绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜的促成骨效应

doi:10.12307/2026.566

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
绿原酸蛋白微球：绿原酸是一种天然化合物，可从咖啡豆、葵花子、金银花、杜仲等植物提取，具有抗菌、抗病毒、成骨等作用，但水溶性差影响了其药效发挥。此次实验以牛血清蛋白和壳聚糖为原料，采用去溶剂法和静电吸附技术合成绿原酸载药微球。
静电纺丝技术：是一种利用高分子液体在强电场作用下形成喷射流，进而制备纳米或微米级纤维的先进技术。静电纺丝技术适用于多种聚合物材料，包括天然高分子、合成高分子及生物可降解高分子等。

背景：绿原酸具有抗菌、抗病毒、促成骨等作用，但水溶性较差限制了其生物活性。
目的：观察绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜的促成骨效应。
方法：①以绿原酸、牛血清蛋白和壳聚糖为原料，通过去溶剂法和静电吸附技术制备绿原酸蛋白微球。表征绿原酸蛋白微球的微观形貌、粒径大小、Zeta电位与药物包封率。将对数生长期的MC3T3-E1细胞分3组培养：对照组不进行任何处理，绿原酸组加入10 mg/L绿原酸，绿原酸蛋白微球组加入50 mg/L绿原酸蛋白微球，检测细胞增殖、成骨诱导后的碱性磷酸酶活性以及过氧化氢诱导氧化应激下的活性氧水平。②利用静电纺丝技术分别制备聚己内酯静电纺丝膜与绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜，扫描电镜观察静电纺丝膜的微观形貌。将对数生长期的MC3T3-E1细胞分4组培养：对照组不进行任何处理，绿原酸组加入10 mg/L绿原酸，聚己内酯组加入聚己内酯静电纺丝膜，微球纺丝膜组加入绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜，成骨诱导 7 d后，RT-qPCR检测RUNX2、碱性磷酸酶mRNA表达，Western blot检测RUNX2、碱性磷酸酶蛋白表达。
结果与结论：①绿原酸蛋白微球为表面光滑的双层结构，粒径较为均一，平均粒径(322.38±8.39) nm，Zeta电位为(42.85±2.11) mV，药物包封率为(57.16±7.32)%。绿原酸与绿原酸蛋白微球均可促进MC3T3-E1细胞增殖与早期成骨分化，降低氧化应激反应的活性氧水平。②两组静电纺丝膜均为孔隙较多的3D网状结构，聚己内酯静电纺丝表面较光滑，纺丝直径也较为一致，绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜表面出现较多球状突起，纺丝直径差异较大。绿原酸与绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、碱性磷酸酶mRNA与蛋白表达。结果表明，绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。
https://orcid.org/0009-0007-9282-7599(孙蕾)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 绿原酸">, MC3T3-E1细胞">, 成骨">, 蛋白微球">, 静电纺丝">, 细胞增殖">, 细胞分化">, 工程化骨材料

