兼具抗菌与促成骨功能水凝胶的制备与表征

doi:10.12307/2026.374

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (26): 6768-6778.doi: 10.12307/2026.374

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兼具抗菌与促成骨功能水凝胶的制备与表征

周云圻1，2，刘旭1，肖东琴1，李兴平2，匙峰3，张波1，蒲超2，罗栩伟1，张成栋1

1川北医学院第二临床学院，南充市中心医院骨科，组织工程与干细胞研究所，四川省南充市 637000；2成飞医院骨科，四川省成都市 610091；3西华师范大学组织修复材料工程技术协同创新中心，四川省南充市 637000

接受日期:2025-09-12 出版日期:2026-09-18 发布日期:2026-03-11
通讯作者: 罗栩伟，博士，副主任医师，川北医学院第二临床学院，南充市中心医院骨科，组织工程与干细胞研究所，四川省南充市 637000 张成栋，博士，助理研究员，川北医学院第二临床学院，南充市中心医院骨科，组织工程与干细胞研究所，四川省南充市 637000
作者简介:周云圻，男，1998年生，四川省资阳市人，汉族，川北医学院在读硕士，主要从事骨修复机制研究。
基金资助:
四川省自然科学基金项目(2023NSFSC1740)，项目负责人：张成栋；南充市市校合作科研项目(22SXJCQN0002)，项目负责人：肖东琴；四川省医学会青年创新项目(Q2024026)，项目负责人：罗栩伟；四川省医学会青年创新项目(Q22034)，项目负责人：李兴平

Fabrication and characterization of hydrogels with both antibacterial and osteogenic functions

Zhou Yunqi1, 2, Liu Xu1, Xiao Dongqin1, Li Xingping2, Shi Feng3, Zhang Bo1, Pu Chao2, Luo Xuwei1, Zhang Chengdong1

Research Institute of Tissue Engineering and Stem Cells, Department of Orthopedics of Nanchong Central Hospital, The Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 2Department of Orthopedics, Chengfei Hospital, Chengdu 610091, Sichuan Province, China; 3Collaboration Innovation Center for Tissue Repair Material Engineering Technology, China West Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China

Accepted:2025-09-12 Online:2026-09-18 Published:2026-03-11
Contact: Luo Xuwei, PhD, Associate chief physician, Research Institute of Tissue Engineering and Stem Cells, Department of Orthopedics of Nanchong Central Hospital, The Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Zhang Chengdong, PhD, Assistant research fellow, Research Institute of Tissue Engineering and Stem Cells, Department of Orthopedics of Nanchong Central Hospital, The Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
About author:Zhou Yunqi, Master candidate, Research Institute of Tissue Engineering and Stem Cells, Department of Orthopedics of Nanchong Central Hospital, The Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; Department of Orthopedics, Chengfei Hospital, Chengdu 610091, Sichuan Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Sichuan Province, No. 2023NSFSC1740 (to ZCD); Nanchong City-University Collaborative Research Project, No. 22SXJCQN0002 (to XDQ); Sichuan Medical Association Youth Innovation Project, No. Q2024026 (to LXW); Sichuan Medical Association Youth Innovation Project, No. Q22034 (to LXP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
表没食子儿茶素没食子酸酯：是绿茶中含量最高的活性成分，属于儿茶素类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、调节代谢、保护心血管及神经等作用。在抗菌方面，表没食子儿茶素没食子酸酯能破坏细菌的细胞膜、抑制细菌的酶活性和干扰细菌的代谢过程。
双离子掺杂羟基磷灰石：双离子在此处主要指铜离子与锌离子，双离子掺杂羟基磷灰石是指将铜、锌离子引入羟基磷灰石晶格中形成双离子掺杂羟基磷灰石，从而增强羟基磷灰石的生物学性能。

背景：水凝胶材料因具有良好的生物相容性及可降解性能等优点成为组织修复材料研究的热点，然而单一水凝胶材料缺乏抗菌及成骨功能，临床应用受限。
目的：制备兼具抗菌与促成骨功能的水凝胶用于骨组织修复。
方法：①采用化学沉淀法合成铜离子、锌离子共掺杂羟基磷灰石。将双离子掺杂羟基磷灰石、表没食子儿茶素没食子酸酯与双离子掺杂羟基磷灰石+表没食子儿茶素没食子酸酯分别加入光引发剂中，将甲基丙烯酰化明胶分别加入单独的光引发剂与上述光引发剂中，在405 nm波长紫外光下照射固化20 s，得到甲基丙烯酰化明胶水凝胶(记为G)、双离子掺杂羟基磷灰石/甲基丙烯酰化明胶水凝胶(记为G-Cu/Zn HA)、表没食子儿茶素没食子酸酯修饰甲基丙烯酰化明胶水凝胶(记为G-E)、表没食子儿茶素没食子酸酯修饰的双离子掺杂羟基磷灰石/甲基丙烯酰化明胶水凝胶(记为G-E-Cu/Zn HA)。表征4组水凝胶的微观形貌、压缩力学性能、溶胀性能、降解性能与金属离子、表没食子儿茶素没食子酸酯释放动力学。②将金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)菌液分别与4组水凝胶共培养，通过琼脂平板涂布实验、活/死染色、扫描电镜评估各组水凝胶的抗菌性能。③将4组水凝胶分别与MC3T3-E1细胞共培养，通过活/死染色、CCK-8检测评估各组水凝胶的细胞相容性。将4组水凝胶分别与MC3T3-E1细胞共培养，成骨诱导后，通过碱性磷酸酶染色、茜素红S染色与成骨相关基因检测评估各组水凝胶的促成骨活性。
结果与结论：①扫描电镜下可见4组水凝胶横截面均表现出疏松多孔的内部结构，其中G、G-E水凝胶表面相对光滑平整，G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶孔壁表面粗糙度增加。G、G-E、G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶的压缩应力分别为10.48，12.91，23.64，41.03 kPa。相较于G水凝胶，G-E、G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶的整体溶胀时间缩短、溶胀平衡率降低。相较于其他3组水凝胶，G-E-Cu/Zn HA水凝胶降解周期延长。G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶在30 d内持续释放Cu2+、Zn2+、Ca2+，并且G-Cu/Zn HA水凝胶中释放的Cu2+、Zn2+总量较G-E-Cu/Zn HA水凝胶多。相较于G-E水凝胶，G-E-Cu/Zn HA水凝胶显著抑制了表没食子儿茶素没食子酸酯突释现象。②琼脂平板涂布实验、活/死染色、扫描电镜观察显示，相较于G水凝胶，其他3组水凝胶均具有细菌抑制作用，其中G-E-Cu/Zn HA水凝胶的抑制作用最强。③活/死染色、CCK-8检测显示4组水凝胶均具有良好的细胞相容性。碱性磷酸酶染色、茜素红S染色与成骨相关基因表达检测显示，G水凝胶的促成骨能力最弱，G-E-Cu/Zn HA水凝胶的促成骨最强。④结果表明，表没食子儿茶素没食子酸酯修饰的双离子掺杂羟基磷灰石/甲基丙烯酰化明胶复合水凝胶具有良好的抗菌与促成骨性能。
https://orcid.org/0009-0006-8363-1693 (周云圻)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: Cu2+, Zn2+, 纳米羟基磷灰石, 表没食子儿茶素没食子酸酯, 甲基丙烯酰化明胶水凝胶, 成骨, 抗菌, 生物材料

