胎干细胞的体外培养要求严格；诱导分化和调控机制复杂，自发分化难以控制，且分化多具致瘤性；其衍生物仍具免疫原性；细胞来源面临伦理学问题等。如果要将胚胎干细胞应用于临床治疗，以上问题仍函待解决。 2.1.4 骨髓间充质干细胞间充质干细胞终身存在于骨髓等组织器官中，具有典型的干细胞的特点，负责组织修复和更新，而且具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可以分化成许多不同的组织，如骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、神经组织等[19]。且因其具有采集方便，易于分离纯化，体外增殖能力强，连续传代培养冻存仍保持其多向分化潜能，且便于自体移植的特点，近年来成为软骨组织工程研究的热点[20]。20世纪70年代，Friedenstein[21]利用骨髓贴壁培养的方法分离出一类具有多向分化潜能的细胞，并将之命名为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞取材方便、创伤小且易于从骨髓中分离纯化和体外扩增，不像滑膜、脂肪等来源的间充质干细胞那样原代培养时需要酶消化预处理，且在三维高密度培养时，有且只有骨髓间充质干细胞的软骨分化潜能得到明显提高。虽然骨髓间充质干细胞仅占机体有核细胞数的0.001%-0.01%，但始终保持多向分化潜能，是终身可用的软骨前体细胞。而且经研究发现，骨髓间充质干细胞能够逃避同种异体的免疫排斥反应。因此，骨髓间充质干细胞被认为是用于软骨组织工程学研究最为理想的种子细胞[22-25]。国内外学者已做了大量研究，韩志军等[26]将猪骨髓间充质干细胞在含有转化生长因子β1等成软骨诱导剂的特定培养基内进行培养、诱导分化，接种于聚羟基乙酸支架上，植入自体猪皮下，生成了组织工程化软骨。Cooch 等[27]研究发现，骨形态发生蛋白2、蛋白12和蛋白13均能促进骨髓间充质干细胞向成软骨组织方向分化。Swieszkowski 等[28]将人骨髓间充质干细胞分别向成软骨和成骨方向诱导，构建出了骨软骨复合体。而且已有学者将骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨应用于临床[29-30]。目前对骨髓间充质干细胞的研究主要集中于不断改进实验方法和诱导培养条件，改善新生软骨的厚度及机械强度等；使新生软骨细胞与原有软骨细胞表型一致，且与周围组织整合良好；调控骨髓间充质干细胞的增殖分化防止致畸致瘤的发生等。 2.2 细胞诱导及条件培养为了能够更加高效的诱导骨髓间充质干细胞向软骨表型细胞分化，为软骨组织工程提供来源丰富的种子细胞，目前使用的诱导方法主要包括加入细胞因子、细胞条件培养和转基因技术等。 2.2.1 细胞因子关节软骨组织内含有多种生长因子，是软骨细胞生存微环境中重要的组成部分，参与软骨细胞生理生长各阶段。目前用于诱导B间充质干细胞向成软骨方向分化的细胞因子主要有转化生长因子、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和表皮生长因子等。转化生长因子β：诸多细胞因子中尤以转化生长因子β超家族成员效能最强，转化生长因子β是一族多肽类生长因子，胚胎形成期诱导原始的间充质干细胞分化形成软骨组织[31]，目前已经发现5 种，存在人体的有转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3 三种，均可使软骨细胞特异性细胞外基质快速沉积，快速有效地促进Mscs向软骨方向分化[32]。