差异蛋白基因生物信息学在冠心病血瘀证遗传相关验证中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.026

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (51): 8337-8345.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.026

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差异蛋白基因生物信息学在冠心病血瘀证遗传相关验证中的应用

郑景辉¹，袁肇凯²，张敏州¹，李杰²，王丽萍³，宁桂兰⁴，孙贵香²，简维雄²，黄献平²，刘吉勇²

¹广州中医药大学第二附属医院重症医学科，广东省广州市 510120；²湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南省长沙市 410007；³湖南怀化医学高等专科学校，湖南省怀化市 418000；⁴广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011

出版日期:2014-12-10 发布日期:2014-12-10
作者简介:郑景辉，男，1976年生，汉族，2010年湖南中医药大学毕业，博士，副教授，主要从事心脑血管疾病的中西医结合诊疗的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81102595)；中国博士后科学基金特别资助项目(2014T70800)；广西自然科学基金课题(2012GXNSFAA053113)；广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题(GZPT1219)；广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(Z2012181)

Bioinformatics analysis of differential genes correlated with blood stasis syndrome of coronary heart disease

Zheng Jing-hui¹, Yuan Zhao-kai², Zhang Min-zhou¹, Li Jie², Wang Li-ping³, Ning Gui-lan⁴, Sun Gui-xiang², Jian Wei-xiong², Huang Xian-ping², Liu Ji-yong²

¹ICU of Second Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; ²Institute of TCM Diagnosis, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; ³Hunan University of Medicine, Huaihua 418000, Hunan Province, China; ⁴Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Online:2014-12-10 Published:2014-12-10
About author:Zheng Jing-hui, M.D., Associate professor, ICU of Second Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 81102595; China Postdoctoral Foundation, No. 2014T70800; the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2012GXNSFAA053113; the Special Project of Traditional Chinese Medicine of the Health Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. GZPT1219; the Self-Financing Scientific Research Project of the Health Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. Z2012181

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组前期通过临床流行病学和分子流行病学显示冠状动脉粥样硬化性心脏病血瘀证具有一定的家族聚集倾向，发现其相关的差异基因与炎症、斑块形成及血管内皮损伤密切相关。
目的：对冠心病血瘀证遗传相关的差异蛋白基因进行生物信息学分析。
方法：根据流行病学调查基础上基因芯片技术确定的冠心病血瘀证遗传相关的差异蛋白基因，通过DAVID数据库搜索软件结合GO数据库搜索进行注释和富集度分析；KEGG、BIOCARTA、BBIOD数据库进行信号转导通路分析；VISANT、DIP数据库检索蛋白质相互作用。
结果与结论：差异蛋白基因主要参与43种生物学过程、3种细胞组分、6种分子途径，差异蛋白主要参与10条信号转导通路，这些蛋白在多条信号转导通路上相互发生作用，发现节点189个，路径映射5个，节点的功能种类包括29类。冠心病血瘀证患者遗传差异基因的功能、通路以及相互作用主要体现在炎症反应、免疫调节、细胞因子趋化、细胞增殖等方面；冠心病血瘀证在多位点、多环节、多种生物学进程中共同发挥作用的复杂病理反应，基因组学生物信息学技术可以站在“整体观”的角度对中医证候的机制作出预测，结合进一步分子生物学验证是一条很好的中医药现代化途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 冠心病, 血瘀证, 遗传, 基因组学, 生物信息学, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous findings on clinical epidemiology and molecular epidemiology have shown that blood stasis syndrome of coronary heart disease has a certain familial aggregation tendency, and its related differential genes are closely associated with inflammation, plaque formation and vascular endothelial damage.
OBJECTIVE: To analysis the bioinformatics of differential genes correlated with blood stasis syndrome of coronary heart disease.
METHODS: Based on the epidemiological survey, differential genes related to blood stasis syndrome of coronary heart disease were identified using gene chip technology. The latest versions of bioinformatics tools including DAVID, GO were combined to assign a precise function to differential genes correlated with coronary heart disease; KEGG, BIOCARTA and BBIOD were used to analyze the signaling pathway; VISANT and DIP to retrieve precise protein-protein interactions.
RESULTS AND CONCLUSION: Differential genes were mainly involved in 43 biological processes, 3 cellular components, and 6 molecular functions. These proteins mainly participated in 10 signal transduction pathways, and interacted in many ways. There were 189 nods and 5 path mappings, and overall 29 nod functions were observed. The functions, signal transduction pathways and interactions of differential genes related to blood stasis syndrome of coronary heart disease are mainly reflected in inflammatory response, immune response, cytokine chemotaxis and cell proliferation. Genome bioinformatics technology can make predictions of TCM syndromes from a “holistic view”, and this technology further combined with molecular biology validation is a very good way in the modernization of Chinese medicine.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: heart diseases, atherosclerosis, genomics

中图分类号:

R318

郑景辉，袁肇凯，张敏州，李杰，王丽萍，宁桂兰，孙贵香，简维雄，黄献平，刘吉勇. 差异蛋白基因生物信息学在冠心病血瘀证遗传相关验证中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(51): 8337-8345.

