缺血性脑卒中诊断性生物标志物解析及靶向铜死亡相关基因的实验验证

doi:10.12307/2025.957

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (35): 7562-7570.doi: 10.12307/2025.957

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缺血性脑卒中诊断性生物标志物解析及靶向铜死亡相关基因的实验验证

陈莹1，2，郭晓婧1，莫雪妮1，马威1，武尚志1，李相玲1，谢婷婷1

1广西中医药大学中医药壮瑶医药研究院，广西壮族自治区南宁市 530022；2广西国际壮医医院康复科，广西壮族自治区南宁市 530022

收稿日期:2024-10-10 接受日期:2024-12-10 出版日期:2025-12-18 发布日期:2025-05-06
通讯作者: 马威，硕士，助理研究员，广西中医药大学中医药壮瑶医药研究院，广西壮族自治区南宁市 530022
作者简介:陈莹，女，1983年生，2007年广西医科大学内科学毕业，硕士，副主任医师，主要从事中医学、康复医学、临床医学的研究。
基金资助:
广西自然科学基金资助项目(2023GXNSFAA026105)，项目负责人：陈莹；广西中医药大学校级科研项目(2023QN006)，项目负责人：马威

Analysis of diagnostic biomarkers for ischemic stroke and experimental validation of targeted cuproptosis related genes

Chen Ying1, 2, Guo Xiaojing1, Mo Xueni1, Ma Wei1, Wu Shangzhi1, Li Xiangling1, Xie Tingting1

1Zhuang Yao Institute of Traditional Chinese Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530222, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Rehabilitation, Guangxi International Zhuang Medical Hospital, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2024-10-10 Accepted:2024-12-10 Online:2025-12-18 Published:2025-05-06
Contact: Ma Wei, Master, Assistant researcher, Zhuang Yao Institute of Traditional Chinese Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530222, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Chen Ying, Master, Associate chief physician, Zhuang Yao Institute of Traditional Chinese Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530222, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Department of Rehabilitation, Guangxi International Zhuang Medical Hospital, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Guangxi Natural Science Foundation, No. 2023GXNSFAA026105 (to CY); Guangxi University of Chinese Medicine Research Program, No. 2023QN006 (to MW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
缺血性脑卒中：指因脑部血液循环障碍，缺血、缺氧所致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化，而出现相应的神经系统功能缺损。作为全球第二大死亡原因，缺血性脑卒中具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率的特点。
铜死亡：铜作为一种重要的微量元素，参与人体各种生理和生物过程。通过Cu+/Cu2+氧化还原循环的作用，铜作为催化辅因子至少参与30种基本生理活性酶的结构成分，哺乳动物的大脑是最富含铜的器官之一，因此过量的铜或铜缺乏会产生神经毒性作用。

背景：研究表明，缺血性脑卒中的各个过程都有免疫细胞参与，其中铜死亡也起着关键作用。
目的：通过生物信息学筛选出与缺血性脑卒中进展有关的诊断性生物标记物，并对与其发生发展密切相关的铜死亡基因进行分析及验证。
方法：从GEO数据库中获取GSE16561芯片，共包含39例缺血性脑卒中组与24例对照组数据，解析缺血性脑卒中芯片数据的差异表达基因，对差异基因进行GO与KEGG富集分析；通过LASSO和Random Forest法，筛选出影响缺血性脑卒中发生发展的关键基因，建立诊断模型并加以验证；通过免疫细胞浸润与加权基因共表达网络对差异基因进行分析，差异表达的免疫相关基因与铜死亡基因取交集，获得铜死亡免疫相关的Hub基因，并进行体外细胞实验，将大鼠海马神经元细胞分为正常组和缺血性脑卒中组，进行qPCR实验验证。
结果与结论：①差异分析获得573个差异表达基因，主要富集于免疫反应的正向调节等生物学过程和脂质与动脉粥样硬化等信号通路；②机器学习方法筛选出MFN2、PKM2、CREG1、FOXO3A诊断性基因，对缺血性脑卒中可能具有一定的诊断价值；③免疫浸润分析发现浆细胞、NK细胞静息、巨噬细胞等，表明免疫细胞在缺血性脑卒中的发病中发挥着一定作用；④WGCNA结合免疫浸润分析获得118个关键模块基因，与铜死亡基因取交集获得2个铜死亡与免疫特征基因；4个诊断性基因与Hub基因的相关性分析结果显示FOXO3A与MFN2、PKM2与BCL2L1、MTF1与MFN2、ATP7B与BCL2L1的表达具有相关性；⑤qPCR 结果显示，与空白组相比，缺血性脑卒中组基因 MTF1、ATP7B存在显著差异，证实ATP7B、MTF1可作为缺血性脑卒中铜死亡的特征基因，可能通过干预ATP7B、MTF1调节铜死亡来改善缺血性脑卒中。
https://orcid.org/0009-0003-4155-4050(陈莹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 缺血性脑卒中, 机器学习, 生物信息学, 免疫浸润, 铜死亡, 细胞实验, ATP7B, MTF1

