α-酮戊二酸工程化小细胞外囊泡延缓皮肤衰老

doi:10.12307/2026.538

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (1): 120-129.doi: 10.12307/2026.538

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α-酮戊二酸工程化小细胞外囊泡延缓皮肤衰老

吴芷菁1，2，李加利1，2，张佳昕1，2，王唐蓉1，2，郑煜洲1，2，孙梓暄1，2

1江苏大学医学院检验医学系，江苏省镇江市 212013；2镇江市外泌体基础与转化应用高技术研究重点实验室，江苏省镇江市 212013

收稿日期:2024-11-15 接受日期:2025-01-21 出版日期:2026-01-08 发布日期:2025-07-02
通讯作者: 孙梓暄，博士，副教授，硕士研究生导师，江苏大学医学院检验医学系，江苏省镇江市 212013；镇江市外泌体基础与转化应用高技术研究重点实验室，江苏省镇江市 212013
作者简介:吴芷菁，女，2001年生，江苏省江阴市人，汉族，江苏大学在读硕士，主要从事小细胞外囊泡与损伤修复方向的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82003379)，项目负责人：孙梓暄

Alpha-ketoglutarate engineered small extracellular vesicles delay skin aging

Wu Zhijing1, 2, Li Jiali1, 2, Zhang Jiaxin1, 2, Wang Tangrong1, 2, Zheng Yuzhou1, 2, Sun Zixuan1, 2

1Department of Laboratory Medicine, Medical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China; 2Zhenjiang Key Laboratory of High Technology Research on Exosomes Foundation and Transformation Application, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China

Received:2024-11-15 Accepted:2025-01-21 Online:2026-01-08 Published:2025-07-02
Contact: Sun Zixuan, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Laboratory Medicine, Medical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China; Zhenjiang Key Laboratory of High Technology Research on Exosomes Foundation and Transformation Application, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China
About author:Wu Zhijing, Master candidate, Department of Laboratory Medicine, Medical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China; Zhenjiang Key Laboratory of High Technology Research on Exosomes Foundation and Transformation Application, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82003379 (to SZX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

小细胞外囊泡：是由细胞分泌的一种直径小于200 nm的具有双层膜结构的纳米囊泡，其中含有蛋白质、核酸和脂质等生物活性成分，在损伤修复方面有巨大的应用前景。
α-酮戊二酸：是一种小分子化合物，参与三羧酸循环，调节细胞能量代谢，作为多种氨基酸的前体，α-酮戊二酸不仅能直接供能还参与多种化学反应。

摘要
背景：无细胞疗法是当今医疗美容抗衰领域的研究热点，人脐带间充质干细胞旁分泌的小细胞外囊泡装载抗衰药物α-酮戊二酸延缓皮肤衰老的作用仍然未知。
目的：探究抗衰老剂α-酮戊二酸工程化人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡在D-半乳糖诱导的真皮成纤维细胞衰老模型中的作用效果。
方法：①通过成骨、成脂分化实验和流式细胞术对原代人脐带间充质干细胞进行生物学特征鉴定；②使用差速-超速离心法获取人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡，使用电穿孔技术构建α-酮戊二酸工程化人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡，通过透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析仪进行生物学特征鉴定，同时使用高效液相色谱技术评估包封率；③通过CCK-8和Edu细胞增殖检测试剂盒评估α-酮戊二酸对真皮成纤维细胞增殖能力的影响；④使用活性氧检测试剂盒、Western blot、细胞免疫荧光等评价α-酮戊二酸工程化人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡延缓真皮成纤维细胞衰老的作用效果。
结果与结论：①所获取的人脐带间充质干细胞以及人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡符合生物学特征；②当α-酮戊二酸的使用浓度范围在0.5-8 mmol/L时，对真皮成纤维细胞无毒性作用；③D-半乳糖诱导了真皮成纤维细胞的衰老，而α-酮戊二酸工程化人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡处理可以降低真皮纤维细胞氧化应激水平、减少DNA损伤、减少胶原蛋白流失，进一步验证了α-酮戊二酸工程化人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡可以有效延缓皮肤衰老进程。

https://orcid.org/0009-0002-7031-5094(吴芷菁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 小细胞外囊泡, 人脐带间充质干细胞, α-酮戊二酸, 衰老, 真皮成纤维细胞, 电穿孔, 氧化应激, DNA损伤, 工程化细胞外囊泡

