伤口愈合是不同组织和细胞谱系的协同作用以替换或修复缺失的细胞和组织结构的结果。慢性伤口可能需要更长时间才能愈合。间充质干细胞作为组织损伤修复治疗的重要来源，具有多向分化潜能、低免疫原性和免疫调节特性等优势，使得其在糖尿病皮肤慢性创面治疗中备受研究者关注。然而随着研究的深入，干细胞治疗可能并非主要依赖移植干细胞的体内分化，旁分泌作用及炎症免疫调节能力可能才是干细胞发挥组织损伤修复的主要作用机制。以下是间充质干细胞通过旁分泌分泌生长因子和外泌体在组织修复治疗中的部分研究脉络，见表1，表明了间充质干细胞旁分泌作用分泌的生长因子、外泌体等对组织修复的潜力逐渐凸显。 "

糖尿病慢性溃疡创面伴随着生长因子的分泌和活性降低，内皮祖细胞的募集减少，造成成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移受损，以及血管生成及胶原基质的形成受损[12]。利用间充质干细胞的条件培养基、外泌体及生长因子等作为无细胞治疗新策略的载体，通过不同的作用机制在伤口恢复不同阶段发挥促进创面的再上皮化、新生肉芽组织和新生血管生成作用，缩短伤口愈合时间，提高愈合率，见图3。 "

2.1   糖尿病足溃疡慢性创面的病理生理学   伤口愈合过程可以定义为复杂的级联反应，依赖于多种组织修复机制，以最佳方式恢复组织完整性和功能，包括凝血、炎症、基质合成、血管生成和组织重塑。然而，在非愈合性慢性创面中，如糖尿病足溃疡，上述高度协调的过程被持续的炎症状态和因活性氧产生过多而导致创面长期微循环障碍，降低创面愈合质量。糖尿病足溃疡是糖尿病慢性严重的并发症之一，常因长期的血糖控制不佳、局部创伤与感染等多重因素诱发，造成创面炎症期延迟、血管生成受损等，使得慢性创面迁延不愈。高血糖是糖尿病最主要的特征之一，持续的高血糖使得内皮代谢和功能发生异常，导致一系列微观和宏观循环功能障碍，最终影响血管生成过程[13]。由于长期暴露于高糖的环境下，内皮细胞失去完整性，变得容易脱落和凋亡[14]，从而导致糖尿病足溃疡创面愈合进程发生异常甚至停滞。持续的高血糖还会导致多种晚期糖基化终产物，进而诱导M1巨噬细胞的增多，释放多种促炎性因子，破坏皮肤创面愈合过程[15]。不仅如此，慢性炎症也是破坏糖尿病足溃疡愈合过程的最常见原因之一。葡萄糖和游离脂肪酸浓度在各种组织中持续升高可诱发炎症反应过程。创面慢性炎症的标志是免疫细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞)浸润到创面部位，并释放导致创面愈合不佳的促炎性分子[16]。另外，巨噬细胞从促炎的M1表型极化为抗炎的M2表型有利于抑制创面的炎症反应，为创面愈合产生积极作用。然而，研究表明糖尿病足溃疡中M1巨噬细胞向M2巨噬细胞表型极化存在困难，表现为M1巨噬细胞在创面的持续性浸润，分泌大量的促炎因子，进一步加剧了创面的炎症反应[17]。糖尿病足溃疡还伴随着生长因子的分泌和活性降低，内皮祖细胞的募集减少，成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移受损，以及胶原基质的形成受损[18]。 在正常的急性伤口愈合中，损伤部位会向角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和血小板等释放多种细胞因子和趋化因子，介导与组织修复相关细胞迁移到受损区域参与损伤修复的过程[19]。令人遗憾的是，在糖尿病足溃疡创面中，由于局部长期的高血糖、缺氧和慢性炎症使得角质形成细胞和成纤维细胞等增殖、迁移和分化过程严重受损，细胞因子和生长因子之间表达不平衡，机体的自我修复能力明显下降，造成慢性伤口难以愈合[20]。 2.2   生长因子与糖尿病足溃疡创面愈合   生长因子是一类可溶性的信号蛋白，它是参与细胞生长、增殖、迁移和分化的天然多肽[21]，影响多种细胞类型的增殖和迁移、血管的生成以及成纤维细胞和炎症细胞的趋化，从而参与伤口愈合过程的不同阶段，促进细胞外基质产生和重塑。生长因子与其受体的特异性结合激活了调节亚细胞生理学和细胞功能各个方面的细胞内信号转导途径，并表现出不同的细胞反应[22]。