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that immune cells are involved in all processes of ischemic stroke, in which cuproptosis also plays a key role.
OBJECTIVE: To screen diagnostic biomarkers related to the progression of ischemic stroke through bioinformatics, and analyze and validate cuproptosis-related genes closely related to the occurrence and development of ischemic stroke.
METHODS: The GSE16561 microarray was obtained from the GEO database, containing data from 39 cases of ischemic stroke (ischemic stroke group) and 24 controls (control group). Differentially expressed genes from the ischemic stroke microarray data were analyzed. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses were performed. By using LASSO and Random Forest methods, key genes affecting the occurrence and development of ischemic stroke were screened, and a diagnostic model was established and validated. Differential gene analysis was performed through immune cell infiltration and weighted gene co expression network. The differentially expressed immune-related genes were intersected with cuproptosis genes to obtain the hub genes related to cuproptosis immunity. In vitro cell experiments were conducted to divide rat hippocampal neurons into a normal group and an ischemic stroke group, and qPCR experiments were performed to verify the results.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 573 differentially expressed genes were obtained by differential analysis. Differentially expressed genes were mainly enriched in biological processes, such as positive regulation of immune response, and signaling pathways such as lipid and atherosclerosis. (2) Machine learning methods were used to screen diagnostic genes such as MFN2, PKM2, CREG1, and FOXO3A, which may have some diagnostic value for ischemic stroke. (3) Immune infiltration analysis revealed resting plasma cells, NK cells, macrophages, etc., indicating that immune cells play a certain role in the pathogenesis of ischemic stroke. (4) Weighted gene co-expression network analysis combined with immune infiltration analysis obtained 118 key module genes, which were intersected with cuproptosis genes to obtain 2 cuproptosis and immune characteristic genes. The correlation analysis between four diagnostic genes and Hub genes showed that the expression of FOXO3A and MFN2, PKM2 and BCL2L1, MTF1 and MFN2, ATP7B and BCL2L1 were correlated. (5) The qPCR results showed significant differences in the genes MTF1 and ATP7B between the ischemic stroke group and the blank group. To conclude, ATP7B and MTF1 can serve as characteristic genes for cuproptosis in ischemic stroke. It is possible to improve ischemic stroke by intervening in ATP7B and MTF1 to regulate cuproptosis.

Key words: ischemic stroke, machine learning, bioinformatics, immune infiltration, cuproptosis, cellular experiments, ATP7B, MTF1

中图分类号:

陈莹, 郭晓婧, 莫雪妮, 马威, 武尚志, 李相玲, 谢婷婷. 缺血性脑卒中诊断性生物标志物解析及靶向铜死亡相关基因的实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7562-7570.

Chen Ying, Guo Xiaojing, Mo Xueni, Ma Wei, Wu Shangzhi, Li Xiangling, Xie Tingting. Analysis of diagnostic biomarkers for ischemic stroke and experimental validation of targeted cuproptosis related genes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(35): 7562-7570.

图/表（结果） 8

2.1 芯片数据规范化处理后差异表达基因的识别首先对GSE16561数据集进行归一化处理，然后通过“limma”包对规范化后的芯片进行差异分析，获得573个差异表达基因，其中141个差异表达基因表达下调，432个差异表达基因表达上调，进一步绘制的火山图和热图，见图1。

