3D打印新补骨脂异黄酮涂层支架调节成骨/破骨细胞活性促进骨再生

doi:10.12307/2026.409

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (26): 6736-6743.doi: 10.12307/2026.409

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3D打印新补骨脂异黄酮涂层支架调节成骨/破骨细胞活性促进骨再生

皮志龙1，李嘉源1，谭志超2，陆小梅3，张志强3，叶翔凌2

1广州中医药大学研究生院，广东省广州市 510006；2广州中医药大学东莞医院，广东省东莞市 523000；3东莞市第八人民医院，广东省东莞市 523320

接受日期:2025-11-14 出版日期:2026-09-18 发布日期:2026-03-10
通讯作者: 叶翔凌，博士，主治医师，广州中医药大学东莞医院骨科，广东省东莞市 523000
作者简介:皮志龙，男，广西壮族自治区百色市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事骨质疏松和骨组织工程研究。
基金资助:
广东省基础与应用基础研究基金项目(2023A1515110833)，项目负责人：叶翔凌；中国博士后科学基金(2023M740862，2024T170198)，项目负责人：叶翔凌；广东省基础与应用基础研究项目-区域联合基金-地区培育项目(2021B1515140002)，项目负责人：陆小梅；东莞市社会发展科技项目(重点项目)(20231800935402)，项目负责人：谭志超

3D printed neobavaisoflavone-coated scaffolds promote bone regeneration by regulating osteoblast/osteoclast activities

Pi Zhilong1, Li Jiayuan1, Tan Zhichao2, Lu Xiaomei3, Zhang Zhiqiang3, Ye Xiangling2

1Graduate School of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 2Dongguan Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan 523000, Guangdong Province, China; 3Dongguan Eighth People's Hospital, Dongguan 523320, Guangdong Province, China

Accepted:2025-11-14 Online:2026-09-18 Published:2026-03-10
Contact: Ye Xiangling, MD, Attending physician, Dongguan Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan 523000, Guangdong Province, China
About author:Pi Zhilong, MS candidate, Graduate School of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation, No. 2023A1515110833 (to YXL); China Postdoctoral Science Foundation, No. 2023M740862 and No. 2024T170198 (to YXL); Guangdong Province Basic and Applied Funds Basic Research Project-Regional Joint Fund-Regional Cultivation Project, No. 2021B1515140002 (to LXM); Dongguan Social Development Science and Technology Project (Key Project), No. 20231800935402 (to TZC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
新补骨脂异黄酮：是一种从中药“新补骨脂”中提取的活性成分，它具有促进骨形成、抗氧化、调节激素水平、抗肿瘤和调节免疫等多种生物学功能。
破骨细胞：是骨髓中的一类巨核细胞(多核细胞)的后代，主要功能是通过分泌酶类物质来分解骨组织中的无机盐和有机基质，从而参与到骨的吸收和再建过程中。
成骨细胞：是一类参与到骨组织形成和维持的细胞，主要负责合成和沉积骨基质，促进骨骼的生长、修复和维护。

背景：新补骨脂异黄酮可以促进骨形成，可能是应用于骨再生的潜在小分子药物。利用3D打印骨组织工程支架作为新补骨脂异黄酮的药物输送载体，有望提升骨再生的潜在应用。
目的：探索聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮人工骨支架对破骨细胞和成骨细胞活性的影响。
方法：①采用熔融沉积建模技术制作3D打印聚乳酸支架，将聚乳酸支架浸入含或不含新补骨脂异黄酮的多巴胺溶液中，分别得到聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架、聚乳酸/聚多巴胺支架。表征3组支架的表面形貌、表面硬度与抗压强度，表征聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架的药物缓释性能。②将小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1分别与3组支架共培养，通过CCK-8实验及细胞死活染色评估支架的细胞相容性，Transwell实验评估支架对成骨细胞迁移的影响，碱性磷酸酶定量实验与茜素红染色评估支架对成骨细胞分化的影响。将RAW264.7细胞分别与3组支架共培养，破骨诱导分化后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色评估支架对破骨细胞分化的影响。
结果与结论：①扫描电镜下可见3组支架均具有三维结构与规则的互连多孔结构，平均孔径400 µm。聚乳酸/聚多巴胺支架、聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架的表面硬度与压缩强度均高于聚乳酸支架(P < 0.05)。聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架具有良好的药物释放行为，体外可持续释放药物达14 d以上。②CCK-8实验及细胞死活染色显示，3组支架均具有良好的细胞相容性，并且聚乳酸/聚多巴胺支架、聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架可促进MC3T3-E1细胞增殖。Transwell实验显示，相较于聚乳酸支架，聚乳酸/聚多巴胺支架、聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架可促进MC3T3-E1细胞迁移。碱性磷酸酶定量实验与茜素红染色显示，相较于其他两组支架，聚乳酸/聚多巴胺支架、聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架可抑制RAW264.7细胞的破骨分化。③结果表明，聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架具有良好的生物安全性，可通过调节破骨和成骨细胞活性促进骨再生。
https://orcid.org/0009-0002-0189-5419 (皮志龙)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 3D打印支架, 聚乳酸, 聚多巴胺, 新补骨脂异黄酮, 成骨分化, 破骨吸收, 生物材料