转化生长因子β可能是通过增强软骨转录因子Sox9的表达，促进细胞聚集，达到干细胞向软骨分化的必需条件[33]。转化生长因子β1是最常用的诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞方向分化的细胞因子，能刺激软骨细胞分泌蛋白聚糖GAG和Ⅱ型胶原，并保持软骨细胞表型稳定，是目前公认的最好的诱导因子，且具有剂量依赖性[34]。骨形态发生蛋白：骨形态发生蛋白属于转化生长因子β超家族。1963年Urist在研究中发现，把脱钙的皮质骨植入动物的肌肉中，一两周后会有新骨形成。他的结论是，植入的骨虽是死的，但其中可能含有某种物质在诱导新骨的形成。Urist从皮质骨中提取获得了对成骨至关重要的“骨形态发生蛋白”。近年来发现骨形态发生蛋白也具有在体内、体外诱导间充质干细胞向成软骨细胞方向分化的能力，还能促进软骨细胞DNA合成胶原和蛋白多糖增加，并可使已丢失软骨细胞表型的反分化软骨细胞向恢复软骨细胞方向分化，Cooch 等[27]研究发现，骨形态发生蛋白2、蛋白12和蛋白13均能促进骨髓间充质干细胞向成软骨组织方向分化。潘海涛等[35]研究发现骨形态发生蛋白/碱性成纤维细胞生长因子复合材料修复关节软骨缺损效果优于其他实验组。胰岛素样生长因子：另一类在促进骨髓间充质干细胞向成软骨方向分化中起重要作用的生长因子是胰岛素样生长因子，由两种相关多肽即胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2组成，胰岛素样生长因子1作用较强，通过自分泌和旁分泌的方式刺激细胞分裂增殖，促进蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成，减慢基质的降解，并能抑制软骨细胞的凋亡，属于多功能的细胞增殖调控因子[36]。宋红星等[37]用胰岛素样生长因子1诱导骨基质明胶-软骨细胞移植物修复关节软骨缺损，术后24周缺损区以透明关节软骨修复，与宿主关节软骨及软骨下骨整合良好，软骨组织厚度、胶原染色与正常关节软骨一致。但是胰岛素样生长因子1单独应用诱导生成软骨的能力很弱，胰岛素样生长因子1与转化生长因子转化生长因子相结合对体外软骨分化具有协同作用，胰岛素样生长因子1和转化生长因子联合使用增加了葡萄糖胺聚糖的表达，但是对细胞增殖的影响很小[38]。其他常用的细胞因子：成纤维细胞生长因子分为酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，成纤维细胞生长因子可以调节包括软骨细胞在内的多种细胞的功能[39]。血小板源性生长因子：血小板源性生长因子有促进结缔组织、平滑肌细胞增殖的能力，血小板源性生长因子BB被认为有维持透明软骨细胞表型的作用，同时可降低细胞a-SMA的表达[40]。软骨生长的微环境内有很多种细胞因子，不同的细胞因子之间相互作用、相互影响，彼此形成复杂的网络关系，因此软骨生长、代谢需要多种细胞因子的共同参与。目前研究者已开始关注于多个细胞因子的联合应用以及其他因素与细胞因子间的相互作用，在体外环境下联合使用多种细胞因子对间充质干细胞向软骨方向诱导已经有很多报道，Tay 等[41]发现转化生长因子β1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子联合应用较单个应用可以明显提高间充质干细胞增殖能力并且保持成软骨能力。