2.2 差异基因富集分析 GO富集分析揭示，差异表达基因显著集中于免疫反应的正调控、分泌颗粒膜以及免疫受体活性的调节等生物学途径。而KEGG通路分析则显示，这些差异表达基因主要关联于脂质代谢与动脉粥样硬化、T细胞受体信号传导、催产素信号通路以及cGMP-PKG信号传导途径等相关信号网络，见图2。
2.3 机器学习模型的构建与验证为了构建并验证机器学习模型以识别影响缺血性脑卒中的关键诊断性基因，采用了2种机器学习算法。LASSO回归分析从具有统计意义的变量中精选出15个预测基因(见图3A)，而Random Forest算法则筛选出10个预测基因(见图3B)。图4可见，通过绘制VENN图，确定了4个共同基因：MFN2、PKM2、CREG1和FOXO3A(见图4B)。利用“rms”包构建了包含这4个基因的缺血性脑卒中诊断列线图(见图4A)。校准曲线显示，模型预测的风险与真实患病风险之间差异甚微，表明该列线图模型在预测缺血性脑卒中发病方面具有较高的准确性(见图4C)。DCA分析揭示，当风险阈值在0-1范围内时，这4个基因的组合能为患者带来显著的临床效益(见图5A)。验证集的分析结果与训练集高度一致(见图5B)，这强化了这4个基因与缺血性脑卒中发病之间的紧密联系。ROC分析结果显示，MFN2 (AUC：0.757)、PKM2(AUC：0.718)、CREG1(AUC：0.838)和FOXO3A(AUC：0.778)的AUC值均超过0.7(见图5C)，验证集的数据分析结果与训练集相似(见图5D)，这进一步证实了这4个基因在缺血性脑卒中诊断中的重要价值。
2.4 免疫细胞浸润分析利用“CIBERSORT”软件包进行免疫细胞浸润的深入分析后，发现疾病组与对照组之间存在13种免疫细胞表达的显著差异(P值均< 0.05)。值得注意的是，在疾病组中，浆细胞、NK细胞静息以及巨噬细胞M0等的表达水平相对较低，见图6。
2.5 加权基因共同表达网络的构建基于GEO数据库中GSE16561数据集的聚类分析，构建了加权基因共表达网络。在此过程中，首先识别并排除了离群样本，见图7A。为了确定合适的软阈值β，设定了R2 > 0.9且平均连接性较高的标准，最终选定β值为16，相关结果展示在图7B中。采用动态树切割法成功鉴定出7个核心模块，见图7C。为了深入探究这些模块与免疫细胞浸润之间的关系进行了相关性分析，结果显示灰色模块与嗜酸性粒细胞之间存在高度正相关(r=0.58，P=5×10??)，而棕色模块则与巨噬细胞M0呈显著正相关(r=0.58，P=7×10-?)。基于这些发现，进一步筛选出118个关键模块基因，见图8。
2.6 铜死亡相关基因的筛选及相关性分析铜死亡相关基因与选定的118个关键模块基因进行交叉比对，鉴别出了2个核心基因MTF1和ATP7B，它们既与铜死亡机制相关，又与免疫活动紧密相连，因此被标记为Hub基因。这一发现通过VENN图(图9A)得以直观呈现。进一步的研究表明，MTF1和ATP7B在基因表达水平上展现出明显的差异性，见图9B，C。Hub基因与4个诊断性基因的相关性分析结果显示FOXO3A与MFN2(r=0.75)、PKM2与BCL2L1(r=0.74)、MTF1与MFN2(r=0.62)、ATP7B与BCL2L1(r=0.57)的表达具有相关性，见图10。
2.7 体外细胞实验验证结果 qPCR 结果显示，与空白组相比，缺血性脑卒中组基因MTF1表达下调，ATP7B表达上调；MTF1、ATP7B在缺血性脑卒中组和空白组间表达存在显著差异 (P < 0.05)，见图11。

