2.1   实验动物数量分析   参与此次实验的SD大鼠共有31只，在20周，1只肝癌模型组大鼠因肝腹水死亡，23只大鼠造模成功，肝癌模型组11只、加味逍遥散组12只与空白对照组7只进入结果分析。
2.2   加味逍遥散对肝癌模型大鼠的抗肝癌作用   苏木精-伊红染色显示，空白对照组大鼠的肝细胞结构完整，胞质内颗粒清晰可见，且肝小叶中央静脉周围的肝细胞呈放射状排列；肝癌模型组肝细胞成团块状结节，伴有炎性细胞浸润；加味逍遥散治疗后肝小叶损伤且炎性细胞浸润等情况改善，见图1A。免疫组化结果显示，与空白对照组相比，肝癌模型组呈现出大量黄棕色，Glypican-3的累积吸光度值显著上升，提示Glypican-3的表达明显升高，加味逍遥散组Glypican-3的累积吸光度值有所降低，见图1B，C。
   大鼠体质量监测结果显示，空白对照组大鼠体质量持续稳定增长，模型组、加味逍遥散组大鼠总体体质量增长较缓，在造模期第4周由于毒性反应以及失血等影响，导致体质量有所下降。但模型组和加味逍遥散组间体质量没有显著统计学差异，见图1D。血清甲胎蛋白检测结果显示，空白对照组大鼠血清甲胎蛋白水平最低，肝癌模型组大鼠血清甲胎蛋白水平显著升高，加味逍遥散组治疗后甲胎蛋白水平有所降低，见图1E。
2.3   血浆外泌体表征   透射电子显微镜观察显示，分离出的物质为杯状或圆形囊泡，见图2A。纳米流式报告分析显示，外泌体颗粒大小的中心值均在60-70 nm，其中空白对照组为1.18×1011 particles/mL，加味逍遥散组为9.99×109 particles/mL，肝癌模型组为8.87×1010 particles/mL，见图2B。Western blot检测显示肝癌模型组CD63的表达水平增加，加味逍遥散组CD63的表达水平被抑制，见图2C。以上3种检测方法结果提示从空白对照组、肝癌模型组以及加味逍遥散组提取到的样本被鉴定为外泌体。



2.4   基于外泌体测序结果筛选差异表达的miRNA   肝癌模型组 vs. 空白对照组和加味逍遥散组 vs. 肝癌模型组进行组间比较，获得显著表达miRNA的log2FC和Fold Change值进行聚类分析，分别绘制热图和火山图对miRNA测序结果进行可视化处理，见图3A，B。结果显示肝癌模型组 vs. 空白对照组上调miRNA 34个，下调miRNA 31个。加味逍遥散组 vs. 肝癌模型组上调miRNA 26个，下调miRNA 11个。



为进一步探索加味逍遥散对肝癌大鼠外泌体miRNA异常表达的影响，对肝癌模型组vs.空白对照组上调而加味逍遥散组vs.肝癌模型组下调的促癌miRNA，以及肝癌模型组vs.空白对照组下调同时加味逍遥散组vs.肝癌模型组上调的抑癌miRNA进行交叉对比，目的是寻找肝癌模型组 vs. 空白对照组和加味逍遥散组 vs. 肝癌模型组间共同调节的miRNA。结果共获得6个显著表达的miRNA：
miR-23b-5p、miR-146b-3p、miR-672-3p、miR-147、miR-674-3p、miR-223-3p (P < 0.05，log2FC >1或< -1.45)。
2.5   加味逍遥散-肝癌-miR-223-3p下游靶蛋白预测   加味逍遥散、肝癌和miR-223-3p三者交集靶基因3个，分别是：NCOA1、E2F1、RASA1，见图4。
2.6   交集靶基因的生物信息学分析   从近5年生存率来看，与高表达组相比，低表达NCOA1和E2F1组总生存率更高，见图5A，B，提示在肝癌中高表达的NCOA1和E2F1预后较差(HR > 1，P < 0.05)。RASA1的生存分析无统计学意义。Cox比例风险回归分析显示：E2F1与肝癌预后显著相关(P < 0.05)，TNM分期可能成为治疗肝癌的一个独立预后因素，见图5C，D。泛癌分析显示，NCOA1和E2F1在多种癌症中高表达；与癌旁组织相比，NCOA1和E2F1在肝癌组织中均显著高表达(P < 0.01)，见图6A-D。基于GEO数据库115例肝癌组织和52例癌旁组织的GSE76427数据集验证NCOA1和E2F1在肝癌中的表达趋势与上述结果保持一致(P < 0.05)，见图6E，F。通过 miRNA 和靶基因 mRNA 序列特征比对，结果显示E2F1和NCOA1基因的mRNA 3’UTR均与miR-223-3p存在互作结合位点，见图7A，B。已有研究表明E2F1在肝癌中高表达。双荧光素酶报告基因检测miR-223-3p靶向负调控E2F1，即在非酒精性脂肪肝病中上调miR-223-3p可以抑制E2F1的表达[16]。