但并非所有的细胞因子之间的组合都是有利的，Kaplan 等[42]发现胰岛素样生长因子1、转化生长因子β 联合应用修复软骨效果并没有得到明显的改善，生成软骨的机械强度也没达到理想强度。无论是序贯或组合使用细胞因子，都是为了模拟软骨生存的微环境，因此还需要更加深入的了解软骨的微环境。 2.2.2 细胞条件培养单层培养：在通过诱导因子诱导间充质干细胞向成软骨细胞方向定向分化的过程中，传统的培养方法是在培养瓶中进行单层培养，即二维培养，单层培养的种子细胞会发生接触抑制，经过传代以后就会出现明显的去分化趋势，Ⅱ型胶原合成减少，细胞变为梭形，开始向成纤维细胞方向转化；单层培养的种子细胞难以在特定空间聚集并增殖形成一定的形状，很难形成理想的组织工程软骨。因此目前二维培养仅用于软骨细胞的初步培养。高密度培养：在构建组织工程化软骨时，细胞培养密度与间充质干细胞向软骨方向分化密切相关。Schmitt 等[43]研究证明高密度培养(1×106/cm2 )更能促进间充质干细胞向软骨细胞方向分化，而且能使细胞外基质在短时间内迅速形成，同时去分化的软骨细胞在高密度培养时可重新获得软骨表型，产生软骨特有的细胞外基质、典型的Ⅱ型胶原和蛋白多糖。但是，因细胞过于致密，细胞团中心营养供应不足，不易培养出较大的软骨。目前培养出的软骨最大直径仅 5 mm。三维立体培养：与二维单层细胞培养相比，三维立体培养能容纳更高密度的细胞黏附、增殖，有利于细胞间信号传递，当细胞生长在三维支架中，生存环境与体内的环境更相似，细胞形态更加接近体细胞。此外，三维立体培养可使细胞外基质含量提高，所培养的细胞活性和功能均加强，更有利于间充质干细胞向软骨细胞定向分化。三维立体培养能保持软骨细胞的表型，甚至能使传代培养过程中去分化的软骨细胞重新表达软骨细胞表型，Frondoza 等[44]先对人膝关节软骨细胞进行了6个月的单层培养，结果细胞出现了去分化现象，然后将此细胞加入Ⅰ型胶原微载体培养，细胞数量在2周内增加了20倍，且细胞重新表达软骨细胞表型。生物反应器：种子细胞在体外培养构建组织工程化软骨时，除了模拟体内细胞在三维空间中生长的基本条件外，还应能够为其提供充足的营养、氧气和适当的物理化学信号，能提供一定的力学刺激（如剪切力、流体静压力、联合压缩力等）调节细胞的的迁移、黏附及新陈代谢，以促进并维持软骨细胞的分化表型。生物反应器能够营造类似机体的微环境，模拟体内力学环境施加一定力学刺激，使细胞在支架上均匀分布，有利于营养物质的流通和交换，促进软骨细胞的增殖分化和基质合成；并能通过自动化和标准化控制组织工程产品的生产过程，降低生产成本，大规模生产组织工程产品。 2.2.3 转基因技术软骨修复过程中需要多种细胞因子的调控，外源性细胞因子是将细胞因子直接添加于细胞培养基中，操作方便，效果肯定，但存在半衰期短、易流失、浓度难以达到体内正常水平、需反复添加、价格昂贵等缺点；内源性细胞因子是通过基因转染技术，将外源性细胞因子基因导入靶细胞，使之在病损部位持续高效地分泌细胞因子并维持所需的浓度和时间，有效促进软骨修复。目前常用的转染目的基因有转化生长因子β、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子等细胞因子基因，抗分解代谢因子基因（白细胞介素1受体基因、可溶性肿瘤坏死因子受体基因等），软骨细胞永生化基因(HPV-l6型E7基因片断、端粒酶逆转录基因等)，Sox家族因子基因等。转染载体是基因修饰的关键，理想的转染载体应具备以下特点：①易于转染靶细胞。②高安全性，无毒性，无致癌致畸作用，免疫原性低。③能有效地将目的基因整合到宿主基因DNA中，且转染率高。