参考文献

[1] TERRILL AL. Mental Health Issues Poststroke: Underrecognized and Undertreated. Stroke. 2023;54(6):1528-1530.
[2] 唐春花,郭露,李琼,等. 2022年全球卒中数据报告解读[J].诊断学理论与实践,2023,22(3):238-246.
[3] KAHLSON MA, DIXON SJ. Copper-induced cell death. Science. 2022; 375(6586):1231-1232.
[4] REN X, PAN C, PAN Z, et al. Knowledge mapping of copper-induced cell death: A bibliometric study from 2012 to 2022. Medicine (Baltimore). 2022;101(45):e31133.
[5] XUE Q, KANG R, KLIONSKY DJ, et al. Copper metabolism in cell death and autophagy. Autophagy. 2023;19(8):2175-2195.
[6] CHANG W, LI P. Copper and Diabetes: Current Research and Prospect.Mol Nutr Food Res. 2023;67(23):e2300468.
[7] YANG S, LI Y, ZHOU L, et al. Copper homeostasis and cuproptosis in atherosclerosis: metabolism, mechanisms and potential therapeutic strategies. Cell Death Discov. 2024;10(1):25.
[8] CHEN L, MIN J, WANG F. Copper homeostasis and cuproptosis in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):378.
[9] 卓桂锋,陈炜,朱健敏，等. 血管性痴呆铜死亡关键差异基因的生物信息学分析及防治中药筛选[J]. 中草药,2023,54(21):7120-7129.
[10] HE YJ, CONG L, LIANG SL, et al. Discovery and validation of Ferroptosis-related molecular patterns and immune characteristics in Alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 2022;14:1056312.
[11] FAN J, CHEN M, CAO S, et al. Identification of a ferroptosis-related gene pair biomarker with immune infiltration landscapes in ischemic stroke:a bioinformatics-based comprehensive study. BMC Genomics. 2022;23(1):59.
[12] 王咪,马书杰,刘杨,等.缺血性脑卒中铁死亡特征基因NFE2L2的鉴定与验证[J].中国组织工程研究,2025,29(7):1466-1474.
[13] XING L, WANG Z, HAO Z, et al. Cuproptosis in stroke: focusing on pathogenesis and treatment. Front Mol Neurosci. 2024;17:1349123.
[14] LAI MC, WANG D, LIN ZX, et al. Small Molecule Copper and Its Relative Metabolites in Serum of Cerebral Ischemic Stroke Patients. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2016;25(1):214-219.
[15] JIANG Y, WANG LP, DONG XH, et al. Trace Amounts of Copper in Drinking Water Aggravate Cerebral Ischemic Injury via Impairing Endothelial Progenitor Cells in Mice. CNS Neurosci Ther. 2015;21(8):677-680.
[16] SHI L, SUN Z, SU W, et al. Treg cell-derived osteopontin promotes microglia-mediated white matter repair after ischemic stroke. Immunity. 2021;54(7):1527-1542.
[17] ZHANG X, LEI B, YUAN Y, et al. Brain control of humoral immune responses amenable to behavioural modulation. Nature. 2020; 581(7807):204-208.
[18] JIN WN, SHI SX, LI Z, et al. Depletion of microglia exacerbates postischemic inflammation and brain injury. J Cereb Blood Flow Metab. 2017;37(6):2224-2236.
[19] 董一蕾,李珺媛,张业昊,等. 缺血性脑卒中免疫炎症机制及中医药干预研究进展[J].世界中医药,2024,19(2):291-297.
[20] JIANG M, YIN P, BAI X, et al. Proinflammatory and Anti-inflammatory Genes in Stroke Pathogenesis. Curr Pharm Des. 2020;26(34):4220-4233.
[21] SCHALLER B. Prospects for the future: the role of free radicals in the treatment of stroke. Free Radic Biol Med. 2005;38(4):411-425.
[22] XU XH, SHAH PK, FAURE E, et al. Toll-like receptor-4 is expressed by macrophages in murine and human lipid-rich atherosclerotic plaques and upregulated by oxidized LDL. Circulation. 2001;104(25):3103-3108.
[23] MA W, YANG Y, XIE T, et al. Treatment of Ischemic Stroke With Wenyang Huayu Formula: Network Pharmacology Analysis and Experimental Validation. Natural Product Communications. 2023;18(2): 1934578X-2211473X.
[24] YAMAMOTO S, MATSUI A, OHYAGI M, et al. In Vitro Generation of Brain Regulatory T Cells by Co-culturing With Astrocytes. Front Immunol. 2022;13:960036.
[25] SHICHITA T, SUGIYAMA Y, OOBOSHI H, et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nat Med. 2009;15(8):946-950.
[26] RAYASAM A, KIJAK JA, KISSEL L, et al. CXCL13 expressed on inflamed cerebral blood vessels recruit IL-21 producing T(FH) cells to damage neurons following stroke. J Neuroinflammation. 2022;19(1):125.
[27] KHAN S. Artificial Intelligence and Machine Learning in Clinical Medicine. N Engl J Med. 2023;388(25):2398.
[28] CHOI B, ZHENG W. Copper transport to the brain by the blood-brain barrier and blood-CSF barrier. Brain Res. 2009;1248:14-21.
[29] TALUKDER M, BI SS, JIN HT, et al. Cadmium induced cerebral toxicity via modulating MTF1-MTs regulatory axis. Environ Pollut. 2021;285: 117083.