Abstract: BACKGROUND: Cell-free therapy is a research hotspot in the field of medical cosmetic anti-aging. It is still unknown for paracellular secretion of human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles loaded with the antiaging drug α-ketoglutaric acid to delay skin aging.
OBJECTIVE: To investigate the effect of the anti-aging agent α-ketoglutarate engineered human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles in a D-galactose-induced model of dermal fibroblast senescence.
METHODS: (1) Biological characteristics of primary human umbilical cord mesenchymal stem cells were identified by osteogenic-lipogenic differentiation staining and flow cytometry. (2) The small extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cell were obtained by using differential-ultracentrifugation. α-Ketoglutarate-engineered human umbilical cord mesenchymal stem cell-small extracellular vesicles were constructed by electroporation, and biologically characterized by transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analyzer, while the encapsulation rate was assessed using high-performance liquid chromatography. (3) The effect of α-ketoglutarate on the proliferative capacity of dermal fibroblasts was assessed by CCK-8 and Edu cell proliferation assay kits. (4) The effect of α-ketoglutarate-engineered human umbilical cord mesenchymal stem cell-small extracellular vesicles on delaying the senescence of dermal fibroblasts was evaluated by reactive oxygen species detection kit, western blot assay, and cellular immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The obtained human umbilical cord mesenchymal stem cell and human umbilical cord mesenchymal stem cell-small extracellular vesicles were biologically compatible. (2) There was no toxic effect on dermal fibroblasts when α-ketoglutarate was used in the concentration range of 0.5-8 mmol/L. (3) D-gal induced senescence in dermal fibroblasts, while α-ketoglutarate-engineered human umbilical cord mesenchymal stem cell-small extracellular vesicles treatment reduced the level of oxidative stress, DNA damage, and collagen loss, which was further verified that α-ketoglutarate-engineered human umbilical cord mesenchymal stem cell-small extracellular vesicles could effectively slow down the skin aging process.

Key words: ">small extracellular vesicle, human umbilical cord mesenchymal stem cell, α-ketoglutarate, senescence, dermal fibroblast, electroporation, oxidative stress, DNA damage, engineered extracellular vesicle

中图分类号:

吴芷菁, 李加利, 张佳昕, 王唐蓉, 郑煜洲, 孙梓暄. α-酮戊二酸工程化小细胞外囊泡延缓皮肤衰老[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(1): 120-129.

Wu Zhijing, Li Jiali, Zhang Jiaxin, Wang Tangrong, Zheng Yuzhou, Sun Zixuan. Alpha-ketoglutarate engineered small extracellular vesicles delay skin aging[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(1): 120-129.

图/表（结果） 3

2.1 人脐带间充质干细胞及hucMSC-sEV的生物学特征 分离培养的原代人脐带间充质干细胞从组织块周围爬出，细胞形态呈梭状，细胞状态良好呈漩涡状生长，见图1A；经过成骨和成脂培养基诱导分化后进行茜素红或油红O染色，可见明显的钙结节和脂滴，表明人脐带间充质干细胞成骨、成脂分化能力良好，见图1B；流式细胞术结果表明，人脐带间充质干细胞高表达阳性标志物CD105、CD73、CD166，阴性标志物CD11b、 CD34、CD45和ISO几乎不表达，见图1C，符合间充质干细胞的生物学特征。
收集人脐带间充质干细胞上清液，进行差速-超速离心法得到hucMSC-sEV，在透射电镜下观察到hucMSC-sEV有典型的囊泡膜结构并且呈茶托状，见图2A；纳米粒子跟踪分析仪检测粒径分布在180.8 nm处，Zeta电位为(-29.32±1.16) mV，见图2B；Western blot结果显示，hucMSC-sEV表达小细胞外囊泡特征性标志物CD63、CD9、Alix、TSG101，不表达阴性标志物Calnexin，见图2C。
2.2 AKG对真皮成纤维细胞增殖能力的影响 分离培养的真皮成纤维细胞从大鼠乳鼠的皮肤组织块中爬出，细胞形态呈短梭状，细胞状态良好呈漩涡状生长，见图3A；细胞免疫荧光结果显示，真皮成纤维细胞表达特征性标志物波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白，不表达阴性标志物即表皮标志物角蛋白10，见图3B，符合真皮成纤维细胞的生物学特征。分别将0.5，1，2，4，8 mmol/L的AKG与真皮成纤维细胞共孵育24 h和48 h，CCK-8结果显示AKG没有抑制真皮成纤维细胞的增殖，表明AKG对真皮成纤维细胞无毒性，见图3C，由于在传统的电穿孔过程中投入的药物量会有一定的损失，同时通过参考相关文献[35]，最终选择2 mmol/L浓度进行后续实验。

