2.1   PLGA的优秀性质"

PLGA是由乳酸和羟基乙酸按不同比例随机聚合而成的一类生物高分子材料，乳酸、羟基乙酸单体通过酯键连接，形成线性、无定形的脂肪族聚酯[9]，其合成方法可分为两类：①乳酸和乙醇酸直接聚合，这种方法通常得到低分子质量、相对分子质量分布较广的PLGA；②丙交酯和乙交酯开环聚合，该方法可以得到相对分子质量更高、更均匀的产物[10]。PLGA具有多种优秀性质，如可控的降解性、良好的生物相容性、优良的可塑性等，使其成为应用最广泛的可降解生物聚合物之一。 2.1.1   可控的降解性   在骨组织重建过程中，支架降解缓慢会阻碍新生骨形成，而过快的降解速率会使支架完整性遭到破坏，无法为新骨生成提供合适的场所[11]。PLGA支架可控的降解性是应用于骨缺损修复的优势之一，通过调节支架降解速率可使新骨生成与支架降解达到平衡。PLGA作为脂肪族聚酯中代表性的一类，具有脂肪族聚酯常见的降解性质，在水环境下通过简单的酯键水解而断链，生成降解产物乳酸和羟基乙酸，由于可完全降解，因而无需二次手术去除移植物。体内外实验表明，聚合物分子质量大小、乳酸/羟基乙酸比例、微球粒径、制备方法、官能团修饰、乳酸单体旋光性、局部环境酸碱度、支架几何结构等因素影响PLGA的降解速率，主要表现为随分子质量、乳酸/羟基乙酸比例和微球粒径的增大，PLGA支架的降解性逐渐减慢；局部微环境呈酸性或碱性均会加快支架降解[9，12-14]。但PLGA降解是否受体内酶的影响存在争议，CAI[15]体外模拟细胞外环境，发现在胰蛋白酶作用下PLGA降解速率进一步加快；但有趣的是也有观点显示PLGA支架降几乎不受体内酶的影响[16]。 2.1.2   良好的生物相容性   PLGA的降解产物乳酸和羟基乙酸可通过三羧酸循环生成最终产物水和二氧化碳，对机体不会产生毒害作用。此外PLGA因生物相容性突出，美国食品药品监督管理局和欧洲药物管理局批准由PLGA组成的医疗器械可用于临床，如伤口缝线、药物输送系统、体内植入材料等[17]。在骨缺损修复领域，DAI等[18]通过低温冻干技术制备了具有定向孔隙的PLGA支架，体外骨髓干细胞培养显示细胞在支架内迁移并规则分布，植入兔关节12周后经组织学检验证实软骨和软骨下骨均同时再生，无不良反应的出现，体现出PLGA骨缺损修复支架良好的生物相容性。在临床使用中，EPPLEY等[19]对1 883例植入PLGA的患者进行回顾性研究，只有少数几位出现局部轻微的炎症反应，绝大多数患者预后良好。 2.1.3   优良的可塑性   虽然聚乳酸和聚羟基乙酸的溶解性较差，但PLGA能够溶解于多数脂性溶剂中，同时PLGA的玻璃化温度较低，故而PLGA具有良好的可塑性，能够根据缺损部位结构制备出形状相吻合的支架。传统PLGA多孔支架的制作通常采用成孔剂浸出、气体发泡、相分离等技术，这类方法虽然操作简单，通过改变成孔剂的用量便能有效控制成孔大小和孔隙率，但孔隙之间缺乏互通、溶剂去除不完全、支架稳定性差、难以精确控制尺寸等缺点，无法满足临床需求[12]。静电纺丝法是近几年的研究热点，熔融的PLGA在静电作用下雾化成微小液滴并在强电场下喷射纺丝成微纳米纤维，通过控制纤维的堆叠、排列等方式组装成三维立体支架，具有极高的表面体积比和可调控的纤维间孔径[20]。在扫描电镜下观察发现，成骨细胞能够在纤维支架上攀附生长，并沿着相通的孔径迁移至支架内部，解决了传统支架细胞无法深入支架的困境[21]。3D打印也是PLGA支架常见制备方法，不仅能通过在电脑上精准设计支架的大小、孔径、形状，也能根据缺损区域的力学要求调整参数，使支架获得合适的机械强度[22]，此类支架通常为规则的网状结构，具有良好的内部连通性。然而有观点显示，均匀的多孔支架可能并不能适应修复需要，天然骨的孔隙率并不均匀，松质骨孔隙大而多，皮质骨坚固孔隙少，文章指出进一步研究方向应当是通过精密的计算实现孔隙率呈梯度分布，以适应修复部位的机械性能[23]。 