在启动和维持伤口愈合的不同阶段中，生长因子起着关键作用，生长因子受体的下调和生长因子的快速降解，都会导致创面愈合延迟[23]。在动物性糖尿病创面模型实验中，发现对创面愈合至关重要的生长因子(包括血管内皮生长因子、转化生长因子β等)的减少[24]。有学者归纳了几种对创面愈合有积极作用的生长因子，如血管内皮生长因子、血源性血小板生长因子(blood derived platelet growth factor，PDGF)、转化生长因子β以及成纤维细胞生长因子等，这些生长因子可诱导角质形成细胞和成纤维细胞的增殖，促使肉芽组织中毛细血管的形成，并调节细胞外基质沉积和损伤区域的组织结构重建[25]。由于生长因子在创面愈合中的作用及其在慢性创面中的不足，因此，对外源性的生长因子或干细胞分泌的生长因子在创面局部施用是促进创面愈合的一种有希望的策略，见表2。 "

PDGF是创面愈合中被广泛研究的生长因子之一，在伤口愈合的各个阶段都可刺激成纤维细胞、中性粒细胞、单核细胞向损伤部位的迁移[25]。重组人PDGF-BB(Becaplermin)是目前被美国食品及药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的唯一用于治疗慢性创面的生长因子，并且已成功用于糖尿病足溃疡治疗当中[27]。将PDGF联合含有抗生素的特定生物支架进行干预，同样也有效促进了糖尿病大鼠感染的创面恢复[36]。血管内皮生长因子是另一种在创面愈合过程中起重要作用的生长因子，它能够激活内皮细胞和诱导新生血管的形成，并且是生长因子家族中促进内皮细胞增殖最强的生长因子，也是决定创面血管新生的关键因子[37]。血管内皮生长因子通过与内皮细胞上的酪氨酸激酶受体VEGFR-2结合发挥血管生成作用[38]。它主要涉及蛋白酶对现有的血管细胞外基质的降解，并导致毛细血管内皮细胞的迁移和增殖。KULWAS等[39]研究表明，2型糖尿病合并足溃疡的患者与无足溃疡的糖尿病患者相比，血清中的VEGFR-2和VEGF-A水平均降低，并导致了血管形成受阻，成为伤口愈合延迟的原因。然而，GANGADARAM等[40]研究表明骨髓间充质干细胞来源的外泌体可通过激活内皮细胞的VEGFR-2，介导VEGF-A的合成增加，促进了小鼠后肢糖尿病足溃疡处的内皮细胞的增殖、迁移和创面新生血管生成，从而改善了缺血后肢的血液灌注与创面修复。 此外，为解决外源性生长因子因半衰期短及稳定性低等影响治疗效果的问题，将生长因子与生物支架结合作为药物系统载体输送来提高治疗效果逐渐被应用于组织缺损修复当中。最近一项研究表明，将载有血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α共修饰的胶原支架植入糖尿病大鼠皮肤创伤模型后，观察到两种重组蛋白从胶原支架上持续释放，不仅在促进血管生成方面显示出协同效应，同时在短期内减少了炎症，进而促进细胞增殖、血管再生、再上皮化和细胞外基质积累[41]。WHITE等[42]通过利用VEGF-A、PDGF-BB和肝素结合表皮生长因子联合治疗糖尿病小鼠模型，显示“三联疗法”的联合作用比单独使用生长因子效果更佳，表现为M1巨噬细胞和效应T细胞数量明显减少，并且在局部损伤部位停留的时间明显长于其他生长因子。碱性成纤维细胞生长因子被认为是一种有效的有丝分裂原，能够促进成纤维细胞增殖和新生血管形成，也是加速伤口愈合的关键因子。在一项临床研究中，MATSUMOTO等[34]采用碱性成纤维细胞生长因子浸渍明胶片对急性或慢性溃疡患者进行外敷治疗，发现8例患者中有6例不同类型慢性溃疡患者的皮肤创面可实现完全上皮化，并证实了碱性成纤维细胞生长因子具有促进成纤维细胞增殖、胶原成熟和诱导新生血管生成的作用。研究表明，在人脐带间充质干细胞条件培养基(hUMSC-CM)里检测到与伤口愈合相关旁分泌生长因子碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮生长因子的存在，并显著促进大鼠模型创面的再上皮化和胶原蛋白形成[43]。