Abstract: BACKGROUND: Neobavaisoflavone could promote bone formation and may be a potential small molecule drug for bone regeneration. The use of 3D printed bone tissue engineering scaffolds as drug delivery carriers for neobavaisoflavone is expected to enhance the potential application of bone regeneration.
OBJECTIVE: To explore the effects of polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone bone scaffold on osteoclast and osteoblast activity.
METHODS: (1) Fused deposition modeling technology was used to manufacture a 3D printed polylactic acid scaffold. These polylactic acid scaffolds were immersed in a dopamine solution containing or without neobavaisoflavone to produce polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffolds and polylactic acid/polydopamine scaffolds, respectively. The surface morphology, surface hardness, and compressive strength of the three groups of scaffolds were characterized, and the drug release properties of the polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffolds were investigated. (2) Mouse embryonic osteoblasts MC3T3-E1 were co-cultured with the three groups of scaffolds. The cytocompatibility of the scaffolds was assessed using CCK-8 assay and live-dead cell staining. The effects of the scaffolds on osteoblast migration were evaluated using Transwell assays. The effects of the scaffolds on osteoblast differentiation were assessed using alkaline phosphatase quantification and Alizarin red staining. RAW264.7 cells were co-cultured with the three groups of scaffolds. After osteoclast induction, the effects of the scaffolds on osteoclast differentiation were assessed by tartrate-resistant acid phosphatase staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy revealed that all three groups of scaffolds exhibited a three-dimensional structure with regularly interconnected porous structures, with an average pore size of 400 µm. The surface hardness and compressive strength of the polylactic acid/polydopamine scaffold and the polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffold were significantly higher than those of the polylactic acid scaffold (P < 0.05). The polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffold exhibited excellent drug release, with sustained drug release for over 14 days in vitro. (2) CCK-8 assay and live-dead cell staining demonstrated that all three groups of scaffolds exhibited good cytocompatibility. The polylactic acid/polydopamine scaffold and the polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffold promoted the proliferation of MC3T3-E1 cells. Transwell assay showed that compared with the polylactic acid scaffold, the polylactic acid/polydopamine scaffold and the polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffold promoted MC3T3-E1 cell migration. Alkaline phosphatase quantification assay and Alizarin red staining revealed that the polylactic acid/polydopamine scaffold and the polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffold promoted osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells compared with the other two scaffolds. Tartrate-resistant acid phosphate staining revealed that the polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffold inhibited osteoclast differentiation of RAW264.7 cells. (3) These results demonstrate that the polylactic acid/polydopamine/neobavaisoflavone scaffold has good biosafety and can promote bone regeneration by regulating osteoclast and osteoblast activity.

Key words: 3D printed scaffold, polylactic acid, polydopamine, neobavaisoflavone, osteogenic differentiation, osteoclastic resorption, biomaterial

中图分类号:

皮志龙, 李嘉源, 谭志超, 陆小梅, 张志强, 叶翔凌. 3D打印新补骨脂异黄酮涂层支架调节成骨/破骨细胞活性促进骨再生[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(26): 6736-6743.

Pi Zhilong, Li Jiayuan, Tan Zhichao, Lu Xiaomei, Zhang Zhiqiang, Ye Xiangling. 3D printed neobavaisoflavone-coated scaffolds promote bone regeneration by regulating osteoblast/osteoclast activities[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(26): 6736-6743.