2.3 AKG工程化hucMSC-sEV的构建与鉴定 使用电穿孔技术，分别将2 mmol/L的AKG载入5×109 particles/mL，1×1010 particles/mL和5×1010 particles/mL的hucMSC-sEV中，在透射电镜下观察到AKG工程化hucMSC-sEV囊泡膜结构完整并呈茶托状，见图4A；纳米粒子跟踪分析仪检测AKG工程化hucMSC-sEV的粒子分布和Zeta电位，与hucMSC-sEV相比均无明显变化，表明电穿孔对小细胞外囊泡几乎无损伤作用，见图4B。使用高效液相色谱技术检测AKG工程化hucMSC-sEV的包封率，得到标准曲线为Y=1 613 593.088X+ 21 958.278，R2=0.999 9，表明AKG的浓度在0-5 mmol/L范围内线性关系良好。通过公式计算5×109，1×1010，5× 1010 particles/mL的hucMSC-sEV与AKG进行电穿孔后相应的包封率分别为(44.93±0.97)%，(45.38±4.36)%和(40.13±2.31)%，结果显示当小细胞外囊泡粒子数在1×1010 particles/mL时包封率最高，因此选择此浓度进行后续实验。

2.4 AKG工程化hucMSC-sEV延缓D-半乳糖诱导的真皮成纤维细胞衰老进程 建立真皮成纤维细胞老化模型，见图5A，在D-半乳糖处理24 h后，向细胞中分别加入AKG或hucMSC-sEV或AKG工程化hucMSC-sEV处理12 h进行后续实验。在共聚焦显微镜下观察到hucMSC-sEV与真皮成纤维细胞共孵育12 h后能被有效摄取，而AKG工程化hucMSC-sEV组的摄取效率要略低于hucMSC-sEV组，可能与电穿孔造成小细胞外囊泡数量上的损失有关，见图5B。
2.4.1 AKG工程化hucMSC-sEV促进衰老真皮成纤维细胞的增殖 通过CCK-8法来评估不同浓度AKG对D-半乳糖诱导的衰老真皮成纤维细胞增殖的影响。使用0.5，1，2，4，8 mmol/L AKG与真皮成纤维细胞共孵育，CCK-8结果显示AKG浓度在2 mmol/L以内时，对衰老的真皮成纤维细胞有促增殖作用，且当浓度为1 mmol/L和2 mmol/L时效果最为显著，Edu细胞增殖实验也具有相同的结果，见图5C-E，结合AKG对真皮成纤维细胞的毒性实验，以及药物在电穿孔过程中存在损失，最终选取2 mmol/L进行后续实验。
2.4.2 AKG工程化hucMSC-sEV降低衰老真皮成纤维细胞氧化应激水平 使用活性氧评估不同处理组衰老真皮成纤维细胞内氧化应激水平，结果显示，与D-半乳糖组相比，各处理组显著抑制了细胞内活性氧的产生，降低了氧化应激水平，其中AKG工程化hucMSC-sEV组效果更优，见图5F-G。
2.4.3 AKG工程化hucMSC-sEV减少真皮成纤维细胞的胶原蛋白流失并降低DNA损伤水平 Western blot结果显示，与D-半乳糖组相比，AKG工程化hucMSC-sEV组能有效增加Ⅰ型胶原蛋白表达，并下调基质金属蛋白酶9表达，在一定程度上抑制了胶原蛋白的降解，同时下调Bax蛋白表达，有效抑制了细胞凋亡，此外衰老相关标志物P21表达水平也显著下调。细胞免疫荧光结果也证实，AKG组、hucMSC-sEV组和AKG工程化hucMSC-sEV组均能提升Ⅰ型胶原蛋白表达水平，下调DNA双链断裂标志物γ-H2AX表达水平，表明经处理后，衰老真皮成纤维细胞的胶原蛋白含量有所恢复，DNA断裂引起的损伤减轻，其中AKG工程化hucMSC-sEV组的效果最好，见图5H-M。