脂肪来源的干细胞条件培养基(ADSC-CM)通过旁分泌转化生长因子β，体外诱导成纤维细胞向肌成纤维的转化[44]。并且，XIN等[45]体外研究发现，人包皮来源真皮干/祖细胞条件培养基(hFDSPC-CM)通过体外转化生长因子β/Smad信号通路促进成纤维细胞的胶原蛋白生成。 2.3   条件培养基与糖尿病足溃疡创面愈合   近些年的研究表明，间充质干细胞的治疗作用可能是通过旁分泌方式分泌可溶性因子介导的，通过招募和改善靶组织中的天然细胞活性来强化组织修复和再生的内源性机制[5-6]。条件培养基是指含有多种细胞分泌体和游离细胞因子的细胞上清液，其发挥治疗作用类似细胞治疗中的旁分泌效应。目前间充质干细胞条件培养基在伤口愈合方面的潜力已逐步得到研究证实，因此可能作为基于干细胞治疗的更好替代解决方案之一[46]。间充质干细胞条件培养基中干细胞分泌的旁分泌因子(称为分泌组)中含有多种细胞因子、趋化因子和生长因子，如血管内皮生长因子、表皮生长因子、角质细胞生长因子、基质细胞衍生因子1等[47]，对组织再生修复有多重积极影响。研究表明，间充质干细胞条件培养基通过刺激与创面愈合相关的细胞和细胞因子的迁移和增殖，在创面内诱导新生血管形成、加速上皮化和抑制炎症，继而促进皮肤创面愈合[48]，见图4。 "

慢性创面愈合依赖良的好肉芽组织形成和再上皮化，其中角质形成细胞及成纤维细胞的增殖、迁移和再上皮化是创面愈合的基础。先前研究表明，在糖尿病病理条件下，角质形成细胞和成纤维细胞的生物学功能明显受损，其特征是细胞过早衰老、形态异常，增殖和迁移减少，以及分泌生物活性因子和产生细胞外基质的能力降低[49-50]。然而，有研究者发现，人骨髓间充质干细胞条件培养基可使得表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子上调，从而改善糖尿病微环境中成纤维细胞的细胞行为[51]。新近的一项研究也表明，脂肪干细胞条件培养基可以通过促进转化生长因子β1、血管内皮生长因子的分泌以及成纤维细胞的增殖、迁移和分化来加速糖尿病大鼠的伤口愈合[52]。JOSEPH等[53]将犬、山羊和豚鼠来源的骨髓间充质干细胞条件培养基分别治疗了豚鼠皮肤创面模型后发现，3种不同来源的骨髓间充质干细胞条件培养基均可促进创面血管形成和胶原蛋白的沉积，促进了创面的愈合，三者的治疗效果相当，同时也初步证明了骨髓间充质干细胞条件培养基可以用于同种异体或者异种应用。 条件培养基的获取方式和条件也对创面愈合的效果有着不同的影响。有研究者在3种不同的培养条件下，即常氧、标准和缺氧条件下培养羊膜间充质干细胞获得的条件培养基联合水凝胶局部应用于糖尿病小鼠创面模型治疗后，发现缺氧条件下的羊膜间充质干细胞条件培养基水凝胶更能促进血管生成、加速上皮化和抑制炎症，从而提高糖尿病小鼠的创面闭合率[54]。在导致糖尿病足溃疡的众多因素中，内皮细胞功能障碍导致的血管生成受损至关重要[55]。然而通过局部注射脐带间充质干细胞条件培养基可以促进糖尿病小鼠创面模型的修复，是由于脐带间充质干细胞条件培养基分泌的前列腺素E2通过重塑巨噬细胞表型改善血管内皮细胞功能障碍，以及分泌白细胞介素10和血管内皮生长因子改善了血管内皮细胞的局部微环境，并促进糖尿病小鼠模型创面伤口愈合[56]。内皮祖细胞作为参与血管生成的关键细胞，在血管生成和伤口愈合中起着重要作用，内皮祖细胞向伤口部位的募集取决于基质细胞衍生因子1α的上调[57]。 GALLAGHER等[58]报道糖尿病小鼠创面内基质细胞衍生因子1α表达降低，导致内皮祖细胞向伤口归巢减少，创面血管生成减少。在1型糖尿病大鼠MRSA感染伤口模型中，应用骨髓间充质干细胞条件培养基干预后，伤口处的基质细胞衍生因子1α表达增多，并且中性粒细胞和巨噬细胞数量下降、成纤维细胞计数增加且血管生成增多，炎症得到控制，大鼠创面模型从而得到显著改善[59]。也有研究采用骨髓间充质干细胞条件培养基治疗兔耳增生性瘢痕，发现其可以调控创伤愈合的增殖和重塑阶段，通过上调基质金属蛋白酶1表达而下调基质金属蛋白酶13表达，转化生长因子β1刺激和活化成纤维细胞，调节细胞增殖和组织重塑[60]。 