2.2   PLGA修饰改性研究   PLGA支架虽然具有上述优秀性质，被认为是一类理想的骨修复材料，但体内外实验发现纯PLGA表面具有较强的疏水性，而人体将疏水性物质视为外来物，同时PLGA纳米粒子带有负电荷，会和带有负电的细胞膜发生排斥，因此不利于成骨细胞和血管内皮细胞的黏附和迁移，故而纯PLGA支架在体内缺乏足够的成骨和成血管能力[24-25]。同时PLGA降解生成酸性产物，酸化的微环境又会促进支架降解[15]，并会促进多核巨细胞、巨噬细胞和成纤维细胞趋化和增殖，引发慢性炎症反应，甚至抑制新生骨形成[17，26]。因此研究人员尝试对PLGA支架进行修饰，改变支架性能，以更加适用于骨缺损修复，最常见的修饰方法包括负载生物活性物质和药物、无机物共混修饰和表面修饰等。"

2.2.1   PLGA负载多种生物活性物质和药物的研究 PLGA负载多种生物活性物质的研究：骨组织重建修复过程可分为3个重叠阶段：支架降解、血运重建和骨再生[27]，因此成骨和成血管能力是评估支架性能的重要参数之一。不幸的是，PLGA纯支架的成骨活性和血管重建能力有限。但PLGA可通过负载生物活性物质，如干细胞、生长因子等提高支架成骨活性促进骨再生。XIA等[28]在PLGA支架内加入负载人骨形态发生蛋白2的明胶微球，与纯PLGA支架相比，负载生物活性成分的PLGA支架表面骨髓间充质干细胞增殖更快、活性更高，表明加入人骨形态发生蛋白2对细胞增殖有促进作用。WANG等[29]将PLGA同时负载人骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子，植入体内后两种活性物质能够持续释放，相比于PLGA纯支架其成骨能力和血管重建能力均有所提升。 干细胞、支架、细胞因子是组织工程三大要素。然而到目前为止，骨髓间充质干细胞在修复大面积骨缺损中几乎都应用失败，主要原因是缺损部位血供不足[30]，因而解决大面积骨缺损修复过程中供血不足的问题能够提高骨髓间充质干细胞应用效果。研究人员将负载有骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子的PLGA支架表面包裹由温度响应性表面细胞培养技术制备的骨髓间充质干细胞片，并在支架内注入成骨细胞，随后植入犬下颌骨缺损处，并将牙槽神经血管束分离、植入支架纵槽内，16周后实验组下颌骨缺损几乎完全修复，新生骨特征(如机械强度、哈弗氏管结构等)与正常下颌骨相似，而未包裹骨髓间充质干细胞的对照组修复程度未达到实验组，表明增加血供和负载干细胞能够协调促进PLGA支架成骨活性[31]。 PLGA负载药物的研究：在骨缺损修复手术中，术后感染、癌肿切除后复发、骨质疏松、糖尿病等症状是影响手术成功的常见因素，临床医生往往通过全身用药以降低相应症状对骨重建的影响，但全身应用生物利用率很低，而且大剂量运用可能会损伤肝肾脑等器官，尤其是骨肿瘤化疗性药物[32]。幸运的是，PLGA支架是包封不溶性药物的重要载体，目前PLGA应用于药物控释系统已得到临床医生的充分认识。包载有药物的PLGA支架在体内微环境下水解释放出负载药物并作用于局部，达到局部高浓度和全身低浓度的目的，这类药物输送系统相比于全身用药具有靶向特异性高、药物释放时间长、可生物降解、消除全身用药毒副反应等优点。癌肿术后[32]、糖尿病和骨质疏松患者相关的骨缺损治疗也有较多文献报道[33-37]，但为避免过度赘述，此处以骨感染为例进行讲述。 骨感染是一种具有强烈破坏性的疾病，对于污染性骨缺损或开放性骨损伤，如不能早期控制感染，则可能引发严重骨髓炎甚至残疾。全身应用抗生素往往很难在感染部位达到有效浓度，而负载抗生素的PLGA支架能够在骨修复局部释放高浓度抗生素而达到治疗目的。为验证支架的可靠性，研究人员在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌骨缺损动物模型中植入万古霉素支架，用放射学、微生物学和组织学检查评估疗效，结果显示抗菌效果能够持续4周；与空白对照组相比，实验组未检测到金葡菌定植，同时无菌性环境有利于增强成骨细胞活性，实验组表现出骨再生能力增加，故而此类支架具有治疗感染性骨缺损的潜力[38]。