组织工程化气管研究：软骨及血供障碍的突破

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：气管的损伤及缺损在临床上较为常见，临床上难以行气管的端端吻合，需要植入人工气管或组织工程化气管进行修补缺损及完善其功能。植入后组织工程化气管的再血管化、免疫排斥、感染、纤维瘢痕形成及功能恢复情况是目前的研究重点。
目的：认识分析近年来国内外组织工程化气管构建过程中种子细胞、支架材料、软骨生成及血管化的研究进展及影响组织工程化气管生长的因素。
方法：第一作者应用计算机检索2000年1月至2014年4月PubMed数据库、中国知网全文数据库及谷歌学术有关组织工程化气管的文章，以“Tissue engineering，Tracheal reconstruction，Trachea substitute，Scaffold revascularization，Seed cells，Transforming growth factor”为英文检索词，“组织工程，气管重建，气管替代物支架材料，再血管化，种子细胞，转化生长因子”为中文检索词。共检索到140余篇相关文献，45篇符合纳入标准。
结果与结论：组织工程化气管是利用机体的活体组织或者种子干细胞在体外支架材料上进行扩增繁殖，植入病损气管，修补原气管缺损，或者在原位进行诱导缺损端的增殖分化，从而修补缺损并能达到一定功能的技术方法。组织工程化气管的主要影响因素包括种子干细胞、气管支架材料、软骨生成和促进组织工程化气管再生的血管因素及相关生长因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 气管重建, 气管替代物支架材料, 再血管化, 种子细胞, 转化生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Tracheal damage and defects are commonly seen in clinical practice. It is difficult to performed tracheal anastomosis, which requires implantation of tissue-engineered trachea or artificial trachea to repair defects and improve its function. After implantation of tissue engineered trachea, the revascularization, immune rejection, infection, fibrous scar formation and rehabilitation function have been widely concerned.
OBJECTIVE: To review the progress of tissue engineered trachea seed cells, scaffolds, chondroplasia and vascularization, as well as the factors affecting the growth of tissue engineered trachea.
METHODS: First author searched PubMed database, CNKI and Google Scholars from January 2000 to April 2014, by using search terms of “Tissue engineering, Tracheal reconstruction, Trachea substitute, Scaffold revascularization, Seed cells, Transforming growth factor” in English and Chinese. A total of 140 articles relevant to tissue engineered trachea were screened, and 45 papers of them met the inclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: Tissue engineered trachea depends on the body’s living tissue or stem cells, which amplify and prolfierate on in vitro seed scaffolds, it is a technical method that repairs primary tracheal defects or in situ value-added end of the differentiation-inducing defects, thereby repairing the defect and achieve certain functions. The main factor of tissue engineered trachea is seed stem cells, tracheal scaffold, cartilage formation, vascular factors and growth factors that promote the regeneration of tissue engineered trachea.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: tissue engineering, trachea, stents, neovascularization, pathologic, transforming growth factor

中图分类号:

R318

孙延奇，马建群，徐海. 组织工程化气管研究：软骨及血供障碍的突破[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(24): 3894-3899.

Sun Yan-qi, Ma Jian-qun, Xu Hai . Progress in tissue-engineered trachea: breakthrough in cartilage and blood supply disorders[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(24): 3894-3899.

图/表（结果） 1

2.1 种子细胞 种子细胞可来源于自体、同种异体和异种组织^[6]。气管组织工程支架材料通过适当的生物发生反应器，与培养的自体填充呼吸道上皮细胞和骨髓间充质干细胞衍生的软骨细胞，成功地替代患病主支气管^[7]。

2.1.1 永生化人支气管上皮细胞 人支气管上皮细胞接种于胶原蛋白凝胶，该凝胶能够聚集肺成纤维祖细胞成三维结构。组织最初是浸没培养，然后升至气/液界面28 d培养。正常气管是由纤毛细胞、能够生成细胞黏蛋白的杯状细胞和基底上皮细胞组成。电子显微镜扫描能够直接发现纤毛细胞，组织学显示黏液生成细胞的存在，免疫组织化学抗p63和角蛋白14证实基底细胞的存在。这些结果表明，永生化人支气管上皮细胞保留分化的能力必须存在3种类型的物质：基质、黏蛋白产生、纤毛柱状上皮细胞^[8]。