Zheng Jing-hui, Yuan Zhao-kai, Zhang Min-zhou, Li Jie, Wang Li-ping, Ning Gui-lan, Sun Gui-xiang,Jian Wei-xiong, Huang Xian-ping, Liu Ji-yong. Bioinformatics analysis of differential genes correlated with blood stasis syndrome of coronary heart disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(51): 8337-8345.

图/表（结果） 17

2.1 差异蛋白基因富集分析的结果将8个差异蛋白表达基因上传到David进行功能注释，有7个基因得到了注释，对得到注释的蛋白基因进一步进行GO分析。

2.1.1 差异蛋白基因生物学过程(Biological Process，BP)分析通过DAVID富集分析系统对本实验获得的差异表达蛋白基因进行生物学过程分析。这些蛋白主要参与43种生物学过程(表1) 。

2.1.2 差异蛋白基因生细胞组分(Cellular Component，CC)分析通过DAVID富集分析系统对本实验获得的8种差异表达蛋白基因进行分析，这些蛋白包含了3种细胞组分，值得注意的是这3类细胞组分均是细胞外区域或空间(表2)。

2.1.3 差异蛋白基因分子功能(Molecular Function，MF)分析通过DAVID富集分析系统对本实验获得的62种差异表达蛋白进行MF分析，差异蛋白参与了6类分子途径分别是细胞因子的活性、趋化活性、趋化因子受体结合、基质金属蛋白酶活性、生长因子的活性、肽酶的活性(表3)。

2.2 差异蛋白DAVID聚类分析对注释的蛋白基因进行了功能注释聚类分析(Functional Annotation Clustering)后，得到7个显著性聚类，其中5个聚类分值 >2.00。第1聚类和炎症防御反应有关，第2个聚类主要与对外界刺激(包括炎症反应)的调节，主要是免疫的正向调节有关；第3个聚类主要与迁移、转移的调节有关；第4个聚类主要与细胞因子趋化、细胞增殖有关；第5个聚类主要与G蛋白偶联受体蛋白的信号转导通路有关(表4，图1)。

2.3 差异蛋白基因信号转导通路分析通过差异蛋白基因的KEGG通路分析，发现实验中所鉴定的差异蛋白主要集中的6条信号转导通路上，其中P < 0.05的有4条：Nod样受体信号转导通路、细胞因子及其受体的相互作用、肿瘤相关转导通路、膀胱癌信号转导通路。BIOCARTA通路分析发现5条通路，其中4条P < 0.05，分别是：急性炎症反应细胞因子、调节造血作用的细胞因子、白细胞介素17信号转导通路、细胞因子网络。BBID通路分析发现4条通路，其中1条通路P < 0.05，星形细胞活化因子通路(表5，图2-9)。

2.4 差异蛋白基因之间相互作用结果运用VISANT检索与差异蛋白质相互作用的蛋白，本研究的几种差异基因表达蛋白都在多条信号转导系统功能网络交叉点上，与多种蛋白交互作用(图10)发现节点(Nodes)189个，路径映射(Pathway Mapped)5个，节点的功能种类包括29类(表6)；

通过string数据库对差异蛋白之间的作用(包括直接和间接作用)进行分析：除了ADRB1外，各蛋白之间之间等位基因、基因融合、共生、共表达、数据库、文本注释等方面均存在这相互的联系和作用(图11)。

参考文献

引言

材料方法

设计：差异蛋白基因生物信息学分析。

时间及地点：实验于2009年10月至2014年10月在湖南中医药大学、广州中医药大学完成。

对象：

蛋白基因谱来源：本课题组分子流行病学实验结果^[1]：采用“系谱分析法”^[2]，在临床和社区体检中进行流行病学调查，发现冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证先证者进一步调查确定其一级亲属家系成员。

对遗传流行病学调查所筛选的家系和非家系者进行分组，观察组：家系冠心病血瘀证者39例，其中男性20例，女性19例，平均年龄(66.62±3.95)岁；对照组：家系冠心病非血瘀证者(同病异证对照组)9例，其中男性1例，女性8例，平均年龄(69.89±3.07)岁；以上每位受检者均须签署知情同意书。

方法：

家系冠心病血瘀证者标志基因的确定：取两组被试者典型代表各1例，全血提取RNA，选用美国Affymetrix公司的HumanGenomeU133 Plus 2.0芯片进行扫描，用CommandConsole Software 3.1读取原始数据；对质控合格数据采用Gene Spring Software11.0进行归一化处理，所用算法为现代有限元程序系统(MAS5.0)。