在类似的实验中，研究人员通过研究抗生素释放曲线发现，抗生素在最初几小时内呈现爆发式大量释放，随后持续性低剂量缓慢释放[39]，这对感染性骨缺损修复至关重要，早期局部微环境的高浓度抗生素有利于完全杀死细菌，持续低剂量抗生素的维持有助于抑制细菌生长。在另一项研究中，LIMIRIO等[40]将抗生素多西环素和成骨促进性药物阿仑膦酸钠同时负载在PLGA支架上，以探究多西环素和阿仑膦酸钠联合PLGA对骨修复的局部作用，结果显示两种药物联合运用能够避免术后感染发生，同时由于多西环素抗胶原溶解和趋化成骨细胞的性质，在骨缺损处出现更多新骨生成。虽然较高的抗生素浓度对预防骨感染具有积极作用，但是术后早期较高的药物浓度可能会对局部组织产生损伤，引起不必要的并发症，例如对于癌肿药物支架，化疗药物大量释放可能会对正常细胞的生长产生过度抑制，影响骨修复进程。 2.2.2   PLGA与无机物共混修饰的研究   PLGA等聚酯材料亲水性差且不具有成骨诱导能力，不利于细胞黏附、生长和分化[25]。研究发现，将PLGA与无机材料复合是解决这一问题的有效策略之一。通过结合多种材料优势，提升PLGA支架的机械性能、降解稳定性和细胞亲和力等，以尽可能模仿原始骨结构与功能，其中羟基磷灰石和磷酸三钙应用最为广泛。 PLGA/羟基磷灰石复合支架的研究：PLGA与羟基磷灰石复合支架的研究最为深入。羟基磷灰石的分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，是人体骨组织无机相主要组成成分，具有良好的生物相容性和骨传导性，其降解释放钙离子可促进细胞增殖，是一类常见的骨缺损修复材料[41]，然而低机械强度、高脆性、不易降解和不易加工成型等不足使其不适宜直接用于骨组织修复。研究人员发现，将适量羟基磷灰石和PLGA通过物理共混制成复合支架可以提高支架力学强度，同时羟基磷灰石会在支架表面发生自聚形成纳米结构，这种结构有利于细胞黏附[42]。此外，羟基磷灰石是一类碱性物质，能够中和PLGA降解的酸性产物。在电子显微镜下观察可见，PLGA/羟基磷灰石复合支架具有大小合适的孔隙，适宜细胞迁移，同时细胞能够紧密黏附于支架表面，细胞生长、分化活跃，相比于PLGA纯支架具有更多新骨生成[43]。CUI等[44]通过检测血液和生化指标以评估PLGA/羟基磷灰石复合支架性能，复合材料植入30，60 d后无家兔出现炎症等不良反应，血常规和生化指标无异常，证明PLGA/羟基磷灰石复合支架具有生物安全性。此外，各种生物活性因子也被负载于PLGA/羟基磷灰石支架中，以促进骨愈合。有研究在PLGA/羟基磷灰石支架内加入负载血小板源性生长因子基因的慢病毒载体，通过检测血管生成标记物、实时荧光定量聚合酶链式反应分析证实，该支架显著改善血管生成和组织再生[45]。另一项研究中，研究人员在PLGA/羟基磷灰石支架中加入具有电导性的聚乳酸-氨基丁酸共聚物和负载人骨形态发生蛋白4基因的质粒载体构建一种新型支架，在电脉冲刺激下实现对人骨形态发生蛋白4表达的严格控制和按需释放[46]。也有研究在PLGA/羟基磷灰石支架中加入磁性纳米颗粒，在外加磁场作用下通过磁热疗能有效抑制和杀伤骨肿瘤细胞，并且加入磁性纳米颗粒能增强细胞的黏附、增殖和分化[47]。 由于羟基磷灰石与PLGA的亲水性不同，物理共混后的界面相容性差，易引发羟基磷灰石团聚，无法均匀分散到PLGA中，使得复合支架稳定性降低，植入体内后其力学强度会快速衰减[48]。并且随着羟基磷灰石浓度的升高，细胞黏附性呈现下降趋势[42]。JOSE等[49]研究发现，羟基磷灰石在低浓度下没有发生团聚，并且获得良好的分散性，羟基磷灰石的存在对支架力学性能具有增强作用；在较高浓度(10%)下可以观察到羟基磷灰石团聚；并且在20%浓度下有显著影响，高浓度羟基磷灰石会导致大量纤维断裂，支架力学性能下降。