引言

缺血性脑卒中是指脑部血液循环受阻，导致局部脑组织因缺血与缺氧而发生坏死或软化，进而引发相应的神经系统功能障碍。作为全球范围内导致死亡的第二大因素，缺血性脑卒中以高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率为特点[1-2]。
铜作为一种重要的微量元素，参与各种生理和生物过程，通过Cu+/Cu2+氧化还原循环的作用，铜作为催化辅因子至少参与30种基本生理活性酶的结构成分，哺乳动物的大脑是最富含铜的器官之一，因此过量的铜或铜缺乏会产生神经毒性作用[3-4]。铜死亡机制源于铜离子与线粒体呼吸链中三羧酸循环特定脂酰化组分的直接结合，这一结合促使脂酰化蛋白发生异常聚集，并随之引发铁硫簇蛋白的表达下调，进而造成蛋白质毒性应激，最终诱导细胞走向死亡[3,5]。值得注意的是，铜死亡在诸如糖尿病、动脉粥样硬化及神经退行性病变等疾病中发挥着重要作用，这些疾病与缺血性脑卒中关系密切[6-8]。然而，铜死亡相关基因在缺血性脑卒中中的研究报道较少。深入解析铜死亡相关基因的分子特性，有望为揭示缺血性脑卒中病理类型的多样性和深层发病机制提供新的视角，同时，这也可能为探索和开发有效的预防与治疗策略开辟新的道路。此次研究拟采用生物信息学和机器学习技术，对缺血性脑卒中发生发展过程中具有诊断意义的生物标记物进行筛查，建立缺血性脑卒中早期诊断模型；同时，以铜死亡为切入点，研究缺血性脑卒中与免疫细胞浸润的相关性，探索其发生、发展的分子机制，并进行体外实验验证。以期为缺血性脑卒中的诊治提供新的思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 设计生物信息学分析及靶向相关基因验证。
1.2 时间及地点实验于2024年7-10月在广西中医药大学中医药壮瑶医药研究院完成。
1.3 资料
1.3.1 数据的获取以“Ischemic Stroke”为检索词，在GEO数据库(基因表达数据库，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中检索并下载了基于GPL6883平台的GSE16561基因表达芯片数据集。该数据集涵盖了39例缺血性脑卒中患者(疾病组)和24例健康对照个体(对照组)的样本信息。
1.3.2 数据处理利用“gcrma”软件包对这些原始数据进行了归一化处理，以确保数据的一致性和可比性。在处理后的数据集中，按照7∶3的比例，随机将疾病组和对照组的样本划分为训练集和测试集，以便于后续的模型构建和验证[9-10]。为了识别与铜死亡相关的特征基因，综合运用了GeneCards数据库(网址为www.genecards.org)的查询功能和相关的文献检索手段。
1.4 方法
1.4.1 数据处理和差异筛选此阶段运用了R软件中的“Limma”包来深入分析GSE16561数据集。此过程旨在精确识别出该数据集中的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。并以log FC绝对值≥0.5、P值< 0.05作为筛选参数。结合“ggplot2”与“pheatmap”包，对差异表达基因进行了热图和火山图的绘制。
1.4.2 GO、KEGG富集分析为了深入探究差异表达基因潜在的生物学功能及其作用机制，采纳了R语言环境下的“clusterProfiler”软件包，对筛选出的差异表达基因进行了系统的GO(Gene Ontology)分类注释与KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。
1.4.3 诊断性模型的构建与验证为了构建并验证诊断性模型，运用了机器学习技术，旨在从差异表达基因中筛选出与疾病紧密相关的诊断性基因[11]。具体地，采用了最小绝对收缩与选择算子(LASSO)回归方法，通过“glmnet”包筛选出差异基因，交叉验证寻找误差最小的则为疾病特征基因，随后采用随机森林技术(random forest，RF)对基因进行筛选。最后，综合两种方法筛选出的疾病特征基因，取交集并绘制韦恩图，以确定核心诊断基因。随后，利用这些基因构建诊断模型，并通过校准曲线(calibration curve)评估其预测精度。为验证模型的临床实用性，采用决策曲线分析(decision curve analysis，DCA)进行评价，同时，利用工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)衡量其在疾病诊断中的效能。