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引言

随着人口老龄化，衰老引起的皮肤问题日益凸显，包括皮肤干燥、皱纹生成、弹性降低、屏障完整性降低、表皮变薄、色素沉着和伤口愈合迟缓等[1-4]。在衰老过程中，分子、细胞和器官表现出不同层面相互依存的特征[5]。细胞衰老最早被描述为复制性衰老[6]，是皮肤衰老中不可忽视的重要因素，内源性和外源性的刺激因素都会在一定程度上加剧衰老细胞的积累，衰老细胞通过分泌衰老相关分泌表型、炎症因子和活性氧，进一步加剧衰老过程[7-8]。糖摄入水平是近年来人们关注的除紫外线辐射外另一个影响皮肤衰老的关键因素[9-10]。D-半乳糖作为一种强大的糖基化剂[11]，可以诱导机体产生晚期糖基化终产物并在皮肤中积累[12]，该产物通过诱导氧化应激反应破坏细胞功能，最终加速皮肤衰老[13-14]。
小细胞外囊泡是一种直径小于200 nm的双层脂质膜性囊泡[15]，具有携带生物活性物质和分子信号转导的能力。近年来，小细胞外囊泡在皮肤衰老领域得到了广泛关注，有研究人员证明人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles，hucMSC-sEV)可以作为纳米治疗剂，通过TIMP1/Notch1通路挽救短波紫外线诱导的皮肤光老化[16]；课题组前期研究发现hucMSC-sEV也可以正向调节妊娠区蛋白来抑制基质金属蛋白酶1表达，从而预防光老化[17]，这些结果为开发基于小细胞外囊泡的皮肤抗衰纳米制剂奠定了理论基础。此外，由于小细胞外囊泡具有低免疫原性和跨越生物屏障的能力，可保护内容物免受降解，并促进细胞内化，正逐渐发展为潜力巨大的药物递送系统[18-19]。更重要的是，工程化的修饰方法在一定程度上弥补了天然小细胞外囊泡本身靶向性不足、半衰期短、递送效率低等问题，同时也实现了小细胞外囊泡的大规模生产和快速分离，随着纳米医学和材料制造方法的不断推进，未来工程化小细胞外囊泡在再生医学领域将有更广阔的应用前景[20-21]。
α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid，AKG)是三羧酸循环中的关键分子，在维持细胞代谢平衡与葡萄糖稳态方面有着重要作用[22]。另外，AKG作为一种新兴的抗衰老小分子药物[23-24]，在皮肤领域的应用涵盖了多个方面，包括改善皮肤水合作用与屏障修复能力[25]、抑制皱纹生成[26]、抗炎和抗氧化等[27-29]，但AKG存在膜渗透性较差、半衰期短等缺陷[30]，一定程度上限制了在皮肤领域的应用效能。
该研究使用的膜穿透策略即电穿孔技术[31-32]，在药物装载效率、可控性和可重复性方面显著优于传统共孵育、冻融循环等技术[33-34]，进一步优化hucMSC-sEV药物递送系统，同时提高抗衰药物AKG皮肤递送的稳定性、渗透性和生物利用度。在此，该实验初步探究了AKG工程化hucMSC-sEV能否发挥延缓皮肤衰老的功效，为推动其在医疗美容抗衰以及皮肤疾病防治中的转化应用提供理论和技术支撑。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学基础实验，采用one-way或two-way ANOVA分析。
1.2 时间及地点 实验于2024年4-11月在江苏大学外泌体基础与转化应用高技术研究重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 选择一两日龄的SD大鼠乳鼠，雌性，由江苏大学实验动物中心提供，动物机构许可证号：SCXK(SU) 2023-0017。实验方案均经江苏大学实验动物伦理委员会批准。
1.3.2 实验细胞、试剂和仪器 人脐带间充质干细胞(江苏大学第四附属医院)；AKG粉末(药物滴定纯度≥98% titration，R026648-1g，罗恩，上海)；D-半乳糖粉末(HY-N0210，MCE，美国)；α-MEM营养液(C12571500BT，Gibco，美国)；胎牛血清(F101-01，Gibco，美国)；PBS(QB1001，山东齐都，中国)；抗生素(CA0075，北京雷根，中国)；脱脂奶粉(伊利)；RIPA蛋白裂解液(89901+A32961，赛默飞，美国)；Loading Buffer(NP0008，Invitrogen，美国)；α-平滑肌肌动蛋白抗体(1∶500，P62736，Bioworld，美国)；波形蛋白抗体(1∶500，5741S，CST，美国)；角蛋白10抗体(1∶500，RKSE60，Santa Cruz，美国)；CD63(1∶500，25682-1-AP，Proteintech，美国)；CD9(1∶500，13174S，CST，美国)；Alix(1∶500，92880S，CST，美国)；TSG101(1∶500，28283-1-AP，Proteintech，美国)；Calnexin(1∶500，2679S，CST，美国)；β-actin(1∶4 