2.1.2 间充质干细胞 间充质干细胞具有很强的增殖分化潜能^[9-11]。间充质干细胞在诱导条件下能够分化为软骨细胞。Go等^[12]通过猪组织工程化气管实验证实了2个间充质干细胞来源的软骨细胞和上皮细胞的拟合必要性，以获得功能性和适当的长段气管移植的临床效果。这些发现和组织工程的应用方法将有助于推进人类受试者气管重建。

2.1.3 胚胎干细胞 胚胎在囊胚期前的发育阶段，胚泡的内细胞团和桑椹胚中部分细胞具有分化成各种组织器官的潜能，这部分细胞被称为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有独特的高度未分化特性以及发育全能性，进一步形成全身各种组织器官的能力，得到组织工程研究学者的极大关注。

2.1.4 脂肪干细胞 近年来，脂肪干细胞是有应用价值的种子细胞，众多研究者将注意力集中于脂肪干细胞的应用研究领域^[13-14]。目前研究已经证实，脂肪干细胞不仅可以向不同胚层来源的组织细胞分化，而且将这些细胞与合适的支架材料符合后，可以再体内构建不同的组织结构，包括骨、软骨、脂肪、心肌及血管组织^[15]。为组织器官的缺损修复功能再建提供了良好的种子细胞。研究表明，脂肪干细胞在软骨诱导剂(转化生长因子β、地塞米松、胰岛素)中培养一段时间后，可以向软骨细胞分化^[16]。

2.2 支架材料与软骨生成 对于气管组织工程来说，气管支架的生物化学、力学及结构特性具有非常重要的作用。引入合适的支架材料能够促进细胞沿着软骨方向分化并形成组织，从而有利于修复。理想情况下，构建体必须具有足够的刚性和柔韧性，长期通畅，并且是生物相容的，这因此需要在蜂窝和支架组件的优化的组织工程化气管^[17-18]。目前国际上应用于软骨组织工程研究的主要支架材料是聚酯类材料，以聚乳酸、聚乙醇酸以及两者的共聚物为主。但近年来的研究发现，这些材料仍存在生物相容性较差以及体内植入后酸性产物蓄积的现象，因此寻找其他新型细胞支架材料目前已经成为软骨组织工程研究的热点之一^[19]。Shin等^[20]报道同种异体软骨细胞的与猪软骨源性支架进行修补气管缺损，结果证实使用猪软骨源性支架与培养同种异体软骨细胞重建气管后恢复原形状和功能，没有任何排斥反应，支气管镜检查重建气管的任何溃烂或堵塞和缺陷完全覆盖再生呼吸道上皮。CT显示出气管良好的管腔轮廓。术后组织学数据表明，软骨细胞植入后产生较小的炎症反应和肉芽组织。

组织工程支架材料一般分为二为支架和三维支架，组织工程气管具有气管样的三维立体多孔结构，可以容纳细胞、细胞产物和细胞外基质，不会发生管壁塌陷及管体变形，并能保持一定的韧性，保证气管管状结构的通气功能。支架材料的形态和功能直接影响其所构成的组织形态和功能。

2.2.1 可降解高分子材料 主要为聚乳酸、聚羟基乙酸以及它们的聚合物聚乳酸羟基乙酸^[21-22]。虽然可生物降解的三维支架材料如聚羟基乙酸纤维和聚乳酸纤维已被用于最各类工程气管软骨，但它们没有维持软骨的足够大小和支持气管形状的功能^[23]。Sato等^[24]报道在犬的动物模型上，应用胶原蛋白表面覆有聚合物，聚(L-乳酸-共ε-己内酯)，结构显示，表面完全覆盖着复层纤毛柱状上皮或鳞状上皮无纤毛上皮细胞。从而证实了生物降解的聚合物涂层保护的胶原层，并促进更好上皮化：①支撑架材料的弹性及吸附性。组织工程支架都要求具有良好的生物相容性并能为组织体发展提供足够空间，其中支撑架材料的弹性及吸附性尤为重要，若支撑架材料与正常肺组织弹性存在明显差异将限制其正常生长，这与特发性肺纤维化或肉瘤样病患者瘢痕组织形成所致限制性肺疾病相类似。②支撑架多孔性^[25]。所选材料应具有几何学上相互连接的微孔以促进组织吸收营养排出废物。③支撑架也必须提供足够的细胞表面积，以便于细胞播种、支撑架内细胞运动及随后的细胞吸附，同时有利于三维空间内细胞相互作用并促进细胞间信号传导。④肺组织结构的复杂性要求发展由多种材料构成的复合型支撑架^[26]。