1.4.4 差异基因的免疫细胞浸润分析为了探究差异基因与免疫细胞浸润之间的关系，首先构建了差异表达基因的表达数据矩阵，再利用R软件中的“CIBERSORT”包，对22种免疫细胞类型进行了浸润分析，旨在比较不同分组间免疫细胞浸润的表达差异。为了直观地展示这些分析结果，采用了“ggplot2”软件包进行可视化处理。
1.4.5 加权基因共表达分析基于“WGCNA”包，执行了加权基因共表达网络分析(Weighted Correlation Network Analysis，WGCNA)。此过程首先通过分层聚类技术识别并剔除离群样本，再选定β值为2作为软阈值参数，用以构建无尺度网络及拓扑重叠矩阵。随后，深入分析了各功能模块与免疫细胞浸润之间的关联性，旨在挖掘具有生物学意义的关联模式。最终，精心筛选出与免疫细胞浸润高度相关的功能模块，为后续深入研究奠定了坚实基础。
1.4.6 铜死亡相关基因的筛选及与诊断基因的相关性分析为筛选铜死亡相关基因并与诊断基因关联，将铜死亡基因与WGCNA模块基因取交集得Hub基因，用韦恩图展示。从这些Hub基因中筛选出缺血性脑卒中铜死亡关键基因。通过Pearson相关分析，探究诊断基因与铜死亡特征基因的关联性。
1.4.7 细胞模型构建及分组采用大鼠海马神经元细胞(CP-R107，普诺赛)，这些细胞培养在含体积分数10%胎牛血清的完全培养基(由低糖DMEM基础培养基、体积分数10%胎牛血清以及1%的青链霉素混合液配制而成)中。在培养过程中，细胞被置于37 ℃、体积分数5%的CO2及95%AIR的恒温培养箱中。一旦细胞在T25培养瓶中的生长融合度超过80%，即进行细胞传代操作。选择生长状态良好的细胞，接种到6孔板中，细胞密度为3×105/孔，并再次置于上述培养条件下培养24 h。实验设立了空白组和缺血性脑卒中模型组(缺血性脑卒中组)，每组均包含3个重复孔以确保实验结果的可靠性。空白组细胞继续用含体积分数10%胎牛血清的完全培养基培养，并置于常规培养箱中维持培养状态；缺血性脑卒中组利用大鼠海马神经元细胞构建OGD/R模型[12]：首先移除原有培养基，用PBS洗涤细胞后，更换为无糖DMEM培养基；将细胞放入缺氧罐中，并通入体积分数5% CO2-95% N2的混合气体，持续15 min后，在37 ℃下继续实施2 h的氧糖剥夺处理；再次更换培养基，将无糖DMEM替换为含糖DMEM培养基，并将细胞放回细胞培养箱(设定条件为37 ℃、体积分数5% CO2和95%空气)中继续培养24 h。
1.4.8 qPCR 检测采用Solarbio公司的TriQuick Reagent提取细胞的总RNA，使用多功能酶标仪精确测量RNA的浓度。取1 μL的RNA样本，直接通过酶标仪测定A260/280比值，评估RNA的纯度，理想的纯度范围应介于1.8-2.0之间。以提取的组织总RNA为模板，进行反转录操作，以获得cDNA。反应条件：42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。根据基因库基因序列设计引物，扩增引物，详见表1。设β-actin为内参。反应顺序包括95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，进行40个循环，反应结束后记录CT值，利用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.5 主要观察指标 ①芯片数据规范化处理后差异表达基因的识别；②差异基因富集分析；③机器学习模型的构建与验证；④免疫细胞浸润分析；⑤加权基因共同表达网络构建结果；⑥铜死亡相关基因筛选及相关性分析；⑦体外细胞实验验证结果。
1.6 统计学分析利用RStudio软件(4.3.1)和GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，计量资料用 x±s表示，数据均符合正态分布，采用 Student’s t检验分析两组之间的差异。P < 0.05表示两组之间差异有显著性意义。文中采用的统计学方法已经获得了广西中医药大学生物统计学领域专家的专业审核与认可。