000，AC038，ABclonal，中国)；Ⅰ型胶原α1 (1∶500，BS70155，Bioworld，美国)；基质金属蛋白酶9(1∶500，A25299，Abclonal，中国)；Bax(1∶500，50599-2-Ig，Proteintech，美国)；P21(1∶500，R381102，正能生物，中国)；γH2AX (1∶500，R381558，正能生物，中国)；ECL(E422-02，Vazyme，中国)；人脐带间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒(HUXUC-90021，Oricell，中国)；人脐带间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒(HUXUC-90031 Oricell，中国)；CCK-8检测试剂盒(40203ES80，翌圣生物，中国)；羊抗兔IgG二抗偶联HRP(1∶4 000，31460，Invitrogen，美国)；羊抗兔IgG偶联FITC(1∶200，L30113，SAB，美国)；羊抗鼠IgG偶联Cy3(1∶200，AS008，Abclonal，中国)；鬼笔环肽(1∶200，40736ES7，翌圣生物，中国)； CM-DiL(V22888，Invitrogen，美国)；电泳仪(Biorad，美国)；转膜仪(Biorad，美国)；化学发光成像仪(e-BLOT，中国)；倒置光学显微镜(Nexcope，美国)；透射电子显微镜(H-7800，日本)；激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5，德国)；倒置荧光相差生物显微镜(Nikon Ti2-U，日本)；流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)；纳米颗粒跟踪分析仪(ZetaView Twin pmx220，德国)；多功能酶标仪(BioTek，美国)；电转仪(BEX，日本)；电极杯(BEX，日本，体系40-400 μL)。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定 经江苏大学第四附属医院伦理委员会批准(批准号：202301)并征得产妇知情同意后，收集产妇新鲜脐带组织。将脐带组织置于含双抗的PBS溶液中，剔除静脉和动脉，将组织剪成小块贴于小皿皿底，倒扣晾干后，加入含体积分数15%胎牛血清的α-MEM培养基，在37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中培养至细胞从组织块中爬出。通过成骨、成脂诱导分化试剂盒检测人脐带间充质干细胞的成骨、成脂分化能力，流式细胞术和Western blot检测表面标志物表达，收集第3-7代人脐带间充质干细胞上清液用于分离提取小细胞外囊泡。
1.4.2 hucMSC-sEV的分离与鉴定 采用差速-超速离心法，将收集的人脐带间充质干细胞上清液在4 ℃条件下2 000×g离心30 min去除细胞碎片，接着10 000×g离心30 min去除细胞器，将上清转移至100 kD超滤离心管中2 000×g离心30 min，收集滤芯底部浓缩液，置于超速离心机中100 000×g离心2 h，弃一半体积上清，用PBS清洗沉淀后再次100 000×g离心2 h，最终收集沉淀，加入PBS后溶解过夜。将溶解的小细胞外囊泡经0.22 μm滤器除菌，溶于PBS中，分装保存于-80 ℃。使用纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径大小和Zeta电位，透射电镜观察小细胞外囊泡形态，Western blot鉴定膜表面标志物表达。
1.4.3 真皮成纤维细胞的分离与鉴定 将SD大鼠乳鼠处死，使用体积分数75%乙醇进行全身消毒，置于含双抗的PBS溶液中，剥离背部皮肤，用镊子刮去脂肪组织，剪成小块贴于中皿皿底，倒扣晾干后，加入含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养3-7 d，直至细胞从组织块中爬出，通过细胞免疫荧光技术鉴定真皮成纤维细胞的表面标志物。
1.4.4 AKG工程化hucMSC-sEV的构建
(1)制备AKG工程化hucMSC-sEV：分别将5×109，1×1010，5×1010个粒子数的hucMSC-sEV与2 mmol/L AKG溶于PBS中使最终体系为200 μL，将体系加入电极杯中，放置在电转仪上，在“CHECK”欧姆< 0.2的条件下进行电穿孔，之后用200 μL PBS润洗电极杯2次，放入37 ℃孵箱孵育40 min以恢复小细胞外囊泡的膜结构，接着将体系转移至100 kD超滤管中2 000×g离心30 min，收集滤芯底部的液体，重复3次，最后经0.22 μm滤器除菌，溶于PBS中。