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肝癌死亡率在全球癌症中位居第三[1]。尽管目前肝移植、手术切除以及抗癌药物等治疗手段在一定程度上改善了肝癌患者的生存率[2-3]，但由于肝癌发病隐匿、早期诊断困难、进展速度快、预后较差等复杂性因素，导致肝癌的全球发病率仍持续攀升，因此寻找有效的诊断方法和治疗策略是当前科研以及临床领域攻克肝癌的共同目标[4]。
外泌体是由细胞分泌到外周环境中的小型膜囊泡，直径为30-150 nm，它们可以携带包括蛋白质、脂质以及miRNA在内的多种生物大分子[5-6]，充当细胞间媒介的角色，尤其是miRNA，通过调控目标基因的表达，参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等众多生物学过程[7-10]，介导肿瘤的发生和发展[11-13]。
逍遥散出自《太平惠民合剂局方》，是治疗肝郁血虚脾弱证的常用方。加味逍遥散则是在此基础上加减而来，全方由柴胡、当归、延胡索、赤芍、白芍、党参、丹参、炒白术、炒枳实、炒二芽、茯苓、薏苡仁、栀子、丹皮、陈皮、生甘草组成。前期研究发现加味逍遥散能够调节肝功能并降低肿瘤标志物的表达水平，具有显著的抗肝癌效应[14]，但机制不明。
鉴于外泌体miRNA在肿瘤发生发展中的重要作用，该研究探讨加味逍遥散通过外泌体miRNA途径发挥抗肝癌作用的可能机制，为肝癌的治疗提供新的视角和理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   通过二乙基亚硝胺慢性诱导构建SD肝癌大鼠模型进行相关动物实验。
1.2   时间及地点   实验于2019年3-12月在广西中医药大学科学实验中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SPF级SD大鼠31只，雄性，体质量180-200 g，放置在通风良好的动物室内，光/暗周期为12 h，恒温22 ℃，购自湖南斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0001。所有实验流程均按照实验动物福利委员会(IACUC)的指导原则，并通过广西中医药大学动物伦理委员会批准(伦理审定代码：DW20190213-016)。
1.3.2   试剂与仪器   纯度0.95 mg/mL的二乙基亚硝胺购自上海麦克林生化科技有限公司，在100 mL生理盐水中加入0.4 mL二乙基亚硝胺，振荡混匀，配成质量浓度为4 mg/mL的溶液，避光保存。苏木精-伊红染色试剂盒购自福州迈新公司；一抗Anti-CD63 Rabbit mAb购自美国SantaCruz公司；二抗HRP-conjugatedanti-mouseIgG购自美国Cell Signaling公司；Qubit蛋白检测试剂盒购自ThermoFisher公司，型号：Q33211；甲胎蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒购自中国武汉CUSABIO公司；超速离心机购自美国BECKMAN COUlTER公司，型号：Optima XE-100 Ultracentrifuge，离心管型号：344062，转子型号：SW60TI；BX43型透射电镜购自日本Olympus公司；纳米流式分析仪购自厦门福流生物科技有限公司，型号：Flow NanoAnalyzer U30E。
1.4   实验方法   
1.4.1   动物分组及模型制备   将31只SD大鼠随机分为空白对照组7只、肝癌模型组12只、加味逍遥散组12只。
大鼠肝癌模型制备：适应性喂养1周后，肝癌模型组和加味逍遥散组大鼠腹腔注射25 mg/kg二乙基亚硝胺，每周3次，持续给药至第12周。
干预方法：从第17周开始，加味逍遥散组大鼠给予加味逍遥散灌服[参照《药理实验方法学》及“药理试验中动物与人体间的等效剂量”的换算法：大鼠生药给药剂量=人(按60 kg计算)临床给药剂量×换算系数(按6.17计算)[15]，以6.0 mL/kg给药，每日1次，直至第20周末停药]，空白对照组和肝癌模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃。其中在第16周开始加味逍遥散治疗前，随机处死肝癌模型组1只大鼠和加味逍遥散组2只大鼠验证肝癌造模情况，在第20周对各组大鼠麻醉后进行肝组织取样和腹主动脉采血(说明：在第20周给药前，1只模型组大鼠因肝腹水死亡)。