讨论

最新研究表明，铜死亡在缺血性脑卒中中也起着关键作用[13-15]。此外，缺血性脑卒中的各个过程都有免疫细胞参与[16]，在缺血性脑卒中发作后，多种免疫细胞及免疫介质通过固有免疫及外周免疫应答机制，在外周及中枢神经系统内发挥作用，共同参与到缺血性损伤与神经保护的过程中[17]。缺血性脑卒中的早期，浸润的单核细胞分化形成的巨噬细胞缺少延迟缺血性脑卒中的加重，表明单核细胞导致急性缺血性脑卒中期间的脑部损伤加重[18]。然而，目前针对缺血性脑卒中发病机制中铜死亡与免疫浸润之间关联性的研究尚显不足。故此次研究通过寻找缺血性脑卒中早期诊断指标并进行验证，积极探索其潜在的治疗靶点。
此次研究采用生物信息学方法深入分析了GEO数据库中GSE16561数据集，成功鉴定出573个具有显著差异表达的基因。通过GO分析，发现这些差异表达基因主要集中分布在免疫反应的正调控、分泌颗粒膜以及免疫受体活性等多个生物学过程中。进一步的研究揭示，在缺血性脑卒中发生后，外周免疫系统中的中性粒细胞会迅速响应，迁移到受损的脑组织区域，并释放中性粒细胞外陷阱、多种炎性因子以及自由基等有害物质，从而进一步加剧脑组织的损伤程度[19-21]。KEGG结果显示差异表达基因主要富集于脂质与动脉粥样硬化、T细胞受体等信号通路。脂质与动脉粥样硬化家族的一些成员如TLR4，可以发挥抗神经炎症改善脑缺血再灌注损伤的作用[22-23]。此次研究还发现，在缺血性脑卒中发病的初期阶段，T淋巴细胞及其亚群即被迅速调动并激活。特别是CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞，它们大量涌入脑缺血区域，通过一系列复杂的机制，如诱导白细胞介素、细胞毒素以及穿孔素等炎症递质的释放，进而对神经元细胞造成显著的坏死和损伤[24-26]。
近年来，机器学习技术在临床领域的应用日益广泛[27]。
此次研究巧妙地运用了LASSO和Random Forest算法，从众多候选基因中筛选出了MFN2、PKM2、CREG1、FOXO3A这4个对于缺血性脑卒中具有诊断价值的生物标志物。在此基础上构建了一个诊断模型，并通过验证集数据对其诊断效能进行了严格验证，结果与预期一致，进一步确认了这4个标志物的诊断潜力。ROC曲线分析结果显示，MFN2、PKM2、CREG1和FOXO3A的AUC值分别达到了0.757，0.718，0.838和0.778，均超过了0.7的阈值，表明它们在缺血性脑卒中的诊断中具有较高的准确性；同时，验证集的数据分析结果与训练集高度一致，进一步巩固了这4个标志物的诊断可靠性。然而，值得注意的是，尽管研究在生物标志物筛选和诊断模型构建方面取得了初步成果，但未来仍需通过更为深入的实验研究来揭示这些标志物在缺血性脑卒中发病过程中的具体分子机制，为缺血性脑卒中的早期预测、预防和治疗提供更为坚实的理论基础和实践指导，以降低该疾病的发病率和相关并发症的风险。
此项研究深入探索了差异表达基因在免疫浸润方面的表现，对比了疾病组与对照组中各类免疫细胞的表达情况。结果揭示，在疾病组中，浆细胞、NK细胞静息以及巨噬细胞M0等的表达水平显著升高；同时，记忆B细胞、CD4+ T细胞以及CD8+ T细胞等免疫细胞的数量也存在显著差异。这些发现暗示，上述免疫细胞可能在缺血性脑卒中的发病过程中扮演着重要的角色。WGCNA结果显示，灰色模块与嗜酸性细胞之间存在高度正相关关系，而棕色模块则与巨噬细胞M0高度正相关。通过进一步的分析，确定了118个关键模块基因，这些基因可能在免疫浸润和缺血性脑卒中的发病过程中发挥核心作用。将这些WGCNA关键模块基因与铜死亡相关基因交叉分析，成功识别出2个Hub基因：MTF1和ATP7B，这2个基因不仅在铜死亡机制中扮演重要角色，而且与免疫浸润过程密切相关。为了进一步验证这一推测，对之前确定的4个诊断性基因(MFN2、PKM2、CREG1和FOXO3A)与这2个Hub基因进行了相关性分析，结果显示FOXO3A与MFN2、PKM2与BCL2L1、MTF1与MFN2、ATP7B与BCL2L1等的表达具有相关性。研究表明ATP7B mRNA在脑毛细血管中高于脉络丛和脑实质，铜转运蛋白在脑屏障中的表达高于在脑实质中的表达[28]；铜转运进入大脑主要是通过血脑屏障作为游离的铜离子实现的，并且血脑脊液屏障可以作为铜运转的主要调节位点。研究发现通过调节MTF1的表达来影响小胶质细胞的生长，从而修复脑损伤[29]。
此项研究构建的缺血性脑卒中细胞损伤模型使用qPCR实验进行验证，发现这些基因ATP7B、MTF1在空白组与缺血性脑卒中组中具有显著表达差异。因此，作者认为ATP7B、MTF1可能是诱导缺血性脑卒中的关键基因之一。研究对缺血性脑卒中的相关基因以及其涉及的通路进行了广泛的筛选工作，为缺血性脑卒中的研究靶点由来提供了依据。
研究通过生物信息学揭示了铜死亡相关基因在缺血性脑卒中中的表达模式，通过机器学习明确了MFN2，PKM2，CREG1，FOXO3A在缺血性脑卒中中的诊断价值，预测了缺血性脑卒中发病过程中铜死亡与免疫浸润相关的特征基因，并通过qPCR验证了ATP7B、MTF1基因可作为缺血性脑卒中铜死亡特征基因，这为探索缺血性脑卒中的发病机制及干预机制提供了一定的参考。实验结论虽然可信，但是也有不足之处：研究仅运用体外细胞实验证实ATP7B、MTF1在缺血性脑卒中细胞表达，尚缺体内动物实验及临床试验进行验证等问题。未来拟进一步通过前瞻性的临床研究和基础实验，为后续研究提供依据和借鉴。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