(2)透射电镜观察AKG工程化hucMSC-sEV的形态：将新鲜的AKG工程化hucMSC-sEV溶液滴加在铜网上，将铜网倒扣在pH 6.8的磷钨酸(30 g/L)上负染5 min，烘干后置于透射电镜下观察。
(3)纳米颗粒跟踪分析技术检测AKG工程化hucMSC-sEV的粒径分布和浓度：用标准品溶液对仪器进行校准，之后用怡宝水以1∶1 000的浓度稀释，用1 mL注射器吸取液体，推入大于1 mL的待测样品上机检测。
(4)高效液相色谱技术检测AKG工程化hucMSC-sEV的包封率：按“1.4.4(1)”所述方法制备出AKG工程化hucMSC-sEV，收集超滤管中残留的液体，使用高效液相色谱技术测定残留液体中游离的AKG含量，采用Inertsustain® C18，4.6 mm×250 mm，5 μm色谱柱，以0.1 mol/L NaH2PO4缓冲液为流动相，流速为1 mL/min，紫外检测波长215 nm，根据AKG的标准曲线，计算出游离的药物含量。按以下公式计算出包封率。包封率(%)=(mtotal-mfree)/mtotal×100%。其中，mtotal是溶液中AKG的总质量；mfree是溶液中游离的AKG质量。
1.4.5 AKG工程化hucMSC-sEV的体外评价
(1)真皮成纤维细胞老化防御模型的构建：选择增殖能力强、生长状态良好的第3-4代真皮成纤维细胞构建D-半乳糖诱导的衰老模型。实验分为正常对照组、D-半乳糖组、AKG组、hucMSC-sEV组和AKG工程化hucMSC-sEV组，具体干预方式如下：D-半乳糖溶液配置和模型构建(基于课题组前期研究处理浓度)：称取0.01 g D-半乳糖粉末溶于α-MEM完全培养基中，使D-半乳糖的终质量浓度为10 g/L。在6孔板中每孔接种2×104个真皮成纤维细胞，待细胞贴壁后，弃培养液，加入1 mL D-半乳糖溶液处理24 h。
AKG溶液配制和处理：4.5 μL AKG原液(200 mmol/L)溶于995.5 μL含D-半乳糖的α-MEM完全培养基中，使得AKG的终处理浓度为0.9 mmol/L，在6孔板中加入上述1 mL AKG溶液处理12 h。
HucMSC-sEV的处理：取适量hucMSC-sEV溶于1 mL含D-半乳糖的α-MEM完全培养基中，使得hucMSC-sEV的终处理浓度为1×109 particles/mL，在6孔板中加入1 mL上述hucMSC-sEV溶液处理12 h。
AKG工程化hucMSC-sEV的处理：取适量AKG工程化hucMSC-sEV于1 mL含D-半乳糖的α-MEM完全培养基中，使得AKG工程化hucMSC-sEV的终处理浓度为1×109 particles/mL，在6孔板中加入1 mL上述AKG工程化hucMSC-sEV溶液处理12 h。
(2)真皮成纤维细胞摄取hucMSC-sEV和AKG工程化hucMSC-sEV的检测：将相同浓度的hucMSC-sEV或AKG工程化hucMSC-sEV与CM-DiL染料孵育1 h得到DiL-sEV，转移至100 kD超滤管中2 000×g离心30 min，收集滤芯底部浓缩液，经0.22 μm滤器除菌，溶于PBS中。将细胞爬片贴于12孔板板底，每孔接种2×104个真皮成纤维细胞，待细胞贴壁后弃去培养液，换成1 mL含有DiL-sEV的α-MEM培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱避光孵育12 h。孵育结束后弃培养基，PBS洗涤后每孔加入500 μL 40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3次，再加入Triton-X室温破膜10 min，PBS洗3次，每孔加入500 μL 5%BSA室温封闭90 min，加入鬼笔环肽室温染色40 min，PBS洗3次，最后加入Hochest染料避光孵育10 min，PBS洗涤3次，加入抗荧光淬灭剂进行封固，在共聚焦显微镜下观察内化情况。
(3)CCK-8细胞毒性实验：将真皮成纤维细胞按照800个/孔的密度接种在96孔板中，在细胞贴壁后，加入终浓度为0.5，1，2，4，8 mmol/L的AKG与细胞共孵育，分别孵育24 h和48 h后，弃培养液，加入CCK-8检测试剂，在37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中避光孵育2 h，于酶标仪450 nm波长下检测吸光度值。
(4)CCK-8细胞增殖实验：将真皮成纤维细胞按照800个/孔的密度接种在96孔板中，在细胞贴壁后，加入终质量浓度为10 g/L的D-半乳糖溶液，在37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中处理24 h，分别加入终浓度为0.5，1，2，4，8 mmol/L的AKG与细胞共孵育12 h，去除培养液，加入CCK-8检测试剂，在37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中避光孵育2 h，于酶标仪450 nm波长下检测吸光度值。