Abstract: BACKGROUND: Chlorogenic acid has antibacterial, antiviral, and osteogenic properties. However, its limited solubility in water restricts its biological activity.
OBJECTIVE: To observe the osteogenic effect of chlorogenic acid protein microspheres/polycaprolactone electrospinning membranes.
METHODS: (1) Chlorogenic acid, bovine serum albumin and chitosan were used as raw materials to prepare chlorogenic acid protein microspheres by desolventization method and electrostatic adsorption technology. The micromorphology, particle size, Zeta potential, and drug encapsulation efficiency of chlorogenic acid protein microspheres were characterized. MC3T3-E1 cells in the logarithmic growth phase were divided into three groups for culture: the control group was not treated with any treatment; the chlorogenic acid group was added with 10 mg/L chlorogenic acid; the chlorogenic acid protein microsphere group was added with 50 mg/L chlorogenic acid protein microspheres. Cell proliferation, alkaline phosphatase activity after osteogenic induction and reactive oxygen levels under hydrogen peroxide-induced oxidative stress were detected. (2) Polycaprolactone electrospinning membrane and chlorogenic acid protein microsphere/polycaprolactone electrospinning membrane were prepared by electrospinning technology. The microscopic morphology of the electrospinning membrane was observed by scanning electron microscopy. MC3T3-E1 cells in the logarithmic growth period were divided into four groups for culture: the control group was not treated with any treatment; the chlorogenic acid group was added with 10 mg/L chlorogenic acid; the polycaprolactone group was added with polycaprolactone electrospinning membrane; the microsphere spinning membrane group was added with chlorogenic acid protein microsphere/polycaprolactone electrospinning membrane. After 7 days of osteogenic induction, RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of Runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and alkaline phosphatase. Western blot assay was used to detect the protein expression of RUNX2 and alkaline phosphatase.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The chlorogenic acid protein microspheres exhibited a double-layer structure with a smooth surface and relatively uniform particle size, averaging (322.38±8.39) nm. The Zeta potential of the microspheres was measured at (42.85±2.11) mV and the drug encapsulation efficiency was found to be (57.16±7.32)%. Both chlorogenic acid and chlorogenic acid protein microspheres could promote the proliferation and early osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells and reduce the level of reactive oxygen species in oxidative stress response. (2) Both groups of electrospun membranes were 3D mesh structures with more pores. The surface of polycaprolactone electrospun membranes was smoother and the spinning diameter was more consistent. The surface of chlorogenic acid protein microspheres/polycaprolactone electrospun membranes showed more spherical protrusions and the spinning diameter was quite different. Both chlorogenic acid and chlorogenic acid protein microspheres/polycaprolactone electrospun membranes could increase the mRNA and protein expression of RUNX2 and alkaline phosphatase in MC3T3-E1 cells. The results show that chlorogenic acid protein microspheres/polycaprolactone electrospinning membranes can promote the osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.

Key words: chlorogenic acid">, MC3T3-E1 cell">, osteogenesis">, protein microsphere">, electrospinning">, cell proliferation">, cell differentiation">, engineered bone material

中图分类号:

孙蕾, 张琦, 张宇. 绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜的促成骨效应[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 1877-1884.

Sun Lei, Zhang Qi, Zhang Yu. Pro-osteoblastic effect of chlorogenic acid protein microsphere/polycaprolactone electrospinning membrane[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(8): 1877-1884.

图/表（结果） 10

2.1 绿原酸蛋白微球的微观形貌观察结果扫描电镜下可见绿原酸蛋白微球为表面光滑、粒径较为均一的球形结构，微球较分散，无明显粘连，见图1。透射电镜下可见绿原酸蛋白微球为外层壳聚糖包裹的双层结构，外层壳聚糖包裹致密均匀，可在形态结构上有效控制药物缓释，见图2。

2.2 绿原酸蛋白微球粒径及Zeta电位检测结果绿原酸蛋白微球的平均粒径为(322.38±8.39) nm，大部分粒径集中在230-373 nm之间，分布较为均匀，见图3。绿原酸蛋白微球的Zeta电位为(42.85±2.11) mV，提示制备的微球具有良好的稳定性，不易凝聚。

2.3 绿原酸蛋白微球的包封率检测结果绿原酸的标准曲线及回归方程：y=0.033 2x-0.279 3，R2=0.973 7，药物质量浓度范围为10-60 μg/mL的线性关系强，见图4。绿原酸蛋白微球的平均包封率为(57.16±7.32)%，表明包封成功。

2.4 绿原酸和绿原酸蛋白微球可促进MC3T3-E1细胞增殖 CCK-8检测结果显示，培养1 d后，各组细胞增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养4，7 d后，绿原酸组、绿原酸蛋白微球组细胞增殖快于对照组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，绿原酸组、绿原酸蛋白微球组培养7 d后的细胞增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.5 绿原酸和绿原酸蛋白微球可促进MC3T3-E1细胞早期分化培养1 d后，各组细胞内碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养7，14 d后，绿原酸组、绿原酸蛋白微球组细胞内碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05，P < 0.01)，绿原酸组、绿原酸蛋白微球组细胞内碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

2.6 绿原酸和绿原酸蛋白微球可减轻MC3T3-E1细胞内氧化应激水平活性氧荧光探针显示，绿原酸组、绿原酸蛋白微球组细胞内活性氧水低于对照组(P < 0.001，P < 0.05)，绿原酸蛋白微球组细胞内活性氧水平高于绿原酸组(P < 0.01)，见图7。

2.7 静电纺丝膜扫描电镜观察结果扫面电镜下可见两组静电纺丝均为孔隙较多的3D网状结构，聚己内酯静电纺丝表面较光滑，纺丝直径也较为一致；绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝表面出现较多球状突起，并且纺丝直径差异较大，见图8。