差异表达基因的筛选标准：差异倍数(fold change，FC)为待比较的2个指标标准化后信号的比值(即FC=SignalA/ SignalB)，本研究差异基因筛选的阈值设定为FC≥2、 FC≥3。分析结果上调基因有白细胞介素8、Cxcl1 chemokine(C -X-C motif) ligand 1(CXCL1)、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶25)，下调基因有白细胞介素6、Complement C3(C3)、Tyrosine-protein phosphatase non- receptor(PTPN)、adrenergic receptors beta 1(ADRB1)。本研究以以上蛋白基因为家系冠心病血瘀证者标志基因进行生物信息学研究。

分析数据库及方法：蛋白的功能分析通过DAVID数据库搜索软件结合GO数据库搜索进行了注释和富集度分析。KEGG、BIOCARTA、BBIOD数据库搜索(进行了信号转导通路分析。DIP数据库和VISANT数据库检索蛋白质相互作用检索蛋白质相互作用并构建拓扑结构图。打开DAVID数据库，提交8个差异蛋白作为进一步分析的蛋白集合，同时选择相对应的标识符为：UNIPROB ACCESION，勾选人类全基因组作为背景基因，“Convert Tool”对基因标识规范化，然后选择“Functional Annotation Tool”作为分析工具进行分析。

主要观察指标：通过DAVID数据库搜索软件结合GO数据库搜索进行注释和富集度分析；KEGG、BIOCARTA、BBIOD数据库进行信号转导通路分析；VISANT、DIP数据库检索蛋白质相互作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

本研究对成功筛选出8种差异表达基因蛋白，进行的生物信息学发现：这些蛋白主要参与43种生物学过程、3种细胞组分和6类分子途径，功能注释聚类得到7个聚类簇。蛋白基因的生物学过程分析蛋白质功能分析43种生物学过程中Benjamining校正后P 值小于0.05的有36种，涉及到炎症反应、调节炎症反应、防御反应、免疫反应、体液免疫反应、细胞代谢过程负调节细胞增殖、调节细胞趋化性、白细胞趋化性、积极调控的细胞迁移、调节细胞增殖、细胞表面受体信号转导有关、G-protein耦合受体蛋白信号通路等。由此可见。冠心病心血瘀阻证是一系病列理级联反应的结果，说明了中医症候的复杂性和联系性。这些蛋白在细胞膜的组件包含3种，值得注意的是这3类细胞组分均是细胞外区域或空间。这种细胞结构提示在中医证候本质方面，组织结构层次上还是以细胞作为一个主要单元，其中细胞膜承担了重要的作用。分子途径分析共有6种，主要涉及细胞因子的活性、趋化活性、趋化因子受体结合、基质金属蛋白酶活性、生长因子的活性、肽酶的活性。由于功能注释聚类(functional annotation clustering)可以对高度相近的GO term 再次进行富集，并减少注释冗余^[6]，因此对注释基因进行了功能注释聚类分析后，得到5个显著性聚类(enrichment score >2)，其中，第一聚类和炎症防御反应有关，第2个聚类主要与对外界刺激(包括炎症反应)的调节，主要是免疫的正向调节有关；第3个聚类主要与迁移、转移的调节有关；第4个聚类主要与细胞因子趋化、细胞增殖有关；第5个聚类主要与G蛋白偶联受体蛋白的信号转导通路有关。

在对差异蛋白的信号通路分析及蛋白质相互作用分析是发现主要是Nod样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体之间相互作用、癌症通路、膀胱癌、细胞和分子参与局部的急性炎症反应、调节造血作用的细胞因子、白细胞介素17信号通路、细胞因子网络、角质细胞激酶通路等。Nod样受体(Nod-like receptor，NLR)作为一种胞内模式识别受体，具有识别入侵病原体和激活先天免疫反应的重要功能，是一类细胞内感应分子。NLRP可以调节白细胞介素1 P和白细胞介素18的成熟与分泌，也是重要的炎症调节通路。其他的通路多与炎症反应、细胞感应、细胞反应、细胞分化等有关，可见冠心病心血瘀阻证在现代病理生理学上的复杂性。

在对蛋白质的相互作用进行分析时发现，这些蛋白位于多条通路的节点上，尤其是白细胞介素6、白细胞介素8这两种蛋白，VISANT软件，对所发现的蛋白进行分析时，其功能节点有92个为药物靶基因，提示在其治疗方面有很多值得开发的靶点，而中医药的作用有是多因多效多靶点的特点。在String数据库对差异蛋白基因之间相互作用的研究中发现，除了ADRB1外，各蛋白之间之间等位基因、基因融合、共生、共表达、数据库、文本注释等方面均存在这相互的联系和作用。

目前，大规模基因组表达谱研究及功能分析一般采取基于数据库搜索的策略^[7]。根据上面分析，可以看出冠心病心血瘀阻证在现代病理学的多种途径体现出来，体现了中医药“整体”、“联系”的特点。这些综合效应及其引发的一些级联反应的生物学进程，及其相互之间的串扰仍然是一个很复杂的研究工程，亟待深入研究，但是本文从生物信息的途径，站在“整体观”的角度对冠心病心血瘀阻证的物质基础、病理反应机制做出了预测，还需进一步的分子生物验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

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