④基因表达可调控性。⑤构建过程简单，费用低，可以大批量生产[45]。目前，在软骨组织工程中可供基因导入的载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类，病毒载体主要有：反转录病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒载体等；非病毒载体主要有脂质体、FuGene6等。病毒载体的转染率高而安全性有待证实，非病毒载体的转染率欠佳但易合成、无毒性、无致癌致畸等危险[46]。目前关于使用病毒载体或非病毒载体的问题仍存在争论。导入目的基因的方式有两种：一种是将外源性基因直接导入体内相关的组织器官(in vivo法)。但由于软骨细胞被厚厚的细胞外基质包埋，导入的基因难以到达软骨细胞，因此，in vivo法对于软骨细胞来说在技术上比较困难。另一种是在体外将目的基因导入靶细胞 (ex vivo法)，再将基因修饰过的细胞回输到体内组织缺损部位，使细胞在体内增生繁殖并表达目的基因。此种方法操作较简单、实用，目前应用较广泛。 2.3 生物支架材料的选择和研究软骨组织工程支架材料要求具有特定的生化和物理性质，如良好的生物相容性、合适的生物降解性、具有可塑性和一定的机械强度、可控的孔径大小、足够的孔隙率等。随着软骨组织工程的发展，如何选取理想的支架材料已成为关键。 Geoffrey 等[47]将人脂肪间充质干细胞接种于藻酸盐三维支架，体外培养2周后种植于裸鼠皮下，术后12周可见与人类正常软骨细胞结构相似的细胞群，免疫组化分析显示有Ⅱ型、Ⅵ型胶原分泌，生物化学证实有蛋白多糖形成，电镜证实为软骨细胞。天然材料支架的优势在于接近于软骨细胞外基质，具有良好的生物相容性，含有生长因子类物质、具有细胞识别信号有利于细胞识别附着、增殖以及保持分化能力，其有机、无机成分比例合适，具有比人工合成材料更好的微结构和功能，生物降解性好，来源广泛，价格低廉等，但是天然材料机械力学性能差，难以维持支架形态，降解速度快，大量制备时质量差异波动较大，有传播疾病的危险等。人工合成材料主要有: 聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物、Pluronic、聚氨酯、聚乙烯氧化物等。Christophel等[48]将兔自体关节软骨细胞接种聚羟乙酸与聚乳酸共聚物支架后，植入兔的背部，形成了组织工程软骨。人工合成材料相对机械强度好，形态、结构、降解速度易调控，可根据需要调整物理、化学、生物力学等特性，且可批量生产，但生物相容性不很理想，亲水性差，对细胞吸附不足，降解过程代谢产物产生炎性反应，免疫原性或致癌性可能。为了克服单一支架材料存在的缺点，有学者致力于以各种天然材料和人工合成材料为原料，将两种或两种以上具有互补特征的生物相容性可降解材料制成复合支架，使之更适宜组织工程细胞培养，新型复合支架材料成为软骨组织工程研究的热点之一。Fan等[49]研制出聚乳酸-羟基乙酸共聚物与凝胶、软骨素、透明质酸盐复合支架，并在体外接种间充质干细胞，结果显示此复合支架较仅使用聚乳酸-羟基乙酸支架更利于间充质干细胞增殖和糖胺聚糖的合成；再将其植入兔膝关节软骨缺损，较聚乳酸-羟基乙酸支架与骨髓间充质干细胞复合，在细胞活力、结构塑形及骨软骨整合等方面更加优异。还有学者根据需要对支架材料的表面进行修饰，性状改善，或者利用可注射凝胶支架材料负载活性细胞和治疗药物，构建具有类细胞外基质结构和功能的纳米纤维结构仿生支架等，都为软骨组织工程支架材料的改进提供了新思路。"