2.4   外泌体与糖尿病足溃疡创面愈合   外泌体(exosomes)是由活细胞分泌的一种纳米级的细胞外囊泡，大小于介于30-200 nm之间。几乎所有的细胞都能够产生外泌体，且为脂质双层膜性结构，富含多种生物活性分子，包括蛋白质、DNA、mRNA、微小RNA (microRNAs，miRNAs)、脂类等[61]。经释放后的外泌体，可以显现出具有多样的活性物质，如重塑细胞外基质及向其他细胞传递信号和分子，成为细胞间传递信号的天然载体，通过与靶细胞相互作用激活各种信号通路发挥生物学效应[62]。随着对外泌体研究的不断深入，发现其在调节炎症反应、细胞免疫、促进血管再生、控制细胞的增殖和凋亡、延缓神经退行性变等生物学过程中均发挥着重要的作用[63]。伤口愈合是一系列复杂的分子和细胞事件过程，如细胞增殖和迁移、血管生成、细胞外基质沉积与组织重塑[64]，从外泌体中提取的不同类型的活性分子可参与上述过程[65]。此外，具有脂质双分子层的外泌体还可以避免被蛋白水解，从而确保了外泌体中的活性成分对靶细胞(例如内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞)发挥作用[66]。外泌体特别是作为干细胞旁分泌的亚细胞成分，在组织修复和再生方面有着潜在的治疗应用优势。 外泌体中的miRNA在血管生成中的作用越来越受到关注。HUANG等[67]研究表明骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过分泌miRNA-21-5p上调血管内皮生长因子受体以及丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性，进而促进糖尿病大鼠溃疡模型创面的血管生成和组织损伤与修复。此外，LI等[68]将人脐带间充质干细胞来源外泌体通过尾静脉注入严重烧伤引起的过度炎症反应大鼠模型，人脐带间充质干细胞来源外泌体通过分泌miR-181c降低了大鼠Toll样受体4(TLR4)的表达，同时下调NF-κB/P65，从而抑制白细胞介素1β和肿瘤坏死因子等炎症因子的释放。在一项临床实验中，YU等[69]通过阿托伐他汀(ATV)预处理后的骨髓间充质干细胞分泌的外泌体显示能够激活AKT/eNOS信号传导机制，该机制通过上调miR-211-3p进一步启动内皮细胞的血管生成，有效地缩短了创面闭合时间。LI等[70]证明，脂肪间充质干细胞来源外泌体通过过表达核因子NF-E2相关因子(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)促进了内皮祖细胞的增殖和血管生成，抑制氧化应激和炎症细胞因子表达来减轻炎症，使得在糖尿病大鼠模型中肉芽组织形成，血管生成增加，生长因子表达水平增加以及炎症和氧化应激相关蛋白水平降低。不仅如此，ZHAO等[71]研究表明，人脂肪间充质干细胞来源外泌体还可以通过负调控基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶3起到促进胶原合成细胞外基质重塑和伤口愈合的作用。人脂肪间充质干细胞来源外泌体能够调节内皮细胞氧化应激，增强内皮细胞的血管生成以及胶原沉积和细胞外基质重塑，促进糖尿病大鼠伤口愈合[72]。 将外泌体与水凝胶联合使用，似乎也成为了一种可替代治疗创面的高效的新策略。在先前发表的文献中，已经发现脂肪间充质干细胞来源外泌体掺入基于冻融的多肽基水凝胶中具有愈合、抗菌和使外泌体持续释放特性[73]。这些特性有助于通过增强伤口部位的细胞增殖、新生血管形成、再上皮化和胶原重塑来促进伤口愈合[74]。最近，YANG等[75]通过构建PF-127水凝胶和人脐带间充质干细胞来源外泌体联合复合物，并将其应用于糖尿病大鼠皮肤损伤模型中，结果表明与单用人脐带间充质干细胞来源外泌体组、仅使用PF-127对照组相比，联合复合物组显著缩短了糖尿病大鼠模型伤口的愈合时间，CD31和Ki67的表达增加，肉芽组织的再生增强以及血管内皮生长因子和转化生长因子β1表达上调。见表3。 "