Abstract: BACKGROUND: Hydrogel materials have garnered significant attention in the field of tissue repair due to their excellent biocompatibility and biodegradability. However, the clinical application of hydrogel materials is hindered by their limited functionality, particularly the absence of antimicrobial and osteogenic properties.
OBJECTIVE: To design hydrogels with both antibacterial and osteogenic properties for bone tissue repair.
METHODS: (1) Hydroxyapatite co-doped with copper and zinc ions was synthesized by chemical precipitation. Double-ion-doped hydroxyapatite, epigallocatechin gallate, and double-ion-doped hydroxyapatite + epigallocatechin gallate were added to a photoinitiator, respectively. Methacrylated gelatin was added to either the photoinitiator alone or the aforementioned photoinitiator, respectively. The hydrogels were cured under 405 nm ultraviolet light for 20 seconds to obtain methacrylated gelatin hydrogels (denoted as G), double-ion-doped hydroxyapatite/methacrylated gelatin hydrogels (denoted as G-Cu/Zn HA), epigallocatechin gallate-modified methacrylated gelatin hydrogels (denoted as G-E), and epigallocatechin gallate-modified double-ion-doped hydroxyapatite/methacrylated gelatin hydrogels (denoted as G-E-Cu/Zn HA). The micromorphology, compressive mechanical properties, swelling properties, degradation properties, and release kinetics of metal ions and epigallocatechin gallate of the four hydrogels were characterized. (2) Staphylococcus aureus (or Escherichia coli) cultures were co-cultured with each of the four hydrogel groups. The antibacterial properties of each hydrogel group were evaluated by agar plate coating, live/dead staining, and scanning electron microscopy. (3) The four hydrogel groups were co-cultured with MC3T3-E1 cells. The cytocompatibility of each hydrogel group was evaluated by live/dead staining and CCK-8 assay. After co-culture with MC3T3-E1 cells, osteogenic activity of each hydrogel group was evaluated by alkaline phosphatase staining, Alizarin Red S staining, and expression of osteogenesis-related genes after osteogenic induction.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy revealed that the cross-sections of all four hydrogel groups exhibited a loose and porous internal structure. The surfaces of the G and G-E hydrogels were relatively smooth, while the pore walls of the G-Cu/Zn HA and G-E-Cu/Zn HA hydrogels showed increased surface roughness. The compressive stresses of the G, G-E, G-Cu/Zn HA, and G-E-Cu/Zn HA hydrogels were 10.48, 12.91, 23.64, and 41.03 kPa, respectively. Compared with the G hydrogel, the G-E, G-Cu/Zn HA, and G-E-Cu/Zn HA hydrogels exhibited shortened overall swelling times and decreased swelling equilibrium rates. The degradation cycle of the G-E-Cu/Zn HA hydrogel was prolonged compared with the other three hydrogel groups. The G-Cu/Zn HA and G-E-Cu/Zn HA hydrogels continuously released Cu2+, Zn2+, and Ca2+ over 30 days, with the total amount of Cu2+ and Zn2+ released from the G-Cu/Zn HA hydrogel exceeding that from the G-E-Cu/Zn HA hydrogel. Compared with G-E hydrogel, G-E-Cu/Zn HA hydrogel significantly inhibited the burst release of epigallocatechin gallate. (2) Agar plate spread assay, live/dead staining, and scanning electron microscopy revealed that compared with G hydrogel, the other three hydrogel groups all exhibited antibacterial activity, with G-E-Cu/Zn HA hydrogel exhibiting the strongest inhibitory activity. (3) Live/dead staining and CCK-8 assay revealed that all four hydrogel groups exhibited good cytocompatibility. Alkaline phosphatase staining, Alizarin Red S staining, and osteogenesis-related gene expression assay revealed that G hydrogel exhibited the weakest osteogenic activity, while G-E-Cu/Zn HA hydrogel exhibited the strongest osteogenic activity. (4) These results demonstrate that the epigallocatechin gallate-modified dual-ion-doped hydroxyapatite/methacrylated gelatin composite hydrogel exhibits excellent antibacterial and osteogenic properties.

Key words: Cu2?, Zn2?, nanohydroxyapatite, epigallocatechin gallate, methacryloylated gelatin hydrogel, osteogenesis, antibacterial, biomaterial

中图分类号:

周云圻, 刘旭, 肖东琴, 李兴平, 匙峰, 张波, 蒲超, 罗栩伟, 张成栋. 兼具抗菌与促成骨功能水凝胶的制备与表征[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(26): 6768-6778.

Zhou Yunqi, Liu Xu, Xiao Dongqin, Li Xingping, Shi Feng, Zhang Bo, Pu Chao, Luo Xuwei, Zhang Chengdong. Fabrication and characterization of hydrogels with both antibacterial and osteogenic functions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(26): 6768-6778.