2.2.2 硅胶支架及胶原支架 组织工程化气管应用困难主要体现在：要涉及到气道狭窄(所造成的过度生长肉芽组织)，气道塌陷(造成软骨软化)和黏液嵌塞(主要是由缺乏上皮引起的)。Luo等^[27]报道采用硅胶支架在体外预培养和在体内植入能够成功地再生管状软骨的气管，有效的抑制肉芽增生，防止气道狭窄，从而极大地提高了生存率。最重要的是，通过肌肉内植入并移植带蒂肌皮瓣，建立血液供应稳定组织工程化气管移植，这保证维护管状软骨的结构和功能，组织工程化气管加速上皮移植和节段性缺损气管，从而实现长期功能重建。

2.2.3 葡聚糖凝胶及糖胺多糖 耳廓软骨中含有较多的葡萄糖胺聚糖和胶原，Whitney等^[28]研究表明成熟扩增的耳廓软骨细胞能够长入微细钽孔中制备大型支架材料，因此耳廓软骨细胞衍生的在支架结构能够用于创建工程化气管模型。在兔动物模型上使用NVR-7薄膜的和硫酸葡聚糖凝胶衍生的共聚物构建的组织工程化气管修复气管缺损段，这种新薄膜的独特特点是生物相容性、生物可降解性、弹性和易于存储性^[29]。Hong等^[30]移植自体软骨细胞种植于纤维蛋白-透明质酸糖胺多糖形成的凝胶支架材料修补兔气管缺损，术后结果显示，植入支架完全覆盖着黏膜再生，并且无管腔狭窄。组织学上表现为移植物虽呈炎性反应的迹象，但表面覆着纤毛上皮，从而有利于气管功能的实现。

2.2.4 复合支架 不同种类的天然可降解高分子材料之间的复合，主要是为了从组分上尽可能的获得与细胞外基质相类似的组织工程支架。采用胶原-壳聚糖，壳聚糖-明胶、胶原-透明质酸等复合材料构建组织工程支架的研究已有报道。Komura等^[31]探讨了在兔模型上种植自体软骨细胞于组织工程化气管可行性。自体软骨细胞种植到由胶原片、聚乙醇酸网和共聚物(L-丙交酯/ε-己内酯)组成的复合网格。该组织工程化复合物植入到颈段气管0.5 cm× 0.8 cm的缺损得以修复。

2.2.5 明胶海绵结合β-磷酸三钙 气管上皮再生是指气管管腔上皮细胞的增殖迁移，并且在支架的内部管腔有胶原蛋白附着。纤维化和软骨之间肉芽组织的再生是不利气管上皮再生的主要因素。组织工程化气管需要形成管腔结构，防止塌陷。Komura等^[32]采用透明软骨细胞和耳廓产生的软骨细细胞种植于明胶海绵和β-磷酸三钙再造组织工程化气管。磷酸三钙具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性, 是理想的人体硬组织修复和替代材料。β-磷酸三钙材料上软骨细胞能够正常生长，分化和繁殖。

2.2.6 纳米复合材料支架 纳米复合支架材料能够诱导细胞的再生及干细胞的分化，加强特定的生物活性剂和生长因子的利用。纳米技术应用到组织工程中产生的材料具有以下性能：①符合生物安全性。②良好的体内生物相容性和生物细胞有良好的相容性。③材料降解的科控性。④材料对组织的再生有良好的诱导性^[33]。可见纳米技术在组织工程和未来性能更加优良的人工气管的制作拥有非常广泛的应用前景。

