2.1   间充质干细胞源性外泌体的生物学特征   间充质干细胞在脑血管疾病中的作用被认可，间充质干细胞与神经生成、突触形成、轴突连接、髓鞘形成和免疫调节有关[15-17]。间充质干细胞广泛存在于人体组织中，同时也是产生外泌体能力最强的细胞。细胞移植不仅可以重组神经元网络，而且能够减少炎症反应，促进轴突再生和突触形成。"

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2.2   间充质干细胞源性外泌体治疗缺血性卒中的作用  "

间充质干细胞源性外泌体因其独特的生物特点，可应用于肿瘤、宫腔粘连、肺损伤、骨关节炎及缺血性脑卒中等临床各种疾病。XING等[26]研究结果显示间充质干细胞源性外泌体通过作用于GARP抑制细胞增殖、迁移、侵袭，发挥靶向GARP在小鼠结肠癌细胞MC38中的治疗作用。TAN等[27]研究表明骨髓间充质干细胞源性外泌体在体外能促进细胞增殖和迁移，并能修复宫腔粘连模型小鼠的子宫内膜，骨髓间充质干细胞源性外泌体可能通过过表达miR-29a在子宫内膜修复过程中起到抵抗纤维化的作用。MIZUTA等[28]应用间充质干细胞源性外泌体治疗急性肺损伤小鼠模型，结果显示间充质干细胞源性外泌体中miR-126表达增加，明显提高了小鼠的存活率，抑制了肺出血和水肿，并减小血管通透性，进一步发现间充质干细胞源性外泌体可能通过激活PI3K/Akt通路对内皮细胞发挥保护作用。在缺血性卒中实验研究中发现间充质干细胞源性外泌体具有改善血流恢复、减少梗死体积及药物传递的作用[24-25]，有很好的临床应用价值。 2.2.1   间充质干细胞源性外泌体与血脑屏障   缺血性脑卒中后发生的病理改变主要在神经血管单元。神经血管单元主要有周细胞、脑血管内皮细胞、脑实质细胞及血脑屏障相关紧密连接蛋白构成[29]。缺血性脑卒中后血脑屏障被破坏，周细胞和大脑内皮细胞相互作用，促进血管新生，修复血脑屏障[10]。研究表明，过表达miR-21-3p通过调节MAT2B功能，促进细胞凋亡和炎症，加重血脑屏障损伤[30]。LI等[31]研究显示间充质干细胞能够增加大脑中动脉闭塞大鼠模型中的紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的分布，改善血脑屏障状态，减轻脑水肿，进一步表明间充质干细胞通过抑制miR-21-3p水平和上调MAT2B水平，抑制细胞凋亡、炎症反应起到缺血性脑损伤的保护作用。大脑中动脉闭塞模型侧脑室注射miR-132，结果显示外源性miR-132可以降低血脑屏障紧密连接的降解，减少梗死体积，减轻脑水肿，改善神经功能[32]。通过调节血脑屏障通透性对于卒中后康复具有重要的意义。 2.2.2   间充质干细胞源性外泌体与血管新生   脑缺血后血管阻塞会破坏血管本身的结构，改变血管通透性，能够正常供血供氧的血管减少。间充质干细胞源性外泌体通过调节神经血管单元细胞间的信息交流，促进血管生成，改善大脑微环境，从而恢复脑组织氧和能量供应，改善血管功能，促进卒中后患者的康复[33-34]。XIN等[11]构建大脑中动脉闭塞大鼠模型24 h后尾静脉注射间充质干细胞源性外泌体，结果显示血管内皮细胞数量显著增加，表明间充质干细胞源性外泌体可以改善卒中后血管新生。间充质干细胞源性外泌体实验组大鼠Ki67+DCN+细胞增加，外泌体分泌miR-210、miR-184、miR-137表达上调，可能与血管新生、神经发生有关[35]。由于外泌体的功能一部分与来源干细胞有关，神经元及血管内皮细胞来源外泌体对卒中后血管修复有着重要的作用[36]。 2.2.3   间充质干细胞源性外泌体与神经分化   神经系统中的神经干细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而产生具有自我更新能力的脑组织细胞。实验研究表明，脑卒中后静脉注射间充质干细胞源性外泌体可以改善卒中后神经新生与血管重建[36]。大脑中动脉闭塞模型大鼠尾静脉注射骨髓间充质干细胞源性外泌体，可促进脑卒中后的功能恢复，增强神经突起重塑、神经发生和血管生成，是治疗脑卒中的一种新方法[11]。