图/表（结果） 9

2.1 支架表面形貌扫描电镜观察结果 3组支架的表面形貌，如图1所示。扫描电镜下可见3组支架均具有三维结构与规则的互连多孔结构，平均孔径400 μm，这有助于促进血管长入、细胞迁移和养分的输送。

2.2 支架力学性能测试结果图2显示了3组支架的力学性能。聚乳酸支架、聚乳酸/聚多巴胺支架与PLA/PDA/NB支架的压缩强度分别为(4.06±0.13)，(4.52±0.23)，(4.55±0.24) MPa，聚乳酸/聚多巴胺支架和PLA/PDA/NB支架的压缩强度大于聚乳酸支架
(P < 0.05)。聚乳酸支架、聚乳酸/聚多巴胺支架与PLA/PDA/NB支架的邵氏硬度分别为(61.17±1.26)，(65.83±2.57)，(66.33±2.08) HD，聚乳酸/聚多巴胺支架和PLA/PDA/NB支架的邵氏硬度大于聚乳酸支架(P < 0.05)。力学测试结果表明，聚乳酸/聚多巴胺支架和PLA/PDA/NB支架的力学性能较聚乳酸支架有一定提升。

2.3 支架的新补骨脂异黄酮释放曲线图3显示了新补骨脂异黄酮从PLA/PDA/NB支架中的释放曲线。在初始阶段(12 h和24 h)，检测到新补骨脂异黄酮快速释放，这主要归因于表面负载的新补骨脂异黄酮更容易释放；随着释放过程的继续，新补骨脂异黄酮的释放速度逐渐下降，表明大部分新补骨脂异黄酮是在14 d内逐渐释放的；至第14天，新补骨脂异黄酮继续从支架中释放，并在整个14 d期间呈现出持续释放的态势。

2.4 CCK-8实验检测支架对MC3T3-E1细胞增殖的影响 CCK-8检测显示，培养1，2 d，3组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养3 d，聚乳酸/聚多巴胺支架组、PLA/PDA/NB支架组细胞增殖吸光度值高于聚乳酸支架组(P < 0.05)，见图4。

2.5 细胞死活染色检测支架对MC3T3-E1细胞活力的影响细胞死活染色显示，培养24，48 h，各组的MC3T3-E1细胞绝大部分为存活状态(活细胞呈绿色荧光点)，仅见极少量死亡细胞(死细胞呈红色荧光点)，并且各组细胞培养48 h后的细胞数量明显多于24 h，见图5，与CCK-8检测结果一致，结果表明各组支架具有良好的细胞相容性。

2.6 Transwell实验检测支架对MC3T3-E1细胞迁移的影响图6A展示了各组MC3T3-E1细胞迁移到小室的结晶紫染色图像，相较于聚乳酸支架组，聚乳酸/聚多巴胺支架组、PLA/PDA/NB支架组中迁移了更多的MC3T3-E1细胞。定量分析结果显示，聚乳酸/
聚多巴胺支架组、PLA/PDA/NB支架组细胞迁移数量与吸光度值均高于聚乳酸支架组(P < 0.01)，见图6B，C。

2.7 茜素红染色评估支架对MC3T3-E1细胞矿化的影响图7A显示了各组MC3T3-E1细胞成骨诱导7d后茜素红染色的代表性图像，与聚乳酸支架组相比，聚乳酸/聚多巴胺支架组、PLA/PDA/NB支架组MC3T3-E1细胞具有更多的钙结节红色染色面积和最多的矿化结节；此外，镜下可见PLA/PDA/NB支架组MC3T3-E1细胞产生大量钙晶体，部分逐渐融合成簇。图7B显示了茜素红染色矿化结节定量分析结果，聚乳酸/聚多巴胺支架组、PLA/PDA/NB支架组矿化结节形成量多于聚乳酸支架组(P < 0.05，P < 0.01)，PLA/PDA/NB支架组矿化结节形成量多于聚乳酸/聚多巴胺支架组(P < 0.05)。以上结果表明，PLA/PDA/NB支架有助于促进成骨细胞矿化结节的产生。

2.8 碱性磷酸酶活性检测分析支架对MC3T3-E1细胞早期成骨分化的影响如图8所示，成骨诱导7 d后，聚乳酸/聚多巴胺支架组、PLA/PDA/NB支架组碱性磷酸酶活性高于聚乳酸支架组(P < 0.05，P < 0.01)，PLA/PDA/NB支架组碱性磷酸酶活性高于聚乳酸/聚多巴胺支架组(P < 0.05)。