1.4.2   药物制备   加味逍遥散组成：柴胡10 g、当归10 g、延胡索15 g、赤芍15 g、白芍15 g、党参10 g、丹参20 g、炒白术10 g、炒枳实15 g、炒二芽各10 g、茯苓15 g、薏苡仁15 g、栀子6 g、丹皮10 g、陈皮15 g、生甘草6 g，以上药物均购自广西中医药大学第一附属医院门诊部，经广西中医药大学药学院中药鉴定室鉴定后使用。按8倍量体积分数85%乙醇方法醇取后加热回流2次，用真空泵抽取滤液，合并2次滤液后将其浓缩，按生药量计算，浓缩后质量浓度约为3.55 g/mL。
1.4.3   苏木精-伊红染色   在第20周，每组取6只大鼠，用3%戊巴比妥钠(0.01 mL/kg)腹腔注射麻醉，30 g/L多聚甲醛进行灌注固定。取出肝脏后，将组织样本通过不同体积分数的乙醇(70%，80%，90%，100%)进行递进脱水处理，每个体积分数浸泡30 min，以彻底去除组织中的水分，再用二甲苯脱蜡浸泡30 min，以去除组织中的脱水剂。经过脱水和脱蜡处理后，石蜡包埋。从石蜡包埋的样本中切取30 μm厚的切片，放于60 ℃恒温烘箱中烘烤30 min，以去除切片中的石蜡。最后进行苏木精-伊红染色。染色完成后，滴入中性树胶封固，显微镜观察。
1.4.4   免疫组织化学染色   取肝组织切片在60 ℃恒温烘箱中烘烤1 h，然后在二甲苯中脱蜡，并放置乙醇中重水化，用5% PBS稀释的胎牛血清封闭，室温条件下孵育15 min，以减少非特异性结合。用体积分数3% H2O2孵育5 min，淬灭内源性过氧化物酶的活性，PBST清洗3次，每次5 min；随后将切片放入pH=6.0的柠檬酸缓冲液中，高温加热2 min进行抗原修复，PBST清洗3次，每次5 min，加入一抗兔多克隆抗体(Glypican-3)，4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，每次5 min，加入二抗37 ℃孵育10 min，PBS浸洗3次，DAB显色，随即用PBS终止染色，体积分数递增的乙醇脱水后用二甲苯封固，光学显微镜观察。染色强度通过使用基于计算机的Image-Pro软件测量累积吸光度值来确定。每组随机选取至少3个切片进行分析，计算其平均值以得到结果。
1.4.5   血清甲胎蛋白水平检测   使用ELISA试剂盒对各组大鼠血清中的甲胎蛋白水平进行检测，将血清从-20 ℃冰箱取出室温解冻，ELISA试剂盒室温平衡20 min后，从铝箔袋中取出所需的板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度标准品50 μL，样本孔加待测血清样本50 μL。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min，弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔的吸光度值。
1.4.6   外泌体的分离   腹主动脉采血后，分离各组大鼠血浆，转移到新的离心管中，精准配平后，放入离心机中以500×g离心5 min，将上清液转移到新的聚碳酸酯管中，以2 000×g离心10 min以消除样品中的碎屑成分，收集上清液并转移至新的聚碳酸酯管中，以10 000×g离心30 min以消除脱落的微囊泡。收集上清液，并用 0.22 μm 滤膜器过滤，以100 000×g离心2 h，离心后取沉淀，即为外泌体(注意：更长的时间会损坏外泌体)。
1.4.7   血浆外泌体的表征   超分离后获得外泌体，在4 ℃下用2%戊二醛固定1 h，PBS冲洗4次，每次15 min；1%四氧化锇固定2 h，用ddH2O冲洗2次，每次10 min；2%碳酸铀溶液染色2 h；脱水：将外泌体样本依次置于不同体积分数(50%，70%，90%，100%)的乙醇溶液中，每个体积分数处理10 min，然后置于100%丙酮1和100%丙酮2中，分别处理10 min，以确保完全脱水。将外泌体样品4 ℃孵育15 min，目的是稳定样本，以准备下一步处理；渗透：加入丙酮和包埋剂(1∶1)，在室温下孵育2 h，然后加入纯包埋剂，在室温下孵育过夜；聚合：37 ℃ 培养箱12 h，-45 ℃培养箱12 h，-60 ℃ 培养箱48 h；准备超薄切片，透射电镜下观察。
使用Flow Nano Analyzer分析外泌体粒径和浓度。样品稀释范围(1-5)×1010 μg/mL，使用抗体：Antibody Mouse Anti-Human CD9 AlexaFluor 647，Mouse Anti-Human CD63 AlexaFluor 647和Mouse Anti-Human CD81 FITC，Flow Nano Analyzer分析的仪器参数：laser，8 mW，488 nm；SSdecay，10%； sampling pressure，1.0 kPa，记录时间：1 min。FITC的525/40滤光片和PerCPCy5.5的670/30滤光片。使用Nano FCM Profession V2.0 软件计算颗粒浓度和大小分布。