图/表（结果） 11

2.1 双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒的表征傅里叶变化红外光谱分析显示，双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒在562，603 cm-1处的吸收峰归属于PO4-3的弯曲振动峰，在961，1 033和1 097 cm-1处的3个峰归属于PO4-3的对称伸缩振动峰，见图1A。
X射线光电子能谱表明，双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒的主峰包含O1s(530.6 eV)、Ca2p (346.8 eV、438.8 eV)、C1s(284.6 eV)、
P2s(190.5 eV)、P2p(132.9eV)；此外还观察到Cu2p(933.9 eV)和Zn2p(1022.3 eV)的峰，证实了Cu2+、Zn2+已成功掺杂在羟基磷灰石纳米颗粒中，见图1B。
X射线衍射分析显示，双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒符合羟基磷灰石标准衍射图谱(JCPDS 09-0432)，见图1C。透射电镜观察微观结构显示，双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒呈现细针状晶体形态，直径为50-100 nm。使用DM软件(Digital Micrograph，美国)分析双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒晶格条纹的物相晶格间距，计算得出该晶格条纹间距为0.28 nm，归属于羟基磷灰石(211)晶面，见图1D。综合以上结果表明成功获得了双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒。

2.2 水凝胶的可交联性和内部形貌观察结果如图2A所示，经过405 nm紫外光交联后各水凝胶均具有良好的可交联性能。扫描电镜观察结果显示，4组水凝胶横截面均表现出疏松多孔的内部结构，在高倍镜下发现G、G-E水凝胶表面相对光滑平整，G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶孔壁表面粗糙度增加，见图2B。

2.3 水凝胶的力学性能测试结果 4组水凝胶的压缩应力-应变曲线，见图3。压缩测试结果显示，G、G-E、G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶的压缩应力分别为10.48，12.91，23.64，41.03 kPa。

2.4 水凝胶的溶胀及降解检测结果溶胀实验结果显示，4组水凝胶在最初的4 h内都表现出快速的溶胀行为(> 350%)，G水凝胶约在72 h达到溶胀平衡(约为800%)，而G-E、G-Cu/Zn HA和G-E-Cu/Zn HA水凝胶约在48 h时已达到溶胀平衡(约为700%)，见图4A。
降解实验结果显示，4组水凝胶均表现出其良好的体外生物降解性，G、G-E、G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶在PBS中浸泡第30 天的剩余质量百分比分别约为0%，15%，45%，55%；浸泡第50天，G、G-E、G-Cu/Zn HA水凝胶均已完全降解，仅G-E-Cu/Zn HA水凝胶仍然拥有约13%的剩余质量百分比，见图4B。

2.5 水凝胶中金属离子及EGCG释放动力学检测结果金属离子释放动力学检测显示，在30 d的时间内，随着时间的推移，G-Cu/Zn HA和G-E-Cu/Zn HA水凝胶中的Cu2+、Zn2+、Ca2+表现出持续释放趋势，前2 d，水凝胶中Cu2+、Zn2+、Ca2+突释，这是由于水凝胶表面吸附的离子快速解离形成的；5 d后释放速率减缓并趋于稳定；释放30 d后，G-Cu/Zn HA水凝胶中Cu2+、Zn2+、Ca2+释放总量分别为4.85，3.85，1 236.71 μg，G-E-Cu/Zn HA水凝胶中Cu2+、Zn2+、Ca2+释放总量分别为4.45，3.47 ，1 251.8 μg，见图5A-C。
EGCG释放动力学曲线显示，G-E水凝胶呈现典型的两阶段释放特征：初始阶段EGCG释放速率显著升高，第1，2天时释放的EGCG质量浓度分别达到53.1，26.7 μg/mL，约为总释放量的60.2%和30.2%；随后进入缓释平台期，释放速率显著降低，第3，5，7，10天释放的EGCG质量浓度分别为4.9，1.5，0.9及1.2 μg/mL，第3-10天内释放量仅占EGCG总释放量的9.6%；不同于G-E水凝胶，G-E-Cu/Zn HA水凝胶第1，2，3，5，7，10天释放的EGCG质量浓度分别为19.6，16.7，13.7，12.1，7.1，5.5 μg/mL，呈梯度递减趋势，见图5D，这是由于EGCG分子中的邻苯二酚基团与Cu2+、Zn2+通过配位键形成螯合显著抑制了EGCG的突释现象。

2.6 水凝胶的体外抗菌活性检测结果对琼脂平板上的金黄色葡萄球菌及大肠杆菌菌落进行观察并计数，结果显示，与G组比较，G-E组、G-Cu/Zn组金黄色葡萄球菌及大肠杆菌细菌数量均有所下降，G-E-Cu/Zn HA组金黄色葡萄球菌及大肠杆菌细菌数量降低更为明显(图6A-D)。G-E、G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶对于金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为(63.8±5.5)%，(91.9±3.0)%，(96.4±1.7)%，对于大肠杆菌的抑菌率分别为(73.5±4.4)%，(82.6±2.3)%，(91.1±1.2)%，见图6E，F。
活/死染色结果显示，G组金黄色葡萄球菌或大肠杆菌表现为大量绿色荧光且无红色荧光，证明大部分金黄色葡萄球菌或大肠杆菌处于存活状态，细菌无明显死亡；相较于G组，G-E组、G-Cu/Zn HA组、G-E-Cu/Zn HA组金黄色葡萄球菌或大肠杆菌绿色荧光减少、红色荧光增多，并且以G-E-Cu/Zn HA组表现最明显，证明金黄色葡萄球菌或大肠杆菌出现明显死亡(图7)。
利用扫描电镜对各组水凝胶表面生长的细菌进行观察，结果显示：G组中金黄色葡萄球菌或大肠杆菌大量生长，呈典型的球形或长杆状，菌膜光滑完整；G-E组、G-Cu/Zn HA组、G-E-Cu/Zn HA组金黄色葡萄球菌或大肠杆菌形态发生改变，密度明显减小，部分细菌菌膜已发生皱缩破裂(红色箭头指向为已皱缩破裂菌膜)，尤其以G-E-Cu/Zn HA组表现最明显，见图8。

2.7 水凝胶的细胞相容性评估结果活/死染色结果显示，与4组水凝胶共培养3，5 d后的MC3T3-E1细胞均生长良好、形态正常，仅见少量死细胞，并且各组培养5 d的活细胞数量明显多于培养3 d，见图9A。CCK-8检测结果显示，随着培养时间的延长，与4组水凝胶共培养的MC3T3-E1细胞均出现增殖，培养1 d后，各组间细胞数量无明显差异(P > 0.05)；培养4 d后，G-Cu/Zn HA组及G-E-Cu/Zn HA组细胞数量多于G组、G-E组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)；培养7 d后，G-E-Cu/Zn HA组细胞数量多于其他3组
(P < 0.01，P < 0.000 1)，见图9B。活/死细胞染色和CCK-8检测表明4组水凝胶均具有良好的细胞相容性，并且G-E-Cu/Zn HA水凝胶可促进MC3T3-E1细胞增殖。