为提升PLGA/羟基磷灰石复合支架性能，有研究通过接枝技艺对羟基磷灰石进行改性，不光能使羟基磷灰石在PLGA支架内均匀分布，也能改善支架的抗压强度和细胞亲和性[50]。PARK等[51]将PLGA通过酯交换熔融接枝技术直接以聚合物状态接枝到羟基磷灰石表面，有效地形成羟基磷灰石颗粒和PLGA之间的锚定结构，此方法制备的复合材料拉伸强度提高2倍以上。SHI等[52]以羟基磷灰石接枝左旋乳酸低聚物，与PLGA具有较好的界面相容性，此外通过在支架内添加丙交酯和电活性材料苯胺五聚体缩聚反应合成的多嵌段共聚物，在电刺激作用下新生骨形成速度增加，矿化程度增高。 PLGA/磷酸三钙复合支架的研究：磷酸三钙在人体骨骼中普遍存在，也是一种良好的骨缺损修复材料。磷酸三钙具有良好的生物相容性、生物活性、骨传导性和骨诱导性，然而高脆性和耐疲劳性差是其主要缺点。磷酸三钙与PLGA复合后能够增加支架骨诱导和骨传导能力，平衡脆性问题，并改进支架力学性能[53-55]。2004年以来，PLGA/β-磷酸三钙植入物已被应用于人类骨科领域[56]，如固定螺钉[56]、骨空腔填充剂[57]、间隔棒等[58]。 单纯的PLGA/磷酸三钙复合支架并不能完全适应骨缺损修复的需求，研究人员在PLGA/磷酸三钙中包裹脂肪源性间充质干细胞，细胞-支架的相互作用可以显著提高干细胞活性，引导干细胞分化，促进骨细胞外基质形成，促进修复性成骨，体外实验中脂肪源性间充质干细胞显示出明显的向成骨细胞分化能力，在含成骨剂的培养液中支架内外均存在基质矿化；植入体内干细胞负载组显示出明显的新骨形成，该实验证明支架负载干细胞能够促进骨缺损修复，然而支架中心区域细胞大量死亡，表现出欠缺的成骨能力，故而需进一步改善血管生成能力[59]。细胞生存所需的营养物质依赖于间质液体扩散和血液灌流，然而缺损部位血供受损、间质扩散，只能在最大范围200 μm内支持细胞，因而缺损部位血供不足是影响骨修复的重要原因。DUAN等[30]将血管内皮生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞与PLGA/磷酸三钙支架联合并植入兔体内，能够显著促进血管和骨形成。 为中和PLGA降解引起的局部酸性微环境，研究人员尝试在PLGA/磷酸三钙支架中负载碱性物质。氢氧化镁是最常见抑酸剂，研究人员在PLGA/磷酸三钙支架制作时添加氢氧化镁，支架表面的粗糙度增加，PLGA的降解速率降低，体内实验证实磷酸三钙和镁离子协同诱导胶原和矿物质沉积，而没有产生严重的炎症反应和破骨细胞活化，表明β-磷酸三钙和氢氧化镁的结合可以很好地调节复合材料的降解/吸收速率，促进骨再生[60]。LAI等[61]以镁粉、PLGA、β-磷酸三钙为原料，采用低温快速成型技术制备一种新型多孔支架，加入镁后的支架结构与人体骨小梁相似，并能改善聚合物力学性能、中和陶瓷硬度，具有良好的仿生结构，虽然镁的加入使支架降解速度增快，但镁可以促进骨生长并促进局部血液灌注；动物实验证实，新型支架组新生骨的力学性能和新生血管的生长优于无镁组，植入12周新生骨量比后者多50%。 PLGA与其他材料的复合研究：除羟基磷灰石、磷酸三钙外，研究人员还尝试将PLGA与其他无机材料共混，制造新型骨替代材料。生物活性玻璃具有骨诱导性且能与骨组织紧密粘结，然而降解速率过于缓慢，因而不利于新骨生成[62]。YANG等[63]以9∶1比例制造出PLGA/生物活性玻璃支架，植入兔体内后支架显示出良好的生物相容性，该支架在植入早期成血管能力显著，并能诱导新生骨组织矿化，6个月后支架完全降解，该团队表示将进一步探究此类支架的力学性能和骨髓造血干细胞在支架上的黏附、迁移等行为。 某些生物无机离子如硅、镁、锶、锌、铜等一直被视为酶、辅酶的必要辅因子，能够促进成骨和新生血管的形成，此外，某些金属离子如Cu2+、Mg2+、Zn2+等同时也具备抑菌效果[3，64]，因而在PLGA支架上负载无机离子能够显著促进新骨生成。