家蚕茧丝胶存在于茧丝条的表面,随着一粒蚕茧由外到内从茧衣到茧层、蛹衣,其在茧衣丝条中含量最高,茧层丝条含量较低,而蛹衣中基本不含丝胶。从蚕吐丝结茧状况来看,熟蚕最初吐出的均为从其中部丝腺分泌的丝胶和少量后部丝腺分泌的丝素,其生理学意义为构建结茧场所。然后才有后部丝腺分泌的丝素推进至中部丝腺,被中部丝腺分泌的丝胶包裹,吐丝形成茧层,生理学意义为保护化蛹和蛹体抵御自然恶劣环境。由于其生理意义的不同,茧衣和茧层丝胶的蛋白质分子构象有可能有所不同,故对从茧衣和茧层中得到的丝胶进行了构象比较。制备提取方法采用了最常用提取法,即乙醚浸泡除蜡、无水乙醇除杂、水煮提胶法。为了研究在相同提取条件下丝胶构象的变化情况,对茧壳进行了同环境的3次再现性试验,对得到的丝胶性状进行了氨基酸组成、溶解性、红外光谱分析。并对其在被酶解成为小分子时的构象变化进行研究以解明其变化,因为小分子蛋白质是更为优秀的生物材料
[8]。
首先进行了氨基酸组成分析。在采用常用的乙醚浸泡除蜡、无水乙醇除杂、水煮提胶方法提取得到的丝胶蛋白质Jk1、Jk2、Jk3的氨基酸分析结果中,其蛋白质肽段中带极性侧链经常出现在β转角的丝氨酸、天冬氨酸占氨基酸含量的40%以上,另外还有占氨基酸总量8%的影响规则二级结构形成的甘氨酸,这些氨基酸致使丝胶蛋白质呈现为β转角类的部分规则二级结构,其特点在于具有规则二级结构的刚性和肽段中各残基间更大自由度的柔性[1]。β转角中含有的大量极性残基使得大多数β转角存在于分子表面,使得β转角附近具有比整个分子更大的亲水性,作为一种球状蛋白质,这些亲水性残基的肽段位于其表面,疏水性残基由于折叠被裹于球体内部,是丝胶蛋白质行使功能所必需。由于其亲水性基团易于与其它物质结合,对于其作为药用生物材料应用时有利。
部分文献资料曾提示丝胶的甘氨酸含量为15%左右、丝氨酸约有35%、苏氨酸9%、甲硫氨酸0.05%[9],而本文再生丝胶蛋白Jk1、Jk2、Jk3样本的氨基酸分析结果显示其分别为8%、28%、6%和0.3%,即带极性侧链的丝氨酸、苏氨酸含量有所降低,影响规则二级结构形成的甘氨酸降低,而形成二硫键的甲硫氨酸含量增加,从某种程度上将增大该丝胶蛋白质的规则性分子构象。这可以归结为是采用了下、次茧的缘故。下、次茧在使用时经过了反复的洗涤和有机溶剂、无机盐的深度处理,表层带极性侧链的易溶性氨基酸部分被溶解除去,导致了含量百分比发生了变化,从而使其分子构象变化。与文献[9]的比较结果,说明在采用下、次茧提取丝胶时,和上茧提取的丝胶相比,由于处理手段的不同而致其氨基酸组成有所不同,则其在作为生物材料使用时,下次茧和上茧丝胶的混用将出现性状性能不易控制的问题。用中性蛋白酶酶解制备的小分子量的丝胶蛋白肽Jkmj5的氨基酸组成比例,与大分子量Jk1的组成比例相近,仅丝氨酸比例略减小、谷氨酸含量增大,也呈现为β转角类的部分规则二级结构、“无规”卷曲略有增加。但从茧衣中提取制备的Jy4的氨基酸组成和比例中,天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸含量相比茧壳丝胶有降低,拥有带电残基的谷氨酸、赖氨酸比例大幅提高,表明其二级结构中的转角结构和“无规”卷曲增加。
蛋白质水溶性是与其氨基酸组成,分子结构与构象,变性程度等相关的。同批次茧壳原料在同等制备条件下制取的丝胶蛋白溶解率一致,说明同样的制备条件,能得到氨基酸组成,分子结构与构象,变性程度大致相仿的蛋白质材料。而从茧衣中提取出的丝胶Jy4的溶解率是Jk1、Jk2、Jk3的近2倍,这与其二级结构中的转角结构和“无规”卷曲增加结果一致。而低分子蛋白肽Jkmj5的溶解率是原来丝胶Jk1的4倍多,这并不是构象变化导致,而是其分子量降低的结果。
比较同样茧壳原料在同等制备条件下制取的丝胶蛋白的红外光谱谱图,其谱图的一致性,可以推测在同等条件下能得到分子构象相同的丝胶蛋白质,根据结构与性能的关系,在作为生物材料使用时,同批次条件下制取的丝胶蛋白原料,在某种意义上可以推测其生物学性能一致。从茧壳中提取的丝胶蛋白质,其酰胺Ⅰ为1 655 cm-1,被指认为标准α-螺旋,谱图中没有发现1 666 cm-1以上的转角吸收峰和1 642 cm-1以下的β-折叠和侧链伸展结构,由于蛋白质分子结构中的无序结构构象对应的酰胺Ⅰ在 1 651 cm-1,该子峰的固有宽度大于仪器分辨率,所以在图1所示谱图显示出该丝胶蛋白质可能具有无序结构构象。谢瑞娟等[10]在采用石油醚处理茧壳,再用水煮提取丝胶的工艺后得到的红外谱图吸收峰,与本实验得到的数据不同。其研究中采用了乙醚、乙醇处理后再用水煮提取的工艺,和本实验方法不一致,从另一个角度也说明了不同原料、不同提取制备工艺下得到的丝胶蛋白构象有一定差异。
茧衣丝胶蛋白红外光谱谱图中观察到了酰胺Ⅰ、酰胺Ⅲ峰值未变而酰胺Ⅱ特征谱向高波数方向的移动。这个现象说明了茧衣丝胶与茧壳丝胶相比,其分子构象更多的以“无规”卷曲结构为主。
从茧壳酶解为小分子丝胶蛋白的红外光谱谱图来看,茧壳丝胶在经过中性蛋白酶水解后,其分子构象发生了α螺旋向转角结构、无规卷曲结构的转换。这个结论对其可作为溶解性凝胶组织工程材料应用打下了理论基础。
结论:①研究采用了相对固定的提取方法和条件从茧壳提取丝胶,其相对分子质量、氨基酸组成及含量、蛋白质分子构象基本一致,溶解性能相似。②提取丝胶原料分别为茧壳和茧衣时,其丝胶的相对分子质量分布范围、氨基酸组成及含量均有差异。从茧壳中提取出的丝胶相对分子质量主要分布在66 200~130 000之间,而茧衣中提取出的丝胶相对分子质量主要分布在43 000~
130 000范围内;茧衣丝胶粉与茧壳丝胶粉相比其氨基酸中的天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸的含量有所降低,谷氨酸、赖氨酸大幅增加。红外光谱图显示茧衣丝胶比茧壳丝胶更多的以“无规”卷曲结构为主,茧衣丝胶的溶解率几乎为茧壳丝胶溶解率的2倍。③采用中性蛋白酶酶解茧壳丝胶得到的小分子蛋白肽的氨基酸组成比例,与大分子量Jk1的组成比例相近,仅丝氨酸比例略减小、谷氨酸含量增大,按照其红外光谱数据,小分子蛋白肽为转角结构和“无规”卷曲结构。