2.8 静电纺丝膜对MC3T3-E1细胞分化的影响
RT-qPCR检测：与对照组相比，绿原酸组、聚己内酯组、微球纺丝膜组细胞内碱性磷酸酶、RUNX2 mRNA表达均升高(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)；与聚己内酯组相比，绿原酸组、微球纺丝膜组细胞内碱性磷酸酶、RUNX2 mRNA表达均升高(P < 0.01)；绿原酸组、微球纺丝膜组细胞内碱性磷酸酶、RUNX2 mRNA表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图9。

Western blot 检测：与对照组相比，绿原酸组、聚己内酯组、微球纺丝膜组细胞内碱性磷酸酶、RUNX2 蛋白表达均升高(P < 0.001)；与绿原酸组相比，聚己内酯组、微球纺丝膜组细胞内碱性磷酸酶、RUNX2 蛋白表达均降低(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)；聚己内酯组、微球纺丝膜组细胞内碱性磷酸酶、RUNX2 蛋白表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图10。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，组间比较进行t检验或单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2023年9月至2024年10月在齐鲁医药学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 MC3T3-E1细胞系购自大连美仑生物技术有限公司，培养于含1%青霉素-链霉素、体积分数10%胎牛血清的低糖α-MEM培养基(完全培养基)中，常规换液、传代。实验采用对数生长期的细胞。
1.3.2 实验试剂与仪器绿原酸、牛血清白蛋白(美仑，中国)；α-MEM 培养基、活性氧检测试剂盒(Servicebio，中国)；CCK-8检测试剂盒(同仁，日本)；壳聚糖(Sigma，美国)；碱性磷酸酶活性检测试剂盒(碧云天，中国)；聚己内酯(Macklin，中国)；GAPDH(Diagbio，中国)；碱性磷酸酶、RUNX2抗体(Abcam，美国)；BCA蛋白质测定试剂盒(P0010，上海碧云天生物技术有限公司)；2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯探针(贝博生物)；过氧化氢(华新制药)；二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(国药集团)；PVDF膜(Millipore，美国)；扫描电镜(日立su8010，日本)；透射电镜(Tecnai G2，美国)；纳米粒度仪(马尔文帕纳科，英国)；酶标仪(Multiskan SkyHigh，美国)；荧光显微镜(MSHOT MF43-N，中国)；直流高压电(泰思曼，大连)；微量注射泵(好来宝，济南)；紫外分光光度计(赛默飞，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 绿原酸蛋白微球的合成将100 mg牛血清白蛋白磁力搅拌溶于10 mL ddH2O中制备牛血清白蛋白溶液。将5 mg绿原酸溶于1 mL无水乙醇中制备绿原酸溶液。使用微量注射泵将绿原酸溶液泵入牛血清白蛋白溶液中，滴加速度为60 mL/h，然后再以30 mL/h的速度将40 mL无水乙醇滴加到牛血清白蛋白-绿原酸混合溶液中，此为A液。将3 mL乙酸加入到47 mL ddH2O中制备乙酸溶液，称取50 mg壳聚糖磁力搅拌溶于乙酸溶液中，此为B液。使用微量注射泵将40 mL B液加入A液中，滴加速度为30 mL/h，磁力搅拌8 h；将最终制备的溶液在12 000 r/min离心15 min，向沉淀物中加入15 mL去离子水/无水乙醇(体积比50/50)混合溶液超声振荡20 min，至沉淀完全溶解，此步骤重复3次，直至离心后的上清液清澈，向最终沉淀物中加入2 mL离子水/无水乙醇(体积比50/50)混合溶液溶解沉淀，得到绿原酸蛋白微球溶液，将溶液冷冻干燥为冻干粉后置于4 ℃保存。收集每次离心后的上清液并混匀，置于4 ℃保存。
1.4.2 绿原酸蛋白微球的微观形貌