2.8 水凝胶的促成骨活性检测结果
碱性磷酸酶染色：碱性磷酸酶是评估成骨分化的早期标志物，此次研究通过检测碱性磷酸酶评估各组水凝胶对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响，结果显示，与G组、G-E组和G-Cu/Zn HA组相比，G-E-Cu/Zn HA组碱性磷酸酶阳性染色面积更大，蓝紫色更深，见图10A。碱性磷酸酶活性定量分析结果显示，G-E-Cu/Zn HA组碱性磷酸酶含量分别较G组、G-E组和G-Cu/Zn HA组增高了61.1%，32.9%，22.0%，见图10B。
茜素红S染色：茜素红S染色图像显示，G组桔红色钙结节沉积最少，G-E-Cu/Zn HA组钙结节沉积最多，见图10C。茜素红S染色定量分析结果显示，G-E-Cu/Zn HA组骨矿化水平相较于G组、G-E组和G-Cu/Zn HA组分别升高了700.8%，290.1%，21.7%，见图10D。
成骨相关基因表达：RT-qPCR测定结果显示，G-E-Cu/Zn HA组碱性磷酸酶、骨桥蛋白、RUNX2 mRNA表达高于其他3组，G-Cu/Zn HA组和G-E-Cu/Zn HA组骨钙素mRNA表达高于其他2组，差异均有显著性意义，见图11，表明G-E-Cu/Zn HA水凝胶具有显著的促成骨相关基因表达能力。