2.3 再血管化、血供及调节因子

2.3.1 促红细胞生成素及血管再生 促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成，能够增加组织工程化气管的血液供应，促进其血管化^[34]。促红细胞生成素可以提高组织内细胞的存活率。在许多体外和体内试验研究表明，成纤维细胞合成的细胞外基质分子对增殖内皮细胞生成血管非常重要。纤维连接蛋白、血小板凝血酶敏感蛋白、透明质酸和层黏连蛋白对细胞迁移、正常内皮细胞形成以及这些分子的内皮细胞表达受体有重要作用。

2.3.2 带蒂大网膜瓣 气管不具有单独的供血动脉及引流静脉，其血供来源与甲状腺和食管周围组织的毛细血管网。上半部分气管的血液供应来源与甲状腺下动脉和食管动脉分支，气管隆突和下半部分的气管血供来源于支气管动脉。为了促进组织工程气管的再血管化，应用带蒂大网膜瓣帮助移植物进行血运重建^[35]。观察发现血流迅速恢复和管腔黏膜出现，从而证实附着种子上皮细胞和软骨细胞的生物假体植入前，带蒂大网膜瓣已经引起早期血运重建的可能性。

2.3.3 转化生长因子 转化生长因子是指两类多肽类生长因子, 转化生长因子α和转化生长因子β。转化生长因子α是由巨噬细胞，脑细胞和表皮细胞产生，可诱导上皮发育。人类转化生长因子β有3个亚型，转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3。转化生长因子β是一个多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能^[36]。多肽类生长因子是强有力的细胞行为调节剂，可调节细胞的增殖、迁移、分化及蛋白质表达。并且在组织再生中有治疗作用。常用的生长因子有成纤维生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍化生长因子等。这些因子对组织器官正常功能的维持起着至关重要的作用。三维模型中，生长因子能够影响细胞与细胞基质和细胞与细胞相互作用。成纤维细胞生长因子能够Ⅲ型和Ⅳ型胶原主要集中在附近上皮和下降远离上皮。转化生长因子β1能够使上皮发挥促纤维化介质的作用，导致基质重塑^[37]。

Kojima等^[38]报道转化生长因子转化生长因子β1、转化生长因子β2和转化生长因子β3具有诱导软骨细胞分化的软骨细胞和间充质干能力细胞；然而，不具有相等的效果。转化生长因子β2和转化生长因子β3比转化生长因子β1更能促进软骨形成，导致了多于2倍糖胺聚糖积累和Ⅱ型胶原的沉积。将生长因子直接加入到损伤的组织促进细胞分化及增殖是最简单的方法，然而直接将生长因子注入是无效的，因为在1 d之内，生长因子将被很快的弥散及降解，目前已经开发了多种生长因子可控释系统，能够解决此问题。

2.3.4 前列腺素 前列腺素在体内由花生四烯酸所合成，结构为一个5环和两条侧链构成的20碳不饱和脂肪酸。前列腺素在组织工程化气管中的主要作用是: 细胞黏附、迁移、增殖和细胞外基质组装。因此，前列腺素和聚糖在调节细胞外基质中发挥着重要的调节作用。

Hinderer等^[39]报道当形成脱细胞基质，消耗细胞结合的前列腺素和聚糖。前列腺素和聚糖的损失对细胞外基质的结构和完整性有重要影响，这最终影响到植入物的性能和耐用性。

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引言

气管是呼吸器官的最为重要部分，主要由14-16个“C”字半环状软骨构成，在组织学上由软骨环、平滑肌和气管柱状上皮构成，气管环后方缺口处由平滑肌和致密结缔组织连接。气管的良性或恶性肿瘤、气管的创伤，气管的医源性损伤及手术并发症等都可引起气管组织的损伤，甚至大面积缺损。如果损伤的气管在成人气管中超过气管总长度的约一半(6 cm)或在儿童气管中超过总长度的1/3，临床上难以行气管的端端吻合。长段气管狭窄往往需要手术治疗。采用气管假体进行移植，但是由于免疫排斥反应，移植物缺血或再狭窄导致失败。2008年首次利用患者自身的干细胞形成的组织工程气管已成功地移植到1例气道损坏的女性患者体内^[1]，内部接种于上皮细胞，外部接种于间充质干细胞在软骨细胞的表面上。在移植后第4天细胞学分析表明，干细胞来源的软骨细胞从外到内表面的迁移^[2]。2013年报道该例组织工程化气管移植后的5年随访结果。移植后5年结果证实了组织工程化气管移植，包括人类气管脱细胞技术、自体上皮细胞及干细胞培养和分化技术、细胞支架播种技术等组织工程技术是一类安全、且有前途的新技术。虽然组织工程气管尚未达到正常气管的所有功能，但是能够修补因创伤、肿瘤、炎症等引起的气管缺损^[3]。