扫描电镜观察微球表面形态：抽取绿原酸蛋白微球溶液20 μL，用无水乙醇稀释200倍，取一滴稀释后的液体滴在5 mm×5 mm大小的锡箔纸上，置于扫描电镜下观察微球的形貌特征。
透射电镜观察微球内部结构：抽取绿原酸蛋白微球溶液20 μL，用无水乙醇稀释200倍，取一滴稀释后的液体滴在铜网上，置于无菌通风口风干，置于透射电镜下观察。
1.4.3 绿原酸蛋白微球的粒径、Zeta 电位分析称取适量绿原酸蛋白微球冻干粉溶解于无水乙醇中，采用纳米粒度仪测量粒径分布与Zeta电位，调整各项参数：测试温度(25 ℃)，测量模式选择(通用模式)，测量次数(3次)。
1.4.4 绿原酸蛋白微球的包封率检测在290 nm 波长范围内测量绿原酸的吸光度值[11]。取10，20，30，40，50，60 μg/mL的绿原酸溶液(溶剂为无水乙醇)，分别在最大吸收波长处测定各溶液的吸光度(A)值，通过线性回归建立绿原酸标准曲线及回归方程。取绿原酸蛋白微球制备时收集的上清液，利用紫外分光光度计测量吸光度值，代入绿原酸回归方程，确定游离绿原酸含量，进而确定纳米粒的包封率。包封率=(绿原酸总质量-绿原酸游离质量)/绿原酸总质量×100%。
1.4.5 绿原酸蛋白微球对MC3T3-E1细胞增殖的影响将MC3T3-E1细胞以3×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板内，每孔200 μL细胞悬液，分3组培养：对照组不进行任何处理，绿原酸组加入10 mg/L绿原酸[3]，绿原酸微球组加入50 mg/L绿原酸蛋白微球，每组5复孔。培养1，4，7 d后，每孔加入100 μL CCK-8与培养基混合液(体积比1∶9)，放入细胞培养箱中继续培养4 h，使用酶标仪在450 nm波长处测定A值。
1.4.6 绿原酸蛋白微球对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响将MC3T3-E1细胞以3×107 L-1的细胞浓度接种在6孔板内，每孔1 mL细胞悬液，分3组培养：对照组不进行任何处理，绿原酸组加入10 mg/L绿原酸[3]，绿原酸微球组加入50 mg/L绿原酸蛋白微球，每组3复孔。培养24 h后，更换为含成骨诱导液(10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05 mmol/L维生素C、100 mmol/L地塞米松)的完全培养基。成骨诱导培养1，7，14 d后，每孔加入细胞裂解液覆盖住细胞并充分裂解，12 000 r/min离心15 min后取上清液，使用酶标仪检测波长为405 nm处的A值。
1.4.7 绿原酸蛋白微球对氧化应激条件下MC3T3-E1细胞活性氧水平的影响将2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯探针以1∶1 000的比例用无血清α-MEM低糖培养基稀释。将MC3T3-E1细胞以3×104/孔的密度接种于6孔板内，在37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中孵育24 h，直至细胞贴壁，加入0.5 mmol/L过氧化氢干预8 h以诱导氧化应激反应[12]，8 h后去除过氧化氢，分组处理(分组处理同1.4.6)。培养24 h后除去细胞培养基，每孔加入2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯探针工作液2 mL于37 ℃下孵育2 min，用无血清细胞培养基洗涤3次，置于荧光显微镜下观察，利用Image J软件对荧光染色面积进行定量分析。
1.4.8 绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜的制备
聚己内酯静电纺丝膜的制备：称取1.575 g聚己内酯溶于6 mL二氯甲烷和4.5 mL N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，避光搅拌至少8 h，制备电纺丝溶液。用10 mL注射器吸取电纺丝溶液固定在微量注射泵中，通过聚氯乙烯管与9号针(内径0.6 mm)连接，直流高压电正极接针尖，负极接接收板并接地，进行静电纺丝：流量3 mL/h，电压(25±0.5) kV，针距接收板20 cm。真空干燥箱中干燥24 h。
绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜的制备：称取1.575 g 聚己内酯溶于6 mL二氯甲烷；称取100 mg绿原酸蛋白微球冻干粉溶于4.5 mL N，N-二甲基甲酰胺中；用微量注射泵将绿原酸蛋白微球-N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加到含有聚己内酯的二氯甲烷混合溶液中，磁力搅拌至少8 h，制备电纺丝溶液。用10 mL注射器吸取电纺丝溶液固定在微量注射泵中，通过聚氯乙烯管与9号针(内径0.6 mm)连接，直流高压电正极接针尖，负极接接收板并接地，进行静电纺丝：流量3 mL/h，电压(25±0.5) kV，针距接收板20 cm。真空干燥箱中干燥24 h。
1.4.9 静电纺丝膜的扫描电镜观察将聚己内酯静电纺丝膜、绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜切成 5 mm×5 mm 大小，粘接到金属装载平台上，喷金 20 s，在 20 kV 扫描电镜下收集图像。
1.4.10 静电纺丝膜对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响
实验分组：将MC3T3-E1细胞以3×107 L-1的细胞浓度接种在6孔板内，每孔1 mL细胞悬液，分4组培养：对照组不进行任何处理，绿原酸组加入10 mg/L绿原酸，聚己内酯组加入聚己内酯静电纺丝膜，微球纺丝膜组加入绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜，每组3复孔。培养24 h后，更换为含成骨诱导液(10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05 mmol/L维生素C、100 mmol/L地塞米松)的完全培养基。
RT-qPCR检测碱性磷酸酶、RUNX2 mRNA表达：成骨诱导培养7 d后，提取各组细胞总RNA，通过紫外-可见光分光光度计检测各组A260/A280值均在1.8-2.1之间，参照反转录试剂盒说明书合成 cDNA。目的基因碱性磷酸酶、RUNX2及内参GAPDH的引物序列详见表1，RT-qPCR反应采用荧光染料法参照 SYBR Premix Ex Taq说明选择20 μL 体系：SYBRⅡ10 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物0.8 μL，RT反应液1.6 μL，DEPC水6.8 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，45个循环。收集荧光信号熔融曲线分析，采用荧光阈值代表RT-qPCR 结果，根据 2-ΔΔCt计算目的基因表达量，定义对照组基因表达量为 1，计算各基因的相对表达。
Western blot 检测碱性磷酸酶、RUNX2蛋白表达：成骨诱导培养7 d后，使用含苯甲基磺酰氟的RIPA缓冲液裂解各组细胞，将裂解物置于冰上 30 min，反复吹打以确保细胞完全裂解；在 4 ℃下12 000 r/min离心10 min，从上清液中提取总蛋白，使用BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白质在100 ℃下变性10 min，使用SDS-PAGE分离蛋白质，使用 PVDF 膜进行转移；使用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，然后将膜与碱性磷酸酶(1∶2 000)、RUNX2(1∶2 000)、GAPDH(1∶20 000)抗体分别在4 ℃孵育过夜，16 h后洗膜，再与相应的二抗(1∶3 000)孵育1 h，检测蛋白信号强度，使用Image J软件分析蛋白相对表达量。
1.5 主要观察指标绿原酸蛋白微球对MC3T3-E1细胞增殖、早期成骨分化及氧化应激条件下MC3T3-E1细胞内活性氧水平的影响，绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。
1.6 统计学分析应用 Prism 9软件进行统计处理。实验数据以 x±s表示，组间比较进行t检验或单因素方差分析。P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经由齐鲁医药学院生物统计学专家审核。