缺血性脑卒中诊断性生物标志物解析及靶向铜死亡相关基因的实验验证

Analysis of diagnostic biomarkers for ischemic stroke and experimental validation of targeted cuproptosis related genes

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[1]	李加根, 陈跃平, 黄柯琪, 陈尚桐, 黄川洪. 线粒体自噬视域下的类风湿关节炎：多机器学习算法构建预测模型及验证并免疫调控分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(在线): 1-15.
[2]	邓柯淇, 李光第, GOSWAMI ASHUTOSH, 刘星余, 何孝勇. 基于生物信息学对骨关节炎铁超载关键基因的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1972-1980.
[3]	刘琳, 刘世轩, 陆馨悦, 王侃. 慢性肌筋膜触发点模型大鼠的尿液代谢组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1585-1592.
[4]	赵嘉诚, 任诗齐, 祝秦, 刘佳佳, 朱翔, 杨洋. 原发性骨质疏松潜在生物标志物的生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1741-1750.
[5]	章镇宇, 梁秋健, 杨军, 韦相宇, 蒋捷, 黄林科, 谭桢. 新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1437-1447.
[6]	张昊军, 李泓毅, 张辉, 陈浩然, 张力中, 耿杰, 侯传东, 于琦, 贺培凤, 贾金鹏, 卢学春. 间充质细胞源性骨肉瘤中关键分子标志物鉴定及药物敏感性分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1448-1456.
[7]	王咪, 马书杰, 刘杨, 齐瑞. 缺血性脑卒中铁死亡特征基因NFE2L2的鉴定与验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1466-1474.
[8]	刘雅妮, 杨静欢, 陆慧慧, 易玉芳, 李智翔, 欧阳福, 吴璟莉, 魏兵. 纤维肌痛综合征生物标记物的筛选及免疫细胞浸润分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 1091-1100.
[9]	杨彬, 陶广义, 杨顺, 许俊杰, 黄俊卿. 人工智能在脊髓神经损伤与修复领域研究热点的可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 761-770.
[10]	杨定燕, 余振球, 杨中愉. 急性心肌梗死与中性粒细胞相关潜在生物标志物的机器学习分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7909-7920.
[11]	江启煜, 曾慧妍. 基于人工智能和组学数据驱动的中药潜在机制新型分析预测方法[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7552-7561.
[12]	巩月红, 王梦君, 任航, 郑辉, 孙佳佳, 刘军鹏, 张飞, 杨建华, 胡君萍. 机器学习联合生物信息学筛选与自噬相关的肺纤维化关键基因及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7679-7689.
[13]	韩杰, 潘成镇, 尚昱志, 张驰. 激素性股骨头坏死免疫诊断标志物的鉴定与药物筛选[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7690-7700.
[14]	李靖, 路广琦, 庄明辉, 崔莹, 俞张镜泽, 孙馨悦, 马明明, 朱立国, 于杰. 基于机器学习构建中青年人群颈椎失稳临床预测模型[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(33): 7203-7210.
[15]	王凯茹, 付士哲, 李家辉, 燕茹, 马玉茹, 师波, 冶从燕, 闫瑞, 丛广志, 贾绍斌. 亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1参与血管平滑肌细胞钙化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6836-6842.