静脉输注富含外泌体的骨髓间充质干细胞可显著改善大脑中动脉闭塞模型大鼠缺血皮质的轴突重塑[37]，间充质干细胞源性外泌体已经被证实可促进神经分化，进而改善神经功能。 2.2.4   间充质干细胞源性外泌体与神经修复   由于卒中后缺血缺氧会损伤神经功能，加速神经细胞的凋亡。缺血性卒中模型大鼠静脉给予含miR-17-92的外泌体，可以增加脑卒中后神经可塑性和功能恢复，其机制可能是通过靶向PTEN激活下游PI3K/Akt/mTOR/GSK-3β信号通路[38]。给予大鼠注射沉默miR-133b的间充质干细胞源性外泌体可以增加缺血性脑组织中CTGF和RhoA水平，导致神经功能衰减，而miR-133b水平升高具有相反的作用，因此间充质干细胞源性外泌体可以抑制靶点RhoA，促进神经突触的增加[39-40]。大脑中动脉闭塞模型大鼠静脉注射脂肪间充质干细胞源性外泌体，可以降低大鼠脑梗死面积，促进神经功能修复[41-42]。 2.2.5   间充质干细胞源性外泌体与免疫炎症及氧化应激   脑卒中后发生的免疫炎症和氧化应激反应可以促进脑卒中的进展，多种炎症因子、淋巴细胞、氧化分子作用可导致梗死面积扩大，加重病情，因此调节免疫反应、抗炎、抗氧化对于缺血性卒中具有重要临床意义[43-44]。CECI等[45]通过研究比较斑马鱼和哺乳动物神经元再生情况以及哺乳动物神经元再生失败的机制，认为炎症作用是神经元再生的主要抑制剂。间充质干细胞源性外泌体在器官炎症损伤中起着重要的作用，有研究表明间充质干细胞源性外泌体通过逆转CysLT2R-ERK1/2介导的小胶质细胞M1极化减弱了脑损伤并抑制了小胶质细胞炎症反应[41]。脑卒中后神经元和小胶质细胞相互作用调节免疫炎症反应，骨髓间充质干细胞源性外泌体miR-138-5p通过靶向作用抑铁素2，促进缺血性卒中后星形胶质细胞增殖，抑制炎症反应，从而减轻神经功能损伤，可能为缺血性卒中治疗提供新的靶点。研究表明，局灶缺血性脑卒中大鼠谷氨酰胺酶1表达水平上调，通过谷氨酰胺酶抑制剂CB839抑制谷氨酰胺酶1活性降低梗死体积，减轻炎症反应[21]。外泌体治疗可以降低炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达，升高抗炎因子白细胞介素4、白细胞介素10的表达，减轻脑损伤[46]。间充质干细胞源性外泌体可以增强CD4和CD8淋巴细胞的激活以及树突状细胞的减少，调节脑卒中引起的外周免疫抑制[47]，外泌体可以通过血脑屏障，将抗原传递到免疫系统[48]。 综上所述，间充质干细胞源性外泌体可以调节脑卒中后血脑屏障通透性、促进血管新生、改善神经功能、促进神经修复，有望成为缺血性脑卒中一种新的治疗方法。 2.3   间充质干细胞源性外泌体作为中药载体治疗缺血性脑卒中的作用   "

现代研究表明，外泌体作为一种可靠载体靶向传递信息物质，传统中药可通过多靶点对机体进行调控，外泌体作为内源性药物传递纳米系统具有很大的治疗潜力，因此研究将中药有效成分通过外泌体精准运输至靶细胞，发挥药效，成为近年来研究的热点[49]。外泌体可作为药物载体的机制特点如下：①外泌体表面存在特殊的蛋白及磷脂双分子层结构，不仅对外泌体所负载药物有保护作用，而且可以避免被体内系统捕获，长时间发挥作用；②外泌体的天然结构特点，使其更容易与受体细胞融合，其所负载药物更容易被细胞接受[50]；③外泌体由于其体积微小(< 100 nm)，可有效避免单核巨噬细胞的吞噬，能够较自由地穿过血管壁及细胞外基质发挥作用[51]；④外泌体具有独特的特性，包括低免疫原性、固有稳定性、高传递效率和能穿过血脑屏障，作为治疗脑缺血的内源性药物递送纳米系统前景广阔。外泌体负载药物可以用多种方式，目前可通过以下方式进行：①直接转染法，将药物与分离出的外泌体混合培养，通过顺浓度梯度直接进入外泌体内；②间接转染法，将药物与分泌外泌体的细胞一起培养，然后分离出含有药物的外泌体；③穿孔，通过电穿孔法使药物通过小孔进入外泌体内[52]。外泌体目前所负载的药物主要包括基因类、抗癌症药物、抗炎症药物、调节免疫的抗原、蛋白类和中药类药物[50]。将中药有效成分通过外泌体运输到体内可更好地发挥中药作用，进行靶向治疗疾病。