References

[1] Ochi M. Clinical results of transplantation of tissue-engineered cartilage and future direction of cartilage repair-novel approach with minimally invasive procedure. Yonsei Med J.2004;45 (Suppl):45-74.

[2] Alford JW,Cole BJ.Cartilage restoration,part 1:basic science,historical perspective,patient evaluation,and treatment options.Am J Sports Med.2005;2;295-306.

[3] Heineken FG and Skalak R. Tissue Engineering:A Brief Overview.Journal of Biomechanical Engineering,1991; 113:111.

[4] Guo XM, Wang CY, Duan CM, et al. Repair of osteochondral defects with autologous chondrocytes seeded onto bioceramic scaffold in sheep.Tissue Engineering.2004;10 (11-12): 1830-1840.

[5] Schaefer D, Martin I, Shastri P, et al.In vitro generation of osteochondral composites. Biomaterials.2000; 21(24): 2599-2606.

[6] Peterson L ,Minas T,Brittberg M, et al . Treatment of osteochondritis dissecans of the knee with autologous chondrocyte transplantation : results at two to ten years. J Bone Joint Surg Am.2003;85-A(Suppl2) :17-24.

[7] Krishnan SP ,Skinner JA ,Carrington RW, et al. Collagen-covered autologous chondrocyte implantation for osteochondritis dissecans of the knee :two-to seven-year results. J Bone Joint Surg Br.2006;88(2):203-205.

[8] Lin Z, Willers C, Xu J, et al. The chondrocyte: biology and clinical application. Tissue Eng.2006;12(7):1971-198

[9] Adkisson HD, Gillis MP, Davis EC, et al. In vitro generation of scaffold independent neocartilage. Clin Orthop Relat Res. 2001;391(Suppl) : S280-S294.

[10] Chen WH,Lai WF,Deng WP,et al.Tissue engineered cartilage using human articular chondrocytes immortalized by HPV-16 E6 and E7 genes.J Biomed Mater Res A. 2006; 76(3):512-520.

[11] Song HX,Li FB,Shen HL, et al . Repairing articular cartilage defects with tissue-engineering cartilage in rabbits. Chin J Traumatol,2006;9(5) :266-271.

[12] Tay AG,Farhadi J,Suetterlin R,et al.Cell yield, proliferation, and postexpansion differentiation capacity of human ear, nasal, and rib chondrocytes. Tissue Eng.2004;10 (5-6): 762-770.

[13] McCormick F, Yanke A, Provencher MT, et al. Minced articular cartilage-basic science, surgical technique, and clinical application. Sports Med Arthrosc.2008;16(4):217-220.

[14] Almqvist KF, Dhollander AA, Verdonk PC, et al. Treatment of cartilage defects in the knee using alginate beads containing human mature allogenic chondrocytes.Am J Sports Med.2009; 37(10) : 1920-1929.

[15] Zhang X, Ziran N, Goater JJ, et al. Primary murine limb bud mesenchymal cells in long-term culture complete chondrocyte differentiation:TGF-beta delays hypertrophy and PGE2 inhibits teminal differentiation. Bone.2004;34(5): 809-8l7.

[16] Kramer J,Hegert C,Guan K.Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro: activation by BMP-2 and BMP-4.Mechanisms of Development.2000; 92(2): 193.

[17] Hwang NS, Kim MS ,Sampattavanich S, et al. Effects of three-dimensional culture and growth factors on the chondrogenic differentiation of murine embryonic stem cells. Stem Cells.2006;24(2):284-291.

[18] Wakitani S, Aoki H, Harada Y, et al. Embryonic stem cells form articular cartilage, not teratomas, in osteochondral defects of rat joints. Cell Transplantation.2004;13(4): 331-336.

[19] Liu HW, Chen CH, Tsai CL, et al. Heterobifunctional poly(ethyleneglyco1)-tethered bone morphogenetic protein-2-stimulated bone marrow mesenchymal stromal cell differentiation and osteogenesis. Tissue Eng.2007:13(5): 1113-1124.

[20] Tuan RS, Boland G, Tuli R. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering. Arthritis Res Ther. 2003; 51:32-45.

[21] FRIEDENSTEIN AJ.Precursor cells of mechanocytes.Int Rev Cytol.1976;47:327-359

[22] Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, et al. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. J Inflamm(Lond).2005;26:2-8.

[23] Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.Exp Hematol.2002;30 (1): 42-48.

[24] Abdallah BM, Kassem M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther.2007; 15(2): 109-116.

[25] 胡蕴玉. 现代骨科基础与临床[M]. 北京:人民卫生出版社, 2006, 168.

[26] 韩志军,刘晓峥,任华. 猪骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程化软骨[J].中国组织工程研究与临床康复, 2008,12(2): 209-212.

[27] Cooch KJ, Blunk T, Courter DL, et al. Bone morphogenetic proteins2,-12 and-13 modulate in vitro development of engineered cartilage. Tissue Engeneering.2006;8(4):591-601.

[28] Swieszkowski W, Tuan BH, Kurzydlowski KJ,et al. Repair and regeneration of osteochondral defects in the articular joints. Biomolecular Engineering. 2007;24(5):489-495.