(5)Edu细胞增殖检测：将爬片贴于12孔板底部，将真皮成纤维细胞按照1×104个/孔的密度接种在12孔板中，在细胞贴壁后，加入终质量浓度为10 g/L的D-半乳糖溶液，在37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中处理24 h，分别加入终浓度为0.5，1，2，4，8 mmol/L的AKG与细胞共孵育12 h，去除培养液，加入37 ℃预热的2×Edu工作液(20 μmol/L)以及等体积的培养液，使Edu终浓度为1×，继续孵育细胞2 h，Edu标记完成后去除培养液并加入500 μL 40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤3次，每孔加入500 μL 0.3%Triton-X室温破膜10 min，PBS洗涤3次，将爬片置于载玻片上，每片滴加50 μL Click反应液，室温避光孵育30 min，吸去反应液，PBS洗涤3次，每片加入50 μL Hoechst(1∶1 000)细胞核染料染色10 min，PBS洗涤3次，最后在载玻片上滴加抗荧光淬灭剂进行封固，在荧光显微镜下观察。使用Image J软件进行Edu阳性细胞百分比半定量分析。
(6)活性氧荧光检测：根据1.4.5(1)进行分组处理后，去除培养液，PBS洗2遍，加入1 mL无血清细胞培养液稀释的探针，在37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中避光孵育20 min，用无血清α-MEM培养基洗2遍去除未结合的DCFH-DA，于荧光显微镜下观察。使用Image J软件进行荧光强度半定量分析。
(7)细胞免疫荧光：将爬片贴于12孔板底部，再将真皮成纤维细胞按照4×103个/孔的密度接种在12孔板中，根据1.4.5(1)进行分组处理后，去除培养液，PBS洗涤2次，每孔加入500 μL 40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗涤3次，每孔加入500 μL 0.1%Triton-X室温破膜10 min，PBS洗涤3次，加入5% BSA室温封闭2 h，将爬片置于载玻片上，每片滴加PBS稀释的50 μLⅠ型胶原蛋白、γ-H2AX抗体(1∶200) 4 ℃孵育过夜，次日回收一抗，PBS洗涤3次，与荧光二抗在室温下孵育2 h，PBS洗涤3次，每片加入50 μL Hoechst(1∶200)细胞核染料染色10 min，PBS洗涤3次，最后在载玻片上滴加抗荧光淬灭剂进行封固，在共聚焦显微镜或荧光显微镜下观察。使用Image J软件进行荧光强度半定量分析。
(8)Western blot检测：根据1.4.5(1)进行分组处理后，去除培养液，PBS洗涤2次，加入200 μL RIPA蛋白裂解缓冲液，用细胞刮板将细胞刮下并收集在Ep管中振荡1 min，冰上静置5 min，重复3次，在4 ℃条件下12 000×g离心15 min，取上清液弃沉淀，以1∶3的比例加入4×Buffer缓冲液(Buffer∶上清液=1∶3)，在沸水中煮10 min，冷却至室温后，-20 ℃保存。蛋白样品通过SDS-PAGE电泳分离并转移至PVDF膜上，室温条件下5%脱脂奶粉封闭2 h，将TBST稀释的200 μL抗体[Ⅰ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶9、Bax、P21抗体(1∶500)，内参为β-actin (1∶4 000)]滴加在膜上，4 ℃孵育过夜，次日回收一抗，用TBST洗涤4次，每次5 min，在室温条件下与二抗(1∶4 000)孵育2 h，用TBST洗涤4次，每次5 min，最后将条带置于化学发光成像仪上，滴加超敏ECL曝光液，检测蛋白表达含量。使用Image J软件进行灰度值分析。
1.5 主要观察指标 ①激光共聚焦显微镜观察真皮成纤维细胞对hucMSC-sEV的摄取情况；②CCK-8法检测不同浓度AKG对真皮成纤维细胞的毒性作用以及增殖的影响；③荧光显微镜观察经不同处理后真皮成纤维细胞内活性氧水平；④细胞免疫荧光评估真皮成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白和γ-H2AX蛋白表达水平；⑤Western blot检测真皮成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶1、P21、Bax蛋白表达水平。
1.6 统计学分析 采用GraphPad prism 8.0软件进行统计学分析及绘图。采用one-way(单因素)或two-way(多因素)ANOVA分析，P < 0.05为差异有显著性意义。该文章的统计学方法已通过江苏大学医学院生物统计学专家审核。