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引言

近年来，因创伤、感染、肿瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺损，使人们对骨修复体的需求量呈现快速增长[1]。临床上自体骨移植是骨缺损治疗的金标准，因来源有限、供区损伤等问题限制了其临床广泛应用；异体骨移植又面临免疫排斥及病源传染等风险[2]。此外，骨缺损修复过程中感染的发生是临床治疗中的一大难题，细菌入侵骨缺损部位后会激活机体免疫系统，导致炎症反应过度激活，引发一系列严重后果[3-4]。在炎症微环境下，成骨细胞的功能和活性受到抑制，新骨形成过程受阻[5]。长期的细菌感染会导致骨组织逐渐被破坏，甚至可能发展为骨髓炎等严重疾病；若感染未能及时控制，细菌还可能通过血液循环扩散至全身，引发败血症等全身性感染疾病，直接威胁患者的生命安全[6]。传统的修复方法往往难以同时实现感染控制和组织再生[7]，因此，开发具有优良生物相容性、兼抗菌功能并能有效引导骨再生的水凝胶支架材料成为研究的热点。
甲基丙烯酰化明胶作为一种源自天然明胶的可光交联聚合物，具有良好的细胞相容性、可降解及可注射等优点，在骨组织修复中得到广泛关注[8]。但是，甲基丙烯酰化明胶水凝胶的机械强度相对较低，在骨修复过程中单独使用无法提供足够的支撑[9]；甲基丙烯酰化明胶水凝胶缺乏能诱导成骨的关键成分，无法直接诱导成骨细胞的增殖、分化以及骨基质矿化进程，单独使用难以满足骨组织再生的生物学要求[10]；甲基丙烯酰化明胶水凝胶不具备天然的抗菌能力，植入体内后易受细菌侵害，不能有效阻止细菌黏附和生长[11]。
羟基磷灰石作为骨组织的主要无机成分，因良好的生物相容性及骨诱导性在骨修复领域引起广泛关注[12]。一方面，羟基磷灰石能与周围骨组织形成良好的化学键合，有利于骨融合；另一方面，羟基磷灰石具备的骨诱导特性能有效引导新生骨组织长入[13]。虽然羟基磷灰石在骨修复领域表现出良好的生物学性能，但在实际应用中仍存在局限性，例如：羟基磷灰石的机械性能较差、脆性较高，难以承受骨缺损部位的力学负荷；降解速率较慢，与新生骨组织的生长速率不匹配[14]；此外，羟基磷灰石本身缺乏抗菌性能，在感染性骨缺损修复中难以有效抑制细菌繁殖，增加了术后感染风险[15]。为了克服这些不足，研究者们提出了多种改性策略，例如：通过将羟基磷灰石与聚合物基质(如聚乳酸、聚己内酯)复合可以显著改善材料的机械性能，使材料更适应复杂的力学环境[14，16]；将羟基磷灰石与抗菌剂(如铜离子、抗生素或天然抗菌成分)结合提升抗菌性能，从而满足感染性骨缺损修复的需求[17-18]。
Cu2+和Zn2+作为人体内的微量元素，在抗菌及成骨方面具有双重功效[19-20]。研究发现，Cu2+和Zn2+在促血管化生成以及成骨分化方面起着重要作用，有利于加速骨缺损修复进程[21]；同时，Cu2+和Zn2+还表现出广谱抗菌活性，能够通过破坏细菌细胞膜结构和抑制细菌代谢途径，显著抑制细菌的生长与繁殖，从而降低骨修复过程中感染的风险[22-23]。基于上述特性，将Cu2+和Zn2+掺杂到羟基磷灰石中形成的新型复合材料，有望实现抗菌性能与促成骨功能的协同效应。
表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)作为茶多酚的主要组成成分，具有结构独特的多酚羟基，这些基团可以与水凝胶中的聚合物链形成氢键或共价交联，从而增强水凝胶的力学性能[24]；并且EGCG具有抗菌、抗氧化及抗炎等多种药理作用[25]。特别是在抗菌方面，由于EGCG带负电荷，可与细菌细胞膜中带正电荷的脂质结合，这种结合可使细菌菌膜的结构损伤，促进细菌菌膜内泄漏和脂质双分子层的破碎，有效抑制细菌增殖[26]。在组织工程应用中，EGCG作为抗氧化剂可通过注射给药、纳米颗粒递送和表面修饰等方式清除细胞内活性氧[27-28]，这些优异的生物学特性使它在骨组织修复领域展现出重要的应用前景[29]。然而，EGCG由于分子中的多酚羟基结构在环境因素影响下易发生氧化聚合反应，导致化合物稳定性下降。此外，高浓度EGCG会显著抑制细胞生长；类似地，高浓度Cu2+也表现出较强的细胞毒性，这些因素都限制了它们的单独应用。最近的研究表明，通过构建金属-多酚配位网络不仅能显著提高EGCG的稳定性和生物利用度，还可实现EGCG与Cu2+的协同缓释，避免突释效应，从而有效降低它们对生物体的潜在毒性[30]。
因此，此次研究拟将EGCG与双离子掺杂羟基磷灰石共同引入甲基丙烯酰化明胶水凝胶体系中，旨在开发一种兼具高效抗菌性能和促成骨性能的新型多功能复合水凝胶材料，为骨缺损治疗提供潜在策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计水凝胶的制备与表征。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2024年6月在川北医学院第二临床医学院 · 南充市中心医院组织工程与干细胞研究所完成。
1.3 材料表没食子儿茶素没食子酸酯(阿拉丁，中国)；甲基丙烯酰基明胶、光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(EFL，中国)；405 nm蓝光灯(中山市天斗照明，中国)；小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1(中国科学院上海细胞库)；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(北京北纳创联生物技术研究院)；α-MEM基础培养基、青链霉素双抗、胎牛血清、PBS(Gibco，美国)；细胞冻存液、胰蛋白酶(新赛美，中国)；营养琼脂、脑心浸出液肉汤(青岛海博，中国)；活/死细菌双染试剂盒(上海懋康，中国)；活/死细胞染色试剂盒、BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、碱性磷酸酶试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天，中国)；Total RNA Isolation Kit、HiScript® Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，中国)；PCR引物(里来生物，中国)；1%茜素红染料、氯代十六烷基吡啶(索莱宝，中国)；细菌培养箱、生物安全柜(Thermo公司，美国)；气浴恒温振荡器(上海旻泉，中国)；酶联免疫分析仪(杭州奥盛，中国)；荧光倒置显微镜(Nikon，日本)；扫描电子显微镜(蔡司，德国)；X射线衍射仪(Rigaku Ultima IV，日本)；透射电子显微镜(TEM，F200，日本)；X射线光电子能谱仪(ESCALAB250Xi，美国)；傅里叶变换红外光谱仪(PerkinElmerSpectrum Two，美国)；电子万能试验机(E43.504，20N-50 kN，中国)；高性能电感耦合等离子体发射光谱仪(珀金埃尔默上海有限公司，Avio® 550 Max，中国)；PCR仪(伯乐，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒的合成采用化学沉淀法合成Cu2+/Zn2+共掺杂羟基磷灰石。将四水硝酸钙(0.81 mol/L)、六水硝酸锌(0.02 mol/L)、三水硝酸铜(0.02 mol/L)、十二烷基硫酸钠(0.03 mol/L)配置成混合溶液，在室温下与磷酸氢二铵溶液(0.55 mol/L)反应并搅拌，其中(钙+铜+锌)/磷的摩尔比为1.55；添加氨水调定pH值至8.0，搅拌后陈化24 h，3 000 r/min离心5 min后弃上清，收集粗产品，用40 ℃去离子水循环洗涤5次，置于-40 ℃冷冻干燥96 h得到双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒。