由于软骨缺乏再生能力，病损后难以自身修复，必须利用其他组织或替代材料进行修复与重建。在近20年中，组织工程领域已旨在恢复或更换损坏或丢失组织和器官。组织工程化气管需要对于结构，机械和功能的组织。气管的良性或恶性病变往往需要广泛的气管重建。用于气管置换方式已经被报道，包括使用自体的组织、自体移植、同种异体移植物、假体材料或这些方法的组合^[4]。但是这些方法中，往往会出现气管狭窄、纤维化、细菌感染及免疫排斥、材料失效，导致气管替代物进行移植失败。通过组织工程化技术，已经完成了诸如耳和鼻软骨组织的重建，但是对于气管软骨的重建的研究较少。

人工气管假体的功能不能代替原来的气管，主要是吻合口出肉芽组织增生及纤维再生。国内外许多专家曾经使用自体组织再造气管，使用的材料包括肌皮瓣、心包、食管、肠管和肋软骨及主动脉等^[5]。但是术后替代物的软化、肉芽组织的生长、狭窄等问题院没有得到解决，期方法有待于进一步改进。关于同种异体气管移植方面的研究，国内外也有大量的相关文献的报道。但是由于供应气管的血管纤细且呈阶段性分布，故在气管移植时无法通过显微外科技术直接进行血管吻合来完成移植物再血管化，其血供变得十分困难。气管移植也多因血供不足或严重缺血而终将失败，并且存在严重的免疫排斥反应。文章对近年来国内外组织工程化气管的发展作一综述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

讨论

组织工程气管已经应用于临床，以修复气管或喉的破损段。空腔脏器上只有有效的黏膜蔓延生长才能增加了气管的功能。但是，组织工程化气管黏膜的再生是缓慢和不理想的，从而显著限制功能的恢复^[40]。生物发生反应器的应用能够加速组织工程化气管支架材料的再生，促进黏膜上皮细胞与支架材料的充分融合，利于组织工程气管的生长。Walles等^[41]报道软骨细胞接种于聚(ε-己内酯)Ⅱ型胶原支架，在生物反应器的应用下细胞增殖增加。

诸如肌肉骨骼结构，膀胱上皮结构等异种细胞外基质支架已开始研究并应用于恢复各种组织缺损^[42]。软骨目前已成为细胞外基质支架的来源，有广阔的应用前景。猪关节软骨获得的支架有较多的优点：①生物相容性。②易于应用和控制的降解率。③猪源性组织气管支架材料具有软骨细胞多孔结构。目前已经证实在体外采用脱细胞基质制作组织工程化气管支架的的适用性，并且在体内脱细胞气管基质支架没有引起显著移植排斥反应或体内的异物反应，支持表皮细胞再生，实现完整的上皮细胞覆盖，并保留管腔通畅。但是目前无法静态下种植干细胞于支架上^[43]。

组织工程化气管移植到体内能否长期具有活性、能否发挥正常的生理功能等还需要进一步的实验验证。在气管组织工程临床试验体现在功能上皮细胞及组织替代原结构。体内的上皮细胞内皮层迁移，多元型分化，功能上皮相关的间充质细胞的上皮细胞的相互作用，是组织工程化气管上皮细胞解决的关键所在^[44]。组织工程化血管自行再生及移植后免疫排斥，及上皮细胞被肉芽组织覆盖依旧成为组织工程化气管的难题。近年来，随着生物力学的进展及血管再造技术的发展，组织工程化气管正进一步完善。必须清醒的认识到组织工程化气管依然面临着很多难题，包括植入后的再血管化问题、免疫排斥反应及植入后的气管纤维化的问题，尤其是生物力学性能的恢复^[45]，并且气管植入后功能的恢复急需解决。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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