目前用于治疗肿瘤性疾病较为广泛，近年来也相继应用于骨性疾病、肝脏疾病及脑血管疾病等。缺血性卒中目前需要探索更有效的治疗方法，研究显示间充质干细胞源性外泌体可以通过负载中药姜黄素、梓醇、灯盏花素等药物起到神经保护、血管新生的作用。 2.3.1   间充质干细胞源性外泌体作为中药载体与神经保护作用   间充质干细胞源性外泌体作为姜黄素的载体，治疗缺血性脑卒中可以起到神经保护作用。姜黄素是一种发现于姜黄根块茎的黄色化合物。姜黄具有行气活血、通经止痛的作用，用于治疗气滞血瘀、经络不畅证。姜黄素在结构上是一种二酮类化合物，在水中以酮形式存在，在有机溶剂中以酚形式存在[14]。姜黄素含有有效成分多酚，具有抗血脂、抗炎、抗氧化、抗癌及神经保护作用[53]。姜黄素作用广泛，但是在临床运用中存在一定缺陷，虽然其神经保护作用使该化合物进入了Ⅰ期临床试验，但其溶解度不高、稳定性差、吸收率低、代谢快、半衰期短等缺点，导致其利用度低，限制了在治疗疾病中的应用[54]。研究发现，通过不同大小载体运输会影响其溶解度和治疗效果，用姜黄素调控外泌体可以提高其溶解度、利用率和稳定性[21]。一些外泌体能够避开免疫系统，在血液中表现出低免疫反应和高稳定性，延长药物在体内的循环从而更好发挥药效[55]。KALANI等[14，56]证明负载姜黄素的外泌体不仅具有抗血脂、抗氧化和抗炎的作用，还可以改善内皮细胞通透性，减少氧化应激，减轻连接蛋白的结构损伤，从而起到保护神经的作用。研究显示负载姜黄素的外泌体通过AKT/GSK-3β通路抑制Tau蛋白磷酸化，保护神经[57]。综上所述，姜黄素是一种具有临床研究价值的神经保护性药物。 2.3.2   间充质干细胞源性外泌体作为中药载体与血管新生   间充质干细胞源性外泌体作为梓醇中药的载体，治疗缺血性脑卒中可以有助于血管新生。梓醇是地黄的主要有效成分，地黄为玄参科地黄属植物，具有养阴补血、填精益髓的功效，用于治疗血虚证、肝肾阴虚证。梓醇通过上调血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2表达而促进细胞增殖、迁移，进而发挥促进血管新生的作用。梓醇在神经方面的治疗机制包括促进缺血后神经功能恢复、保护神经血管单元、促进局灶脑缺血大鼠神经元新生、轴突形成新的突触连接、上调神经营养因子表达，但其本身入脑效果较差，与冰片配伍后可促进梓醇透过血脑屏障[58-59]。此外，研究还发现通过构建转铁蛋白、脑啡肽和间充质干细胞源性外泌体组成特异性小泡，特异性靶向跨越血脑屏障后的神经元，在体内外发挥抑制神经细胞凋亡和促进神经细胞再生的作用[60]。 2.3.3   间充质干细胞源性外泌体作为中药载体与血脑屏障   间充质干细胞源性外泌体作为灯盏花素的载体，治疗缺血性脑卒中可以有助于调节血脑屏障通透性。灯盏花素是来源于植物高黄芩的叶，高黄芩为有唇科植物。黄芩具有清热燥湿、止血的作用，可泄实火、除湿热、止血。灯盏花素具有扩张血管、改善微循环、抗血小板聚集的作用，广泛用于缺血性脑血管疾病。灯盏花素干预的外泌体可以保护同型半胱氨酸诱导的大鼠微血管内皮细胞损伤，主要通过上调CD63及血脑屏障紧密连接蛋白claudin 5、occludin和ZO-1的表达发挥作用[61]。刘梦琳等[62]临床验证得出灯盏花素注射液联合常规治疗可以改善神经功能，改善血流变指标。由此说明灯盏花素通过外泌体作用治疗缺血性卒中具有一定前景。 课题组前期研究表明间充质干细胞源性外泌体经补阳还五汤诱导后miRNA-126表达升高，miR-221和miR-222表达降低，与卒中后脑血管新生有关[63]。复方补阳还五汤是治疗缺血性卒中的经典方剂，主要有黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁组成。该方重用黄芪，补益元气，使气旺血行，为君药；当归尾活血通络不伤血，为臣药；地龙活血通络，周行全身，为佐药；赤芍、川芎、桃仁、红花协同当归尾以活血祛瘀。该方补气药与活血药配伍，补气不壅滞，活血不伤正，用于治疗中风病之气虚血瘀证。通过中药调控外泌体既可以更好地发挥中药的作用，又体现精准医疗的理念，提高临床治疗效果。 汇总调控外泌体治疗缺血性脑卒中的中药，见表1。 "