2.9 抗酒石酸酸性磷酸酶染色评估支架对RAW264.7细胞破骨分化的影响破骨诱导培养5 d后的抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，对照组多个RAW264.7细胞融合形成了具有多核的巨大破骨细胞，这些巨噬细胞在经过抗酒石酸酸性磷酸酶染色后呈红色，说明诱导成功；同时聚乳酸支架组和聚乳酸/聚多巴胺支架组RAW264.7细胞同样融合形成了具有多核的巨大破骨细胞，这说明聚乳酸支架和聚乳酸/聚多巴胺支架并没有抑制破骨细胞骨吸收的能力；PLA/PDA/NB支架组破骨细胞细胞融合显著少于其他3组，多核抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞数量明显减少，见图9A。图9B显示了抗酒石酸酸性磷酸酶活性定量分析结果，PLA/PDA/NB支架组抗酒石酸酸性磷酸酶活性低于其他3组(P < 0.01)。结果表明，PLA/PDA/NB支架具有较强抑制破骨细胞骨吸收的效果。

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引言

骨移植作为一种传统而有效的骨缺损修复方法，已经在临床实践中取得了显著成功，然而随着骨移植的广泛应用，一些问题如供体不足、手术并发症和移植物排异等问题逐渐凸显，这促使了对骨移植材料的研究和创新[1-3]。近年来随着人口老龄化和骨相关疾病的不断增加，对于骨生物材料的需求变得愈加迫切。骨组织工程和骨修复领域的快速发展，使得寻找新的、可持续的骨生物材料成为一个备受关注的研究方向[4-6]。
近年来，3D打印技术的迅猛发展为骨移植领域引入了一场革命。传统的骨移植材料往往面临着供体稀缺、形态学不匹配以及植入后的生物相容性问题[7]。随着3D打印技术的不断创新，全新的骨移植材料设计和制备方法为解决传统问题提供了新的思路。3D打印技术的优势在于其高度个性化的制造能力，通过精确控制打印参数使得骨支架能够更好地适应患者的解剖形态，提高了骨移植材料与周围组织的适应性[8]；此外，3D打印还为设计复杂结构的骨移植材料提供了机会，如模拟天然骨的多孔结构，这对于促进细胞黏附和血管生成具有积极的影响[9-10]。
尽管3D打印骨支架在骨缺损修复和骨重建方面展现出许多潜力，但是骨愈合是一个复杂而全面的过程，不仅需要考虑到骨生成，还需要考虑到破骨细胞生成，破骨细胞相关的骨吸收可能是导致骨修复效果不理想的关键因素。最近越来越多的研究证实，破骨细胞在骨形成、维持和重塑中发挥着不可或缺的作用[11-13]。在骨矿化过程中，没有破骨细胞活性的成骨可能会抑制骨重塑，从而损害骨修复的自然机制，增加不必要的骨过度生长和骨硬化风险[14]。
新补骨脂异黄酮是从中药补骨脂Psoralea corylifolial L.中提取分离获得的黄酮类化合物[15]。研究表明新补骨脂异黄酮具有多种药理活性，主要包括抗菌、抗炎、抗癌、促成骨和抗骨质疏松等[16-18]。近年研究发现，新补骨脂异黄酮具有独特的骨代谢双向调节作用：一方面，通过上调Runx2、Osterix等成骨标志物表达促进间充质干细胞向成骨分化[19]；另一方面，通过抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的活化T细胞核因子核转位阻断破骨细胞分化[20]，这种“促生成-抑吸收”的双重作用机制使它在骨缺损修复领域备受关注。在骨再生药物开发中，双膦酸盐类药物(如阿仑膦酸钠)虽能有效抑制破骨细胞活性，但存在下颌骨坏死、非典型股骨骨折等严重不良反应[21-22]。骨形态发生蛋白2虽具有较强的促成骨作用，但它的临床应用受限于异位骨化风险、高成本及超生理剂量需求[23-24]。与传统药物相比，新补骨脂异黄酮不仅具有抑制破骨细胞分化的特性，还可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化[25]，同时分子质量小、亲脂性高的理化特性[26]，使新补骨脂异黄酮更适合作为缓释药物负载于三维多孔支架中。研究证实，新补骨脂异黄酮在局部递送系统中的应用可显著提高其生物利用度，例如，CHEN等[27]使用海绵状金属有机(磷酸镁)配位的壳聚糖改性可注射水凝胶有效创建了抗骨折水凝胶系统，该水凝胶负载新补骨脂异黄酮后可显著增加临界颅骨缺损内的新骨生长。研究提示将新补骨脂异黄酮与具有精确孔道结构的3D打印支架结合，既能实现药物局部缓释降低系统毒性，又能通过仿生骨小梁结构提供细胞生长所需的力学刺激。