1.4.2 水凝胶的制备以2.5 g/L 2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶液作为甲基丙烯酸酯基团光交联反应的光引发剂。①将甲基丙烯酰化明胶加入光引发剂中，溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量分数为10%，于40 ℃搅拌3 h后注入模具中，在405 nm波长紫外光下照射固化20 s，得到甲基丙烯酰化明胶水凝胶(记为G)；②将双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒加入光引发剂中制备含质量分数0.5%双离子掺杂羟基磷灰石的溶液，于40 ℃搅拌均匀，将甲基丙烯酰化明胶加入混合溶液中(溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量分数为10%)，于40 ℃搅拌3 h后注入模具中，在405 nm波长紫外光下照射固化20 s，得到双离子掺杂羟基磷灰石/甲基丙烯酰化明胶水凝胶(记为G-Cu/Zn HA)；③将EGCG加入光引发剂中搅拌30 min，溶液中EGCG的质量浓度为0.1 mg/mL，将甲基丙烯酰化明胶加入溶液中(溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量分数为10%)，于40 ℃搅拌3 h后注入模具中，在405 nm波长紫外光下照射固化20 s，得到EGCG修饰甲基丙烯酰化明胶水凝胶(记为G-E)；④将双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒加入光引发剂中制备含质量分数0.5%双离子掺杂羟基磷灰石的溶液，于40 ℃搅拌均匀，加入EGCG搅拌30 min(溶液中EGCG的质量浓度为0.1mg/mL)，将甲基丙烯酰化明胶加入溶液中(溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量分数为10%)，于40 ℃搅拌3 h后注入模具中，在405 nm波长紫外光下照射固化20 s，得到EGCG修饰的双离子掺杂羟基磷灰石/甲基丙烯酰化明胶水凝胶(记为G-E-Cu/Zn HA)。
1.4.3 双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒的表征
傅里叶变换红外光谱分析官能团：将双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒与KBr混合研磨后压成薄片后，进行透射模式的光谱采集，光谱范围为4 000-400 cm⁻¹，分辨率为4 cm⁻¹。取32次的平均值。
X射线光电子能谱分析表面元素组成：设置扫描范围为-10-1 350 eV，对样品进行元素O、P、Ca、C、Cu、Zn扫描。
X射线衍射分析物相组成：扫描模式设置为步进扫描，将管压和管流设置为40 kV和40 mA，扫描范围设置为2θ=5°-90°，步长设置为0.02°。
透射电镜观察晶体结构：将样品加入无水乙醇中，利用超声分散以确保样品均匀分布，使用碳膜作为支持膜承载样品，加速电压设置为200 kV，对样品进行低倍形貌及高倍晶体结构分析。
1.4.4 水凝胶的理化性质表征
水凝胶的可交联性观察：将4组水凝胶溶液使用405 nm紫外光照射20 s后进行观察，利用数码相机拍照。
扫描电镜观察水凝胶截面形貌：将紫外光交联后的4组水凝胶置于-80 ℃低温环境中冷冻6 h，对样品截面实施喷金溅射处理，扫描电镜下观察水凝胶形态。
水凝胶的机械性能测试：使用电子万能试验机检测4组水凝胶(Φ 6mm×10 mm)的压缩应力，压缩速率4 mm/min，同时绘制应力-应变曲线。
水凝胶的降解和溶涨性能测定：①将紫外光交联后的4组水凝胶置于-80 ℃低温环境中冷冻6 h，称质量(m0)后完全浸入20 mL PBS(0.01 mol/L，37 ℃)中。于0，4，8，12，24，48，72 h时间点依次取出样品后，用滤纸吸干样品表面多余水分后称质量(mt)，计算溶胀率。②将紫外光交联后的4组水凝胶称质量(m0)后完全浸入20 mL PBS(0.01 mol/L，37 ℃)中，每间隔10 d从溶液中取出水凝胶样品，吸干表面附着的多余水分后称质量(mt)，计算剩余质量百分比。
水凝胶溶胀率=(mt-m0)/m0×100%
水凝胶剩余质量百分比=mt/m0×100%
水凝胶中金属离子及EGCG释放动力学：①将1 mL的G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶分别置于15 mL离心管中，每组设置3个平行样，加入5 mL生理盐水后置于37 ℃水浴振荡(80 r/min)孵育。在1，2，5，10，15，20，25，30 d分别从每管取出3 mL溶液并保存于4 ℃，并向每管补充3 mL生理盐水，通过电感耦合等离子体发射光谱仪检测收集液中的Cu2+、Zn2+、Ca2+浓度，计算累计释放量。②将1 mL的G-E、G-E-Cu/Zn HA水凝胶分别置于5 mL EP管中，每组设置3个平行样，加入2 mL生理盐水后置于37 ℃水浴振荡(80 r/min)孵育，根据预设时间点(1，2，3，5，7，10 d)全量收集释放液，并同步补充等体积新鲜生理盐水。使用紫外分光光度计在290 nm波长下测定释放液的吸光度值，通过标准曲线计算EGCG释放量。
1.4.5 水凝胶的体外抗菌性能
实验分组：将4组水凝胶(Φ 5mm×2 mm)依次置于体积分数75%乙醇中浸泡30 min、PBS(0.01 mol/L，37 ℃)中浸泡12 h进行灭菌处理，随后置于无菌24孔板中。利用生理盐水稀释金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)菌液，使菌液浓度在105-107 CFU/mL范围内，用移液枪吸取100 µL金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)菌液分别接种于4组水凝胶上，置于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min；每孔加入1 mL液体培养基(脑心浸出液肉汤)，置于37 ℃恒温培养箱中振荡(150 r/min)孵育。
琼脂平板涂布实验：置于培养箱中孵育12 h后，吸取100 µL菌液置于琼脂培养板上，涂布均匀后置于37 ℃恒温培养箱中倒置过夜，使用Image J软件计数琼脂培养板上的细菌数，计算抗菌率。以G水凝胶与菌液共培养组为对照。
抗菌率=(实验组菌落数-对照组菌落数)/对照组菌落数×100%
活/死染色：置于培养箱中孵育30 min后，每孔加入1 mL液体培养基培养12 h，弃去培养基，加入3 µL染料混合液(SYTO 1.5 µL+PI 1.5 µL)染色暗室室温孵育15 min，于荧光显微镜下观察拍照观察。
扫描电镜观察细菌形貌：置于培养箱中孵育3 h后，使用2.5%戊二醛溶液在4 ℃下固定水凝胶样品24 h，分别经体积分数60%，70%，80%，90%，100%乙醇溶液中梯度脱水30 min，干燥后于扫描电镜下观察水凝胶表面的细菌形貌。
1.4.6 水凝胶的细胞相容性检测
实验分组：将4组水凝胶灭菌后分别置于24孔板内，将第3代MC3T3-E1细胞以1×104/孔的密度接种于孔板中，每孔加入1 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青/链霉素的α-MEM培养基培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育，每2 d更换1次培养基。
活/死染色：共培养3，5 d后吸弃培养基，每孔加入500 µL 1×Assay Buffer和0.5 µL LiveDye及0.5 µL NucleiDye混合染色液于37 ℃避光孵育15 min，置于荧光显微镜下观察并拍照。
CCK-8检测：共培养1，4，7 d后吸弃培养基，按说明书配置CCK-8检测液与α-MEM培养基的混合液，向每孔加入400 µL混合液后孵育1 h，每孔取100 µL液体，使用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，评估细胞增殖。
1.4.7 水凝胶的促成骨分化能力检测
实验分组：将4组水凝胶灭菌后分别置于24孔板内，将第3代MC3T3-E1细胞以1×104/孔的密度接种于孔板中，每孔加入1 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青/链霉素的α-MEM培养基培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育。培养第3天，更换为成骨诱导培养基(含50 mmol/L L-抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、100 nmol/L地塞米松和体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素的α-MEM培养基)继续培养。每2 d更换1次培养基。
碱性磷酸酶染色：成骨诱导培养7 d后吸弃培养基，多聚甲醛固定15 min，每孔加入1 mL BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色液避光孵育30 min，置于体视显微镜下观察。同时，根据碱性磷酸酶试剂盒说明书进行碱性磷酸酶活性定量检测，使用多功能酶标仪检测405 nm波长处的吸光度值，根据标准曲线计算相对碱性磷酸酶含量。
茜素红S染色：成骨诱导培养14 d后吸弃培养基，多聚甲醛固定15 min，每孔加入1 mL茜素红S染色液孵育30 min，置于体视显微镜下观察钙结节形成情况并拍照。拍照结束后吸弃茜素红S染色液，并向孔板内加入400 µL 10%氯代十六烷基吡啶溶液，待钙结节完全溶解后吸取100 µL溶液于96孔板中，使用多功能酶标仪检测562 nm波长处的吸光度值。