讨论

绿原酸为天然化合物，多来源于天然植物[13-14]，具有抗菌、抗病毒等作用[14-15]。近年来，绿原酸的促成骨作用是许多学者的研究焦点。绿原酸可抑制地塞米松诱导的小鼠MC3T3-E1成骨细胞凋亡[16]。在牙周炎相关研究中，负载绿原酸的纳米胶束可持续释放绿原酸，缓解小鼠牙周炎中的骨质流失[17]。FOLWARCZNA等[18]研究表明，高剂量的咖啡酸和绿原酸略微增加了胫骨矿化，改善了股骨骨干的机械性能。
绿原酸水溶性差的特点限制了其药物活性的发挥[19]。药物载体的制备可使绿原酸有效发挥药理作用，并可实现局部给药，有研究通过水包油微乳剂实现了有效局部递送绿原酸[20]，有研究制备的绿原酸-壳聚糖偶联物具有更好的溶解度和抗氧化活
性[21]。此次实验以牛血清蛋白、壳聚糖为原材料制备绿原酸蛋白微球，通过静电纺丝技术制备成药物载体，检测药物载体的成骨性能，为绿原酸促进成骨提供数据支持。
牛血清蛋白与壳聚糖具有良好的生物学性能，无免疫原性且价格低廉易得，是常用的药物载体材料[22-23]。此次实验以牛血清蛋白、壳聚糖为原材料，利用去溶剂法和静电吸附技术制备绿原酸蛋白微球，透射电镜观察显示制备的微球为双层球形结构，外层为壳聚糖包裹，双层结构有利于药物的包裹及控制药物缓释，制备的微球结构也更加稳定[24-25]。
扫描电镜观察下可见微球为粒径较为均一、分散的光滑球形结构，制备的微球平均粒径为(322.38±8.39) nm，Zeta电位为(42.85±2.11) mv，平均包封率为(57.16±7.32)%，提示制备的微球具有良好的稳定性，不易凝聚。说明实验通过去溶剂法和静电吸附技术成功制备出了具有均一粒径、稳定性好、具有双层结构的绿原酸蛋白微球。
经文献查阅，此前有实验证实，当绿原酸质量浓度为10 mg/L时对MC3T3-E1细胞具有成骨促进作用[3]，因此，此次实验绿原酸的处理质量浓度为10 mg/L。CCK-8细胞增殖检测结果显示，培养4 d后，绿原酸蛋白微球促MC3T3-E1细胞增殖的作用不如绿原酸，但培养7 d后绿原酸蛋白微球促细胞增殖作用与绿原酸相比无明显差异，可能与微球在培养液中缓释绿原酸导致培养液中绿原酸浓度增高有关，这也为绿原酸促成骨作用与浓度呈依赖性提供了证据。此次研究中碱性磷酸酶活性检测结果表明，绿原酸和绿原酸蛋白微球均可促进MC3T3-E1细胞的早期分化。王明娟等[1]研究发现，绿原酸可增加高糖作用下MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性。在氧化应激检测中，通过过氧化氢诱导MC3T3-E1细胞氧化应激反应，绿原酸和绿原酸蛋白微球干预后MC3T3-E1细胞内氧化应激程度均有下降，其中绿原酸组下降更为明显，该结果可能与绿原酸蛋白微球在短时间内药物缓释浓度不足有关，说明绿原酸的抗氧化应激能力与浓度有关。HAN等[26]研究表明，绿原酸可通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B介导的核转录因子E2相关因子2/血红素氧合酶1信号通路激活保护MC3T3-E1细胞免受氧化损伤。
静电纺丝技术也是目前药物载体制备的常用技术，此技术制备的纳米纤维载体具有超薄、稳定性强、疏松多孔等特点[27-28]。聚己内酯是一种大分子化合物，具有生物降解性和良好的生物相容性，常作为纳米纤维支架应用于骨骼、心血管、神经和皮肤组织工程[29-30]。此次实验通过静电纺丝技术将绿原酸蛋白微球与聚己内酯相结合制备了静电纺丝薄膜载体，扫描电镜显示未加入微球的静电纺丝直径较为均一且表面光滑，而微球加入后纺丝直径差异性较大，并且表面出现球形串珠状突起，这可能由于微球加入后堵塞针头导致单位时间内纺丝液通过针头的流速和流量不一致[31]。
将绿原酸蛋白微球载入聚己内酯静电纺丝后，RT-qPCR检测结果显示，绿原酸组和绿原酸微球纺丝组碱性磷酸酶、RUNX2 mRNA表达均上调，提示绿原酸可促进MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶、RUNX2 mRNA的表达，绿原酸微球纺丝组也可释放出一定量的绿原酸促进相关基因的表达，从而促进成骨细胞分化。朱灿等[3]也证明了绿原酸可以促进成骨相关基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙素、骨形态发生蛋白2、RUNX2和SMAD4 的mRNA 表达。
Western blot检测结果显示，绿原酸、绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜均可促进MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶、RUNX2蛋白的表达，其中以绿原酸的促进作用最为明显，原因可能也是由于7 d时绿原酸蛋白微球/聚己内酯静电纺丝膜累计释放绿原酸的浓度较低，所以促进作用不如绿原酸。
此次实验采用性能优良、廉价易得的牛血清白蛋白、壳聚糖成功制备出了绿原酸蛋白微球，用静电纺丝技术制备了药物载体，并验证了药物载体的促成骨作用，但实验未检测药物载体的药物释放规律，接下来将会对此载体进行详细的性能研究并优化载药量，为绿原酸促成骨研究提供合适的载体选择。
通过去溶剂法和静电吸附技术可成功制备双层、粒径均一、稳定的绿原酸蛋白微球，促进成骨细胞的增殖分化，减少氧化应激；通过静电纺丝技术制备的绿原酸微球纺丝载体，也可促进成骨细胞相关成骨基因和蛋白的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程