讨论

皮肤老化是一个复杂的生物学过程，受内在和外在因素的共同影响[36]，内源性因素包括遗传和荷尔蒙变化[37]，外源性因素包括太阳辐射、空气污染、气候因素、营养、吸烟等[38]。随着年龄的增长，人类皮肤的总暴露量在不断增加，其中活性氧生成、基质金属蛋白酶表达含量上升以及胶原蛋白降解反映了皮肤老化的核心问题[39-43]。据报道，D-半乳糖诱导的衰老模型能够模拟自然衰老过程中的多种生理和病理特征，包括寿命缩短、认知衰退、氧化应激等等，相较于紫外线照射可以更好地模拟正常人体皮肤衰老的状态；另外，D-半乳糖诱导的衰老模型与氧化应激有关[44]，并且相较于其他衰老模型具有不良反应小、耗时短以及实验期间生存率高等优势[45-47]。
在此背景下，D-半乳糖诱导机体葡萄糖代谢异常，进一步激活线粒体氧化代谢[44，48]，而AKG作为三羧酸循环中的代谢产物，其延缓衰老的作用效果已经得到充分验证，不仅可以通过氧化脱羧反应释放出大量ATP，增加氧利用率，还可以降低全身炎症细胞因子水平从而达到抗炎抗氧化的效果[27，49]。
然而，AKG的生物利用度低，在一定程度上限制了其皮肤抗衰效果，于是引入了小分子药物的新型递送载体小细胞外囊泡，因小细胞外囊泡具有跨生物屏障、稳定运输生物活性成分以及免疫原性低等优点，有望改善AKG的药代动力学以及递送效率，最终增强治疗效果[50]。
此次研究成功分离提取了hucMSC-sEV，进而通过电穿孔技术构建了AKG工程化hucMSC-sEV，同时验证了膜结构完整性。此外，高效液相色谱结果显示使用1×1010 particles/mL 小细胞外囊泡与AKG构建的AKG工程化hucMSC-sEV药物包封率最高，可达(45.38±4.36)%。体外CCK-8细胞毒性实验结果显示，AKG对真皮成纤维细胞无毒性作用，是一种相对安全的小分子药物。最后对AKG工程化hucMSC-sEV延缓真皮成纤维细胞老化的作用效果进行评价，Western blot结果显示AKG工程化hucMSC-sEV可以通过抑制基质金属蛋白酶9的表达从而减少胶原蛋白的流失，同时降低衰老相关指标P21的表达水平，有效延缓老化进程；细胞免疫荧光结果显示，真皮成纤维细胞在经过D-半乳糖处理后，DNA损伤标志物γ-H2AX水平上升，而经过AKG或hucMSC-sEV或AKG工程化hucMSC-sEV干预后均出现γH2AX水平下降，并且AKG工程化hucMSC-sEV组在减少DNA损伤方面要优于其他组，说明AKG工程化小细胞外囊泡抗衰老的机制可能与抑制DNA损伤有关；活性氧荧光检测结果也显示，AKG工程化hucMSC-sEV组显著降低了衰老细胞内的活性氧水平，表明AKG与小细胞外囊泡在减少氧化应激水平和抑制DNA损伤方面具有协同作用，两者的联合应用将有望从多个方面发挥抗皮肤衰老的功效。结合临床应用，脂溶性的小细胞外囊泡携载水溶性药物AKG可以更好地穿越皮肤屏障系统，促进皮肤吸收，从而增加药物缓释型和生物利用度。
综上所述，实验通过电穿孔技术成功构建了AKG工程化hucMSC-sEV，通过一系列实验验证其能够有效延缓皮肤老化，在减少胶原蛋白流失、降低氧化应激水平、降低衰老相关标志物水平和逆转DNA损伤方面有着显著效果。该实验的局限性在于缺乏分子机制的深入探索以及体内的抗衰效果验证，未来将关注并挖掘AKG工程化小细胞外囊泡与DNA损伤相关的关键分子，进一步探究其中的分子机制，同时开展动物实验，有助于全面了解AKG工程化小细胞外囊泡延缓皮肤衰老的作用机制，为临床应用提供科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

α-酮戊二酸工程化小细胞外囊泡延缓皮肤衰老

Alpha-ketoglutarate engineered small extracellular vesicles delay skin aging

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