成骨相关基因表达测定：成骨诱导培养10 d后消化细胞，按照RNA离心柱法试剂盒说明书步骤操作提取细胞RNA，反转录为cDNA，进行qPCR扩增分析，反应条件：95 ℃变性3 min，95 ℃反应15 s，60 ℃反应15 s，75 ℃反应30 s，循环40次。相关引物碱基序列见表1。

1.5 主要观察指标各组水凝胶的理化性质、抗菌性能、细胞相容性与促成骨分化能力。
1.6 统计学分析所有数据均由3次独立实验中获得，采用x±s格式表示。采用GraphPad Prism 9.5.0软件进行统计分析，两组间比较进行t检验分析，多组间比较使用单因素方差分析。P < 0.05为组间差异有显著性意义。该文统计学方法已经川北医学院生物统计学专家审核。

讨论

甲基丙烯酰化明胶水凝胶因具备可注射性与光交联特性可适配不同形状及尺寸的缺损部位，可作为支架应用于骨缺损的填充修复，然而甲基丙烯酰化明胶水凝胶的单独使用也存在临床局限性，如机械性能差、缺乏抗菌及成骨功能等[9-11]。近年来，许多学者对甲基丙烯酰化明胶水凝胶进行改性处理以应对临床需求，例如：ZHANG等[31]开发了一种模块化微针贴片，这种贴片将抗生素负载在甲基丙烯酰化明胶水凝胶中，植入局部组织后通过贴片中抗生素的爆发释放来减少细菌含量，但抗生素的突释可能会导致局部药物浓度过高，增加细胞毒性；SUN等[32]使用还原沉积法在氧化石墨烯纳米颗粒表面上种植Ag离子，并将Ag/氧化石墨烯纳米颗粒封装到甲基丙烯酰化明胶水凝胶中设计的Ag/氧化石墨烯-甲基丙烯酰化明胶平台，以用于促进感染性伤口愈合，但Ag的促成骨能力较弱，在面对骨缺损修复时不能促进成骨细胞的成骨分化。前期研究已对Cu2+、Zn2+掺杂羟基磷灰石进行了一系列探索，发现该材料在成骨方面表现优良[33-34]，此次研究EGCG与双离子掺杂羟基磷灰石共同引入甲基丙烯酰化明胶水凝胶，旨在开发一款高力学强度、成骨、抗菌三位一体的复合水凝胶材料。
羟基磷灰石作为正常骨组织的主要无机成分具有良好的生物相容性，并且羟基磷灰石中Ca2+和OH-可以被其他原子取代而不改变晶体结构[13]。大量研究表明，离子掺杂有利于改善羟基磷灰石的物理化学性能及生物功能，例如，SALAM等[35]使用水沉淀法将锂离子(Li)引入羟基磷灰石中，该材料在与人间充质干细胞共培养时所释放的锂离子可协同羟基磷灰石加速成骨分化。因此，此次研究采用Cu2+和Zn2+对羟基磷灰石进行改性。Zn2+能够促进碱性磷酸酶的活性，加速成骨细胞的矿化过程[36]；同时，Cu2+、Zn2+均能够与细菌菌膜上的蛋白质和酶结合破坏细菌结构和功能，从而进入细菌细胞内部，干扰细菌的代谢过程[22]；但Cu2+对于抗菌具有剂量依赖性，高浓度Cu2+在具备高抗菌性的同时也具有细胞毒性[37]。此次研究通过化学沉淀法成功制备了具备抗菌兼成骨功能的双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒，傅里叶变化红外光谱、X射线光电子能谱、X射线衍射和扫描电镜分析结果显示，双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒制备成功且无其他杂质形成。在此基础上，将EGCG和双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒共同引入到甲基丙烯酰化明胶水凝胶中，形成可适配各种骨缺损且兼具抗菌成骨性能的复合水凝胶，宏观图像表明各组水凝胶均具备良好的可交联性；扫描电镜显示G、G-E、G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶均具有疏松多孔的微观内部结构，双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒的加入使得G-Cu/Zn HA和G-E-Cu/Zn HA水凝胶孔壁的粗糙度增加，水凝胶内部的多孔网状结构有利于营养物质的输送，也有助于提升水凝胶的力学强度，而粗糙的表面更有利于细胞在水凝胶壁上的黏附，促进细胞增殖[11]。水凝胶压缩实验显示，G-E-Cu/Zn HA水凝胶的压应力高达41.03 kPa，较G、G-E和G-Cu/Zn HA水凝胶分别增高了291.5%，217.8%，73.6%；这是因为双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒可改善水凝胶的共价交联网络结构，提高水凝胶与其内部水分子的相互作用力；并且Cu2+和Zn2+通过对水凝胶的配位极大加强了力学性能。尤其是Zn2+，可与水凝胶上的氨基、咪唑氮、去质子化羧酸根等基团以四配位和六配位共存，这使Zn2+与基团之间的配位能力更强[22]，因此，与其他金属离子相比，与Zn2+配位的水凝胶能有效实现应力分散，保持水凝胶的高弹性，显著提高水凝胶的抗压缩性能。在共价交联网络的基础上，EGCG和双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒螯合后形成第二网络，双网络结构可以增强水凝胶的内聚力并达到足够的应力分散，从而增强水凝胶的弹性，极大提高了水凝胶的极限压缩应变[38]。水凝胶的溶胀及降解实验显示，G-E-Cu/Zn HA水凝胶整体溶胀时间变短、溶胀平衡率降低、降解周期延长，这主要归因于EGCG中的–OH基团与甲基丙烯酰化明胶的-C=O基团作用形成的丰富氢键以及EGCG与Cu2+、Zn2+的螯合作用，协同作用使得水凝胶内部的交联网络变得更为密集[39]。金属离子释放动力学实验显示，加入双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗粒后，G-Cu/Zn HA、G-E-Cu/Zn HA水凝胶在30 d内表现为持续释放Cu2+、Zn2+、Ca2+的趋势，并且G-Cu/Zn HA水凝胶中释放的Cu2+、Zn2+总量较G-E-Cu/Zn HA水凝胶多。值得关注的是，第2天时G-Cu/Zn HA水凝胶中Cu2+释放总量约比G-E-Cu/Zn HA水凝胶多0.71 μg，这是由于G-E-Cu/Zn HA水凝胶中EGCG的B环含有2个相邻的酚羟基，与Cu2+形成稳定的五元环螯合物，降低了G-E-Cu/Zn HA水凝胶中Cu2+的突释现象[30]。FOWLER等[40]系统研究了Cu2+浓度对MC3T3-E1细胞的毒性效应，研究结果表明，当Cu2+质量浓度低于9 μg/mL时不会对MC3T3-E1细胞的增殖活性产生显著抑制作用，此次研究结果显示，G-Cu/Zn HA水凝胶和G-E-Cu/Zn HA水凝胶所释放的Cu2+浓度均低于该阈值，因此不会显著抑制MC3T3-E1细胞的增殖能力。EGCG释放动力学实验显示，由于水凝胶网络在溶胀初期因渗透压差异形成快速扩散通道，导致G-E水凝胶中EGCG发生突释，形成非线性的释放行为；而当双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗中的Cu2+、Zn2+与EGCG螯合后，G-E-Cu/Zn HA水凝胶中EGCG的突释现象得到显著改善，表明单纯物理吸附主导的负载策略难以实现甲基丙烯酰化明胶水凝胶中EGCG的长效控释，通过与金属离子螯合可优化复合水凝胶中EGCG的释放动力学[39]。