Western blot检测血浆外泌体表面标志物CD63的蛋白表达。根据QubitTM Protein Assay Kit说明书对外泌体蛋白进行定量检测，空白对照组、肝癌模型组和加味逍遥散组外泌体蛋白质的质量浓度分别为1 705，1 815和2 140 μg/mL。一抗：Anti-CD63 Rabbit mAb，1∶1 000；二抗：HRP-conjugated anti-mouse IgG，1∶3 000。
1.4.8   血浆外泌体RNA的提取   从-80 ℃冰箱中取出外泌体样本，转移到新的离心管中，并与TRIzol试剂混合后加入氯仿，紧闭管帽，剧烈振荡15 s后提取样品中的RNA，以4 ℃、12 000×g离心15 min，离心后将水相转移到新管中，加入异丙醇，混合其中的RNA以沉淀，再次以4 ℃、12 000×g离心10 min，除去上清液，加入体积分数75%乙醇，清洗RNA沉淀，振荡，以4 ℃、7 500×g离心5 min除去上清液，加入DEPC处理水溶解沉淀获得RNA溶液。

1.4.9   血浆外泌体miRNA高通量测序   分离外泌体后，提取总RNA样品，并经过琼脂糖电泳和Nanodrop质量检查和定量后，构建了miRNA文库。为确保只有单链DNA参与测序过程，将文库NaOH变形转化为单链DNA，根据供应商的说明在Illumina NextSeq 500测序仪上进行51循环测序。测序完成后，使用Solexa CHASTITY质控筛选原始Reads得到Clean Reads。用cutadapt对Clean Reads去接头，并留下长度≥15 nt的Tag得到trimmed reads。利用miRDeep2 软件对所有trimmed reads进行已知miRNA定量和miRNA预测。基于CPM标准化的miRNA，使用R软件edgeR进行差异表达计算，筛选差异miRNA(根据log2FC和Fold Change值排名前10的miRNA见表1)。

1.4.10   生物信息学分析   通过TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)和GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库获得加味逍遥散全方靶基因以及肝癌疾病靶点，miR-223-3p的靶基因依托于TargetScan Human8.0(https://www.targetscan.org/vert_80/)、miRPathDB(https://mpd.bioinf.uni-sb.de/overview.html)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)3个数据库取交集，将加味逍遥散及肝癌疾病靶点分别与miR-223-3p的靶基因取交集，Bioinformatics & Evolutionary Genomics可视化(https://mpd.bioinf.
uni-sb.de/overview.html)获得交集基因，对交集基因行生存曲线的分析以及单因素和多因素的Cox回归分析并通过“forestplot”包绘制森林图。利用TNMplot(htps:/thmplot.comlanalysis/)和ENCORI(https://rnasysu.com/encori/index.php)在线网站预测miR-223-3p和交集基因在肝癌和癌旁组织中的表达，利用TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载肝癌的RNA-seq数据，将基因表达数据和临床数据合并，使用survival R包进行生存分析的曲线图绘制，并通过R软件v4.0.3进行泛癌统计分析。
   从美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站GEO公共基因表达数据库中下载GSE76427数据集对交集基因的表达水平进行验证，利用StarBase(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)和TargetScan(https://www.targetscan.org/)数据库，将miRNA和靶基因mRNA序列特征比对，获取miRNA-mRNA结合位点。