然而，由于3D打印支架多孔结构的存在，新补骨脂异黄酮难以均匀地固定在支架表面，受贻贝黏附的启发，具有与贻贝分泌蛋白相似分子结构的聚多巴胺或许能解决这一难题[28]。聚多巴胺可以吸附在几乎所有固体物质的表面并形成聚多巴胺涂层[29]；此外，吸附在材料表面的聚多巴胺可以作为一个反应“桥梁”，通过迈克尔加成或希夫碱反应在材料表面吸入蛋白质、肝素、聚合物和生物大分子等[30-33]。为了开发具有适当微观结构、生物相容性、调节成骨和破骨活性的骨组织工程支架，此次研究使用熔融沉积成型制备了3D打印聚乳酸支架，在其表面沉积聚多巴胺涂层，并利用聚多巴胺螯合具有生物活性的新补骨脂异黄酮，表征该复合支架的体外生物安全性以及对成骨及破骨活性的作用，以期为修复骨缺损提供有前景的骨组织替代品。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计支架的制备、表征和体外细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2023年7月至2024年12月在广州中医药大学东莞医院完成。
1.3 材料聚乳酸(济南岱罡生物工程有限公司，中国)；新补骨脂异黄酮标准品(> 99%，麦克林公司，中国)；盐酸多巴胺(麦克林公司，中国)；小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1、RAW264.7细胞(Cyagen Biosciences公司，美国)；胎牛血清(Vivacell公司，中国)；MEM-α培养基(Vivacell公司，中国)；PBS(四和生物公司，中国)；胰酶(Vivacell公司，中国)；CCK-8试剂盒(Superline公司，中国)；活细胞/死细胞双染试剂盒(贝博生物公司，中国)；成骨诱导培养基(中桥新舟公司，中国)；茜素红染色液(Solarbio公司，中国)；碱性磷酸酶检测试剂盒(Beyotime公司，中国)；BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific公司，美国)；结晶紫(普西唐公司，中国)；小鼠可溶性核因子κB受体活化因子配体(PeproTech公司，中国)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液染色试剂盒(Sigma公司，美国)；熔融沉积3D打印机(Prusa i3，中国)；倒置荧光显微镜(DMI4000B，Leica公司，德国)；台式离心机(KUBOTA公司，日本)；多动能酶标仪(Thermo Scientific公司，美国)；扫描电子显微镜SEM(QUANTA 200，FEI公司，美国)；万能力学试验机(AGS-X-50N，Shimadzu公司，日本)；细胞培养小室(Labselect公司，中国)；邵氏硬度测试仪(lx-a，上海川陆)；高效液相色谱系统(1260 Infinity Ⅲ，安捷伦，USA)。
1.4 实验方法
1.4.1 制备聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架
制备聚乳酸支架：将聚乳酸原材料置于真空烘箱中充分干燥，将干燥的聚乳酸加入双螺杆挤出机得到聚乳酸颗粒，将聚乳酸颗粒通过切割机进行切割，使用微注射成型机将聚乳酸颗粒挤压成直径为1.75 mm的标准3D打印丝。使用SolidWorks(Dassault Systemes S.A，法国)软件创建支架的三维模型，将设计好的三维模型导入到支持熔融沉积建模打印的切片软件中，其中支架直径为10 mm、高度为5 mm，所使用的3D打印丝直径为400 μm、丝间距为400 μm，喷嘴尺寸为0.4 mm，层高0.32 mm，填充图案为直线，打印速度为30 mm/s，首层打印速度为25 mm/s。设置完打印参数后，打开3D打印机并等待热床和喷嘴预热到聚乳酸的适当温度(喷头温度200 ℃，热床温度50 ℃)，将设计好的支架模型发送到3D打印机开始打印。在打印过程中，机器逐层堆积熔化聚乳酸并形成支架结构。待支架打印完成后，使用PBS清洗后备用。