细菌在植入物表面容易形成生物膜，这是由细菌分泌的胞外聚合物等物质组成的复杂结构，生物膜可以保护细菌免受抗生素和免疫细胞的攻击，使细菌在植入物表面得以长期存活和繁殖，从而增加感染的风险[41]，因此，避免细菌黏附在植入物表面的对于骨再生至关重要。为研究水凝胶的抗菌性能，此次实验采用细菌琼脂平板涂布、活死染色及扫描电镜检测水凝胶对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抗菌性能，细菌琼脂平板涂布结果显示，G-E组、G-Cu/Zn HA组、G-E-Cu/Zn HA组对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为(63.8±5.5)%，(91.9±3.0)%，(96.4±1.7)%，于大肠杆菌的抑菌率分别为(73.5±4.4)%，(82.6±2.3)%，(91.1±1.2)%。细菌活死染色显示，相较于G组，G-E组、G-Cu/Zn HA组、G-E-Cu/Zn HA组金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均表现为活细菌减少、死细菌增多，特别是当EGCG和双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗同时载入水凝胶后，G-E-Cu/Zn HA组细菌大部分出现死亡，仅极少量存活。扫描电镜观察显示，G-E组、G-Cu/Zn HA组、G-E-Cu/Zn HA组水凝胶表面的金黄色葡萄球菌及大肠杆菌数量减少，密度远低于G组，并且细菌菌膜发生了不同程度的皱缩破裂。对于植入物释放Cu2+的抗菌机制，ZHAO等[42]基于氧和氮等离子体的表面改性在Ti-Cu合金上合成了纳米结构TiCuNxOy涂层，该涂层主要依靠Cu2O/CuO与细菌接触后释放Cu2+对细菌生物膜破坏溶解进行灭菌，抗菌活性≥99.9%。HU等[20]的研究采用顺序交联构建了负载新型茶多酚镁纳米颗粒的多功能双网络水凝胶，这种水凝胶可以通过酚类和聚合物之间的氢键作用增强水凝胶的机械强度，并且该水凝胶可以有效穿透细菌生物膜，通过剂量依赖性方式对生物膜的完整性进行破坏，生物膜破坏率接近60%，从而干扰细菌的代谢过程，破坏细菌增殖。此次实验观察到单独加入EGCG或双离子掺杂羟基磷灰石纳米颗的水凝胶都可对细菌的存活产生抑制作用，而在两者协同作用下对细菌的抑制作用更强。
在赋予水凝胶抗菌功能的同时，此次实验利用活/死染色、CCK-8实验来评价水凝胶植入物的细胞相容性，结果各组水凝胶均无明显的细胞毒性，有利于细胞的增殖并保持其活性，并且G-E-Cu/Zn HA水凝胶可促进成骨细胞前体细胞的增殖。碱性磷酸酶作为评估成骨分化的早期标志物，其活性高低反映了成骨细胞的分化程度[43]。此次研究结果显示，G-E-Cu/Zn HA组碱性磷酸酶含量分别较G组、G-E组和G-Cu/Zn HA组增高了61.1%，32.9%，22.0%，这可能是由于羟基磷灰石提供的钙、磷元素促进了类骨磷灰石晶体的形成和沉积[12]。成骨细胞表型是分2个阶段特异性获得的：在第一阶段，细胞增殖且基质成熟，与骨细胞表型有关的特定蛋白质(例如碱性磷酸酶) 可以在细胞增殖和基质成熟过程中检测到；在第二阶段，基质矿化并表达成骨后期标志物，比如骨钙素和骨桥蛋白[44]。最后，多种合成代谢信号通路积极参与控制骨形成，例如骨形态发生蛋白、Wnt和RUNX2通路[45]。G-E-Cu/Zn HA组中碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2 mRNA表达上调，表明G-E-Cu/Zn HA水凝胶具有优异的促MC3T3-E1细胞成骨分化能力。前期研究制备了同时携载Cu2+/Zn2+的双相磷酸钙陶瓷支架，发现Cu2+/Zn2+加入量会影响双相磷酸钙陶瓷支架的表面形貌以及羟基磷灰石/β-磷酸三钙比例，进而影响双相磷酸钙陶瓷支架的降解速率，从而影响干细胞行为及骨缺损修复能力[34]。另外，Cu2+、Zn2+可协同羟基磷灰石上调成骨相关基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙素、osterix基因的表达，这些蛋白参与了骨缺损修复环节矿化结节的形成和生长，加速了新骨形成[33]。此外，EGCG的抗氧化作用能够减少骨缺损部位细胞氧化应激对矿化过程的负面影响，进一步促进矿化结节的形成[30]。
综上所述，此次实验成功制备了EGCG修饰的双离子掺杂羟基磷灰石/甲基丙烯酰化明胶复合水凝胶，该水凝胶在共价交联网络的基础上，通过EGCG酚羟基与双离子掺杂羟基磷灰石中Cu2+、Zn2+螯合，有效增强了复合水凝胶的力学性能，并且在保留EGCG和Cu2+、Zn2+抗菌效应的同时协同上调MC3T3-E1细胞的成骨分化能力，这种复合水凝胶在临床骨缺损修复中具有多重应用潜力，可注射特性使它适用于复杂形态的感染性骨缺损填充，如开放性骨折清创后的不规则空腔修复以及骨髓炎病灶切除后的抗菌-成骨一体化治疗。然而，该实验尚存在一些不足：对EGCG协同Cu2+、Zn2+抗菌及促成骨性能的分子机制还需进一步深入研究；还应构建体内骨缺损、骨感染等模型实验，以验证复合水凝胶的体内成骨和抗菌作用。尽管如此，该实验为制备具有抗菌兼成骨功能的甲基丙烯酰化明胶水凝胶提供了一种有效策略，有望应用于临床骨缺损。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

兼具抗菌与促成骨功能水凝胶的制备与表征

Fabrication and characterization of hydrogels with both antibacterial and osteogenic functions

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