[29] Wakitani S. Present status and perspective of articular cartilage regeneration. Yakugaku Zasshi.2007;127(5): 857-863.

[30] Wakitani S, Imoto K, Yamamoto T, et al. Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal cell transplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees. Osteoarthritis Cartilage.2002;10(3):199-206.

[31] Roelen BA, Dijke P. Controlling mesenchymal stem cell differentiation by TGF-Beta family members.J Orthop Sci. 2003;8(5):740.

[32] Barry F, Boynton RE, Liu B, et al. Chondrogenic diferentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp Cell Res. 2001;268(2):189-200.

[33] Kawamura K, Chu CR, Sobajima S,et al. Adenoviral-mediated transfer ofTGF betal but not IGF-l induces chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet cultures. Exp hematol.2005;33:865-872.

[34] Worster AA, Nixon AJ , Brower-Toland BD, et al. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res.2000;6l(9):1003-1010.

[35] 潘海涛,林欣,宋磊.骨形态发生蛋白/碱性成纤维细胞生长因子复合材料修复关节软骨缺损的实验研究[J].首都医科大学学报, 2006,27(3):397-399.

[36] Longobardi L, O’Rear L, Aakula s, et al. Effect of IGF-I in the chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells in the presence or absence of TGF-beta signaling. J Bone Miner Res.2006;21:626-366

[37] 宋红星,沈惠良,王民,等. 松质骨骨基质明胶负载软骨细胞移植修复兔膝关节软骨缺损[J].中华风湿病学杂志,2003,7(11): 678-680.

[38] Indrawattana N, Chen G, Tadokoro M, et al. Growth factor combination for chondrogenic induction from hum an mesenchymal stem cell. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 320:914. 919

[39] 丁小邦,程宁新,陈兵,等.应用b-FGF刺激的软骨细胞构建自体组织工程化软骨的研究[J].中华整形外科杂志, 2004,20(3): 215-218

[40] Indrawattana N, Chen G, Tadokoro M, et al. Growth factor combination for chondrogenic induction from hum an mesenchymal stem cell. Biochem Biophys Res Commun. 2004;320:914-919.

[41] Tay AG,Farhadi J,Suetterlin R,et al.Cell yield, proliferation, and postexpansion differentiation capacity of human ear, nasal, and rib chondrocytes.Tissue Eng.2004;10:762-770.

[42] Kaplan BA, Gorman CR, Gupta AK, et al. Effects of transforming growth factor Beta and insulinlike growth factor 1 on the biomechanical and histologic properties of tissue-engineered cartilage. Arch Facial Plast Surg.2003;5: 96-101.

[43] Schmitt B, Ringe J, HAupl T, et al. BMP2 initiates chondrogenic lineage development of adult human mesenchymal stem cells in high-density culture. Diferentiation. 2003;71(9-10):567-577.

[44] Frondoza C, Sohrabi A, Hungerford D. Human chondrocytes proliferate and produce matrix components in microcarrier suspension cultureJ. Biomaterials.1996;17(9):879-888.

[45] Oakes DA, Lieberman JR. Osteoinductive applications of regional gene therapy:ex vivo gene transfer. Clin Orthop Relat Res.2000;(379Suppl):101-112.

[46] Saraf A, Mikos AG. Gene delivery strategies for cartilage tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev.2006;58(4):592-603.

[47] Geoffrey R,Jeffrey M, Dawn M,et al.Chondrogenic Potential of Adipose Tissue-Derived Stromal Cells in Vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 2002;290(2):763-769.

[48] Christophel JJ,Chang JS,Park SS. Transplanted tissue-engineered cartilage. Arch Facial Plast Surg.2006;8 (2) :117-122.

[49] Fan H, Hu Y, Zhang C. et al. Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and a PLGA-gelatin/chondroitin/ hyaluronate hybrid scaffold. Biomaterials.2006;27(26): 4573-4580