制备聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架：使用100 mL
的Tris-HCl缓冲液(10 mmol/L，pH=8.5)溶解500 mg多巴胺，制备多巴胺溶液。根据以往文献报道，新补骨脂异黄酮在浓度为8 μmol/L (2.5 μg/mL)的生物活性最好[17]。将新补骨脂异黄酮添加到多巴胺溶液中，使其终质量浓度为2.5 µg/mL。将3D打印聚乳酸支架浸入含2.5 µg/mL新补骨脂异黄酮的聚多巴胺溶液中，在37 ℃环境下避光反应24 h，用dd H2O反复清洗支架，得到聚乳酸/聚多巴胺/新补骨脂异黄酮支架(记为PLA/PDA/NB支架)。
制备聚乳酸/聚多巴胺支架：使用不含新补骨脂异黄酮的多巴胺溶液，按照制备PLA/PDA/NB支架的流程，同理制备聚乳酸/聚多巴胺支架。
1.4.2 支架表面形貌分析取聚乳酸支架、聚乳酸/聚多巴胺支架与PLA/PDA/NB支架，进行真空干燥、喷金处理后放置在扫描电镜样品台上，使用控制面板选择扫描区域并开始扫描，利用扫描电镜观察支架表面的微观结构和形貌。
1.4.3 支架力学性能测试根据GB/T 1041-2008标准，采用万能力学试验机测定聚乳酸支架、聚乳酸/聚多巴胺支架与PLA/PDA/NB支架的抗压强度，加载速度为1 mm/min。根据GB/T 531-1999标准，采用邵氏硬度测试仪对3组支架表面硬度进行测试。
1.4.4 支架药物释放曲线采用高效液相色谱法分析PLA/PDA/NB支架在特定时间点(12 h，24 h，2 d，3 d，5 d，7 d，11 d和14 d)的新补骨脂异黄酮释放情况。将PLA/PDA/NB支架浸泡在PBS中，在每个时间点提取1 mL释放介质并与等体积的甲醇混合，同时补充等量PBS；将释放介质与甲醇混合物13 000 r/min离心15 min，收集上清液进行分析。使用的高效液相色谱系统，配备Acclaim™ 120 C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，色谱条件：流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液(85∶15)，检测波长为247 nm，柱温为25 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，检测新补骨脂异黄酮浓度。
1.4.5 细胞培养将小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1用MEM-α完全培养基(含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素)培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中，隔天更换培养基并观察细胞生长状态。选择第3-6代细胞用于后续实验。
1.4.6 支架的细胞相容性
实验分组：将3组支架置入体积分数75%乙醇中消毒2 h。随后将3组支架分别置入24孔细胞培养板中，每组支架设置6个平行孔；将MC3T3-E1细胞悬液接种于24孔细胞培养板内，细胞密度为2×104/孔。
细胞增殖实验：共培养1，2，3 d后，每孔加入40 μL CCK-8溶液(培养基与CCK-8的体积比为10∶1)孵育2 h，吸取100 μL上清液至96孔板中，使用酶标仪测450 nm波长处的吸光度值。
细胞死活染色：共培养24，48 h后，按照Calcein-AM/P.I.试剂盒说明书配制染色液，每孔加入300 μL染色液避光孵育30 min，用PBS清洗孔板以去除多余染料，在荧光显微镜下观察并记录。