ZOU等[65]新合成一种含有铜、锌的PLGA复合支架，被证明具有良好的抗菌效果和促成骨能力，锌具有抗菌和促进伤口愈合的能力，铜也已被证实具有抗菌性能，体内实验表明该支架炎性细胞浸润和细菌数量相较于纯PLGA支架均显著减少。 2.2.3   PLGA支架表面修饰的研究   调节细胞-支架材料之间的相互作用是调节细胞活性的重要方式。研究显示，细胞在支架上趋化、增殖等行为受接触面表面形貌和亲水-疏水特性的影响[66]。纯PLGA有很高的疏水性，限制蛋白质吸附进而影响细胞吸附，同时高疏水性也会阻止介质渗透到支架内部[25，67]。此外，通过共混改性的混合支架成骨诱导能力和亲水性仍旧有限，限制了骨缺损修复的再生刺激[30，50]。研究发现这些缺点可以通过对支架表面进行改性加以克服[67]。 一种非常有效的改性方法是在支架表面结合亲水性物质，如多肽或氨基酸聚合物，其表面正电荷和细胞膜上负电荷之间存在静电相互作用，从而增强细胞对支架的黏附力[68]。JIANG等[69]利用聚多巴胺涂层技术将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽负载于PLGA/羟基磷灰石支架表面，细胞黏附和新骨矿化程度增加，然而仅引入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽后材料表面的成骨诱导作用并未增强，因此他们在支架表面同时负载可调节干细胞分化的骨形态发生蛋白2，体外实验表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽和骨形态发生蛋白2活性涂层能显著促进小鼠成骨细胞的黏附、成骨分化和矿化；植入兔体内后，可促进兔桡骨缺损的体内成骨。此外，还有研究基于生物仿生学原理在支架表面包覆细胞外基质的有机成分，这种方法模拟自然骨骼的组成和结构，从而提高PLGA支架的细胞相容性。在生理条件下，骨组织细胞外基质为骨细胞附着、生长和迁移提供结构支持和稳定的局部微环境，细胞外基质中生物活性分子也具有调节细胞生命活动的功能，其中Ⅰ型胶原、硫酸软骨素等是细胞外基质主要成分。体外实验表明，Ⅰ型胶原能够增强细胞的黏附和增殖，并在分化培养基中促进成骨分化，Ⅰ型胶原/硫酸软骨素能够在未加入分化剂的培养基中诱导骨髓间充质干细胞成骨分化[70]。由于细胞外基质的复杂性和动态性使其难以精确地被模拟，WOJAK-?WIK等[71]制作一种由Ⅰ型胶原、硫酸软骨素和硫酸化透明质酸组成的人工细胞外基质修饰的PLGA支架，通过比较碱性磷酸酶活性和矿物质沉积差异来鉴定复合支架和PLGA纯支架对诱导人源性骨髓间充质干细胞分化的影响，结果表明复合支架组碱性磷酸酶含量和矿物质沉积量均比空白组高，人工细胞外基质的存在增强干细胞向成骨细胞分化的能力。他们在此基础上进一步探究支架表面微结构对人源性骨髓间充质干细胞分化的影响，他们制备单峰和双峰孔径PLGA支架，实验证实双峰孔径支架能够协同人工细胞外基质促进人源性骨髓间充质干细胞的分化，进一步阐释支架表面结构对骨缺损修复的影响[71]。 当前表面改性大多停留在对支架外部空间覆盖或涂覆一层亲水性物质，而对内部孔隙表面的改性却很少涉足，使得支架只能够促进细胞在支架表面黏附增殖，而对细胞迁移至支架内部无促进作用。基于此，有研究以PLGA/β-磷酸三钙复合支架为基础，采用喷墨式全包裹涂层方式将Ⅰ型胶原均匀包裹在PLGA/β-磷酸三钙纤维表面，此类支架表现出更强的表面亲水性、细胞黏附性、增殖性等，植入体内肝肾功能等指标均未有明显改变，证明支架拥有良好的生物相容性[72]。此外，ZHU等[68]通过浸渍法在PLGA/氧化石墨烯杂化纤维基体支架表面包裹一层聚赖氨酸，支架表面和内部经处理后增加细胞结合位点，同时电子显微镜下可见支架表面粗糙度增加，蛋白质黏附实验结果表明牛血清白蛋白吸附量增高2倍左右，在体外培养可见细胞黏附力、活力和分化能力均增加。然而限制于工艺技术的要求，该方法尚处于摸索阶段，但此类修复材料为PLGA支架的表面修饰提出新的发展方向。"