1.4.7 支架对成骨细胞迁移的影响将3组支架置入体积分数75%乙醇中消毒2 h，按照10 mg∶1 mL的比例浸泡在不含胎牛血清的MEM-α培养基内，放入37 ℃摇床内120 r/min浸提24 h，1 000 r/min离心5 min后收集上清液，即得支架浸提液。
将3组支架浸提液分别添加到Transwell小室下室中，体积500 μL；将MC3T3-E1细胞接种于Transwell小室上室中，加入不含胎牛血清的MEM-α培养基，细胞密度为2×104/孔，将Transwell小室放入细胞培养箱中于37 ℃孵育。孵育24 h后，用40 g/L多聚甲醛固定迁移到膜另一侧的细胞30min，用0.5%结晶紫染色1 h，PBS洗涤后，使用光学显微镜观察并拍照，通过Image J软件计数每板5个随机区域迁移的细胞；同时将染色的细胞在体积分数95%乙醇中裂解1 h，使用酶标仪在570 nm波长处测量吸光度值。
1.4.8 支架对成骨活性的影响将3组支架置入体积分数75%乙醇中消毒2 h。
茜素红染色：将消毒后的3组支架分别置入24孔细胞培养板中，每组支架设置3个平行孔；将MC3T3-E1细胞悬液加入24孔细胞培养板中，细胞密度为2×104/孔，培养24 h后将细胞培养基更换为成骨诱导培养基。成骨诱导培养7 d后，用PBS洗涤细胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min，使用茜素红染色液在室温下染色2 h，使用显微镜观察并拍照。将茜素红染色完的孔板晾干，加入10%氯化十六烷基吡啶溶液，置于摇床洗脱1 h至均匀，取溶解液，使用酶标仪测量波长562 nm处的吸光度值。
碱性磷酸酶活性检测：将3组支架置入体积分数75%乙醇中消毒2 h。将消毒后的3组支架分别置入12孔细胞培养板中，每组支架设置3个平行孔；将MC3T3-E1细胞悬液加入12孔细胞培养板中，细胞密度为2×104/孔，培养24 h后将细胞培养基更换为成骨诱导培养基。成骨诱导培养7 d后，用PBS洗涤细胞2次，使用0.2% Triton X-100在4 ℃下裂解12 h，取各组上清液50 µL至96孔板，加入碱性磷酸酶显色底物后置于细胞培养箱孵育30 min，加入50 µL反应终止液终止反应，在波长405 nm处测量吸光度值，根据标准曲线计算碱性磷酸酶活性。
1.4.9 支架对破骨活性的影响将3组支架置入体积分数75%乙醇中消毒2 h后，分别置于24孔细胞培养板中，每组支架设置3个平行孔；将RAW264.7细胞悬液加入24孔细胞培养板中，细胞密度为1×105/孔，以单独培养的细胞为对照，培养24 h后将细胞培养基更换为含50 ng/mL核因子κB受体活化因子配体的培养基进行破骨诱导分化[34]，隔天换液。破骨诱导培养第5天，弃去培养基并用PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，用PBS洗涤2次，进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，使用显微镜观察并拍照。将染色完的孔板晾干，每孔加入10 mmol/L酒石酸钠和10 mmol/L对硝基苯酚磷酸盐孵育1 h，加入5 mol/L NaOH终止反应，测量405 nm波长处的吸光度值。
1.5 主要观察指标 3组支架的表面形貌、细胞相容性以及对成骨活性与破骨活性的影响。
1.6 统计学分析使用SPSS 25.0进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示，非正态分布的计量资料采用平均秩次(R)和四分位数(P25，P50，P75)表示。若方差齐，采用单因素方差分析(one way ANOVA test)；若方差不齐，采用Tukey多重比较进行分析。P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经由广州中医药大学统计学专家审核。

讨论

骨组织的生长、发育、代谢和衰老表现为骨量的增加或减少，而在组织学上则以骨构塑和骨重建两种方式进行[35]，这两种方式都涉及破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成[36-38]。骨骼重塑是维持骨骼健康的关键过程，通过不断吸收旧骨并形成新骨保持骨量平衡，贯穿终生[39]。在骨重塑周期中，破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成紧密结合，共同维持骨稳态[40]。破骨细胞是大型多核细胞，可降解骨基质并与成骨细胞和骨细胞(成骨细胞的完全成熟形式)一起参与骨重塑[41]。破骨细胞与成骨细胞的作用密切相关，当破骨细胞过度活跃时，骨平衡破坏引起骨基质减少，进而导致骨破坏性疾病等多种疾病的发生[42-44]。然而，成骨细胞过度分化也会导致骨量异常增多，引起骨硬化等疾病[45]。因此，在设计和制备骨修复材料时，不仅应该考虑对于成骨细胞分化的作用，还应该考虑到它对破骨细胞吸收的作用。
聚乳酸是一种极具前景的可生物降解聚合物，具有良好的生物降解性、生物相容性和可调控性[46-48]，近年来在骨组织工程中得到广泛应用，成为制备人工骨组织工程的理想材料。此次研究通过熔融沉积成型打印技术成功制备了3D打印聚乳酸支架，扫描电镜下可见支架具有较为规则的孔洞结构，平均孔径约为400 μm，并且各个孔洞连接成为网状结构，这不仅增加了支架的表面积，也有利于促进氧气和营养物质的交换，为细胞生长提供了良好的微环境，促使细胞长入支架内部并促进骨组织的生长。SWANSON等[49]的研究表明，组织工程支架孔径大小对细胞起到关键的调节作用，相较于与中等孔径(直径为125-250 μm)和小孔径(直径为63-125 μm)的3D支架，大孔径(直径为250-425 μm)3D支架更有利于细胞分化成为成熟的细胞外基质中的矿化成骨细胞，这可能是由于较小孔径的曲率较陡，可能会对细胞施加额外的选择压力，从而损害细胞分化。此外，大孔径有利于血管形成，允许细胞迁移和骨向内生长。
尽管3D打印聚乳酸支架得到广泛的应用，但聚乳酸的水分子吸收率低、表面亲水性差、结晶度高等缺点，限制了它在临床中的进一步应用，因此，研究人员一直在努力改进聚乳酸的性能，这些努力包括与其他材料的组合、添加生物活性物质以及利用新的生产技术等[50]。GUO等[51]以聚乳酸作为基础材料，氧化石墨烯作为增强填料，通过熔融沉积建模制备出3D打印聚乳酸/氧化石墨烯复合支架，结果表明加入0.1%氧化石墨烯后，聚乳酸/氧化石墨烯支架的拉伸模量与的压缩模量分别提升35.6%，35.8%，促进骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化行为。ZHANG等[52]将分离的间充质干细胞外泌体(MSC-Exo)用于聚乳酸支架表面涂层，所制备的支架具有免疫调节潜力并有利于成骨分化。WANG等[53]用冰模板和相转化的方法设计和制造了具有定向多孔结构的聚乳酸支架，该支架可以通过促进骨细胞的生长和增殖来加速骨修复。因此，通过一种简单易行的方法将生物活性分子引入到3D打印聚乳酸支架，实现对骨修复过程中成骨细胞和破骨细胞的调控，可以使得支架更好地发挥生物学性能。
此次研究通过聚多巴胺模仿贻贝对支架进行表面改性，通过自聚合过程将新补骨脂异黄酮沉积在3D打印聚乳酸支架表面，所制备的支架不仅具有多孔互通的三维结构，并且相较于人体松质骨(2-12 MPa)[54]，3组支架的最大压缩强度均符合需求。CCK-8和死活染色结果表明，3组支架均具有良好的生物安全性和生物活性。抗酒石酸酸性磷酸酶可以反映出破骨细胞活性和骨吸收状态[54-55]。新补骨脂异黄酮不仅能够促进骨细胞的增殖和分化，有助于骨组织的形成和修复；还能抑制破骨细胞分化，减少骨质丢失[56]。此次研究结果表明，PLA/PDA/NB支架抑制了破骨细胞的骨吸收能力、促进MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。新补骨脂异黄酮可以通过多种信号通路抑制破骨细胞的骨吸收作用。研究表明，新补骨脂异黄酮可以阻断核因子κ B受体活化因子配体信号介导的肿瘤坏死因子受体关联因子6和c-Src募集以及核因子κB、丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶B途径来抑制破骨细胞生成[20]。此外，新补骨脂异黄酮可能是通过激活p38依赖的信号通路上调Runx2和Osx mRNA水平，进而刺激骨基质蛋白的表达，提高成骨活性[19]。因此，PLA/PDA/NB支架通过促进成骨细胞增殖、迁移、矿化以及抑制破骨细胞活性来促进骨形成。
综上所述，此次研究开发了一种通过调节破骨和成骨细胞活性促进骨修复的3D打印多孔支架。首先通过熔融沉积建模制备了具有大孔径的3D打印聚乳酸支架，通过聚多巴胺沉积将新补骨脂异黄酮掺入聚乳酸支架表面，从而对支架起到表面修饰作用，实验结果表明PLA/PDA/NB支架不仅具有良好的细胞安全性，还能进一步促进成骨细胞迁移，更重要的是，支架的表面涂层促进了成骨细胞的成骨分化，并抑制破骨细胞的骨吸收作用。因此，使用新补骨脂异黄酮涂层对3D打印多孔支架进行处理具有潜在调节骨吸收与成骨平衡的能力。考虑到成骨细胞及破骨细胞功能平衡对于骨稳态维持具有重要意义，该方法在解决代谢性骨相关疾病患者的种植体周围问题方面具有巨大潜力。
考虑到目前所开展的研究仍然以体外实验为主，所制备的支架可能存在生物相容性问题，即材料与人体组织的相互作用可能导致排斥反应或其他不良反应；此外，该研究未探讨支架在体内的降解速率问题，这可能导致材料的残留或降解产物对身体造成不利影响。因此，未来应重点研究所制备支架的体内生物相容性，以减少可能存在的排斥反应，同时进一步探讨材料的降解性能，以确保它在体内的降解过程安全有效。上述这些努力将有助于推动3D打印PLA/PDA/NB支架的临床应用，提高临床效果和治疗体验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

3D打印新补骨脂异黄酮涂层支架调节成骨/破骨细胞活性促进骨再生

3D printed neobavaisoflavone-coated scaffolds promote bone regeneration by regulating osteoblast/osteoclast activities

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