1.5   主要观察指标   ①苏木精-伊红染色观察大鼠肝组织的形态结构；②免疫组织化学检测肝癌标志物Glypican-3蛋白表达；③ELISA试剂盒检测大鼠血清中甲胎蛋白水平；④透射电子显微镜观察外泌体形态；⑤纳米流式检测外泌体颗粒粒径大小和浓度；⑥Western blot检测血浆外泌体表面标志物CD63的蛋白表达；⑦高通量测序筛选具有差异表达的miRNA；⑧基于生物信息学对加味逍遥散、肝癌和miR-223-3p的交集靶基因行功能分析。

1.6   统计学分析   采用SPSS 27.0统计学软件进行统计分析，结果用x±s表示，多组间比较符合正态分布时采用one-way ANOVA单因素方差分析，不符合正态分布时用秩和检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过广西中医药大学生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

肝癌是起源于肝脏的恶性肿瘤，由于其发病的高隐匿性，初期症状不明显，少部分人会有食欲不振、上腹闷胀等；中晚期在临床上的典型症状多为右上腹持续或间歇性疼痛，消化系统异常，可见乏力消瘦、呕吐腹泻甚或吐血、发热、腹水、肝肿大、黄疸等综合表现[17]。纵观古医籍文献中没有“肝癌”一词的明确记载，但有对于“癥瘕”“积聚”“肝积”“黄疸”“鼓胀”“胁痛”等疾病的散在描述，与现代医学对肝癌的临床表现和体征相似，后世医家将其归属于肝癌范畴。中医学认为肝癌的病位在肝，病因病机多是肝脏气血虚损，加之情志内伤、饮食不节、癌毒侵袭致使“肝失疏泄”，气血痰瘀结而成积[18]。此次研究的加味逍遥散是在逍遥散的基础上增加了党参和丹参，达到补益脾气、兼以生津养血的功效，延胡索活血行气，丹参活血祛瘀，二者行血中之气，散血中之瘀，炒二芽、炒枳实、薏苡仁都可健脾养胃、温中燥湿、化痰散痞，陈皮助佐使药理气健脾，燥湿化痰，栀子、丹皮清热泄火，整方具有调和肝脾、疏肝解郁、养血健脾等功效。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (Glypican-3)是一种固定在细胞膜上的特殊癌胎蛋白多糖，通过糖基磷脂锚与细胞膜相连。这种蛋白质在胎儿的肝脏中可以被检测到，但在健康成人的肝脏中通常是不表达的。近年来，针对Glypican-3的靶向诊断技术，如MRI、正电子发射断层扫描和近红外成像，已被开发用于肝癌的早期诊断[19]。此外，针对Glypican-3的免疫治疗制剂的研发，进一步凸显了其具有成为肝癌治疗中关键生物标志物的潜力。在肝癌细胞中，Glypican-3的表达显著增加，而在正常肝细胞以及多种非肝细胞癌症中，Glypican-3表达较低或不表达，这一特点使Glypican-3成为区分肝癌与其他肝病变的有力指标，同时也为针对肝癌的精准治疗提供了靶点[20-21]。甲胎蛋白是一种在胎儿发育过程中主要由肝细胞和卵黄囊合成的糖蛋白。在胎儿期，甲胎蛋白水平非常高，但出生后其水平会迅速下降到成人的正常范围[22]。甲胎蛋白具有多种生物学功能，包括调节生长因子的活性、抑制免疫反应以及诱导T淋巴细胞的凋亡等，与肝癌等多种癌症的发生发展密切相关。在临床上，甲胎蛋白常用作肝癌的血清标志物，帮助原发性肝癌的辨别诊断及疗效检测[23]。
二乙基亚硝胺是肝癌造模的常用试剂，也是公认的肝癌动物模型制备的造模剂[24-26]。KRISHNAN等[27]利用单剂量(200 mg/kg)二乙基亚硝胺联合0.05%苯巴比妥给予健康雄性SD大鼠连续给药16周，通过Sreepriya方法促成肝癌，评估结节发生率、肝标志酶以及免疫组织病理学变化验证肝癌造模的成功。CHEN等[28]将20 d的C57BL和C3H小鼠连续8个月或12个月腹膜内注射二乙基亚硝胺
(14 μg/g剂量)诱发肝脏肿瘤发生。此次实验的肝癌模型组和加味逍遥散组是将健康的SPF级SD大鼠腹腔注射25 mg/kg 二乙基亚硝胺，每周3次，持续给药至第12周。为了检验此次建模方法的可靠性，进行了肝组织损伤评估验证，结果显示模型组肝脏颜色较深，且有散在灰白色结节，模型组Glypican-3的表达较空白对照组明显升高，则表明肝癌模型动物造模成功[29-30]，加味逍遥散干预后，肝组织颜色变浅，结节数量减少，Glypican-3的表达有所减少，大鼠血清甲胎蛋白水平显著降低，提示加味逍遥散具有明显的抗肝癌效应，但其机制有待进一步探索。
外泌体也称多囊泡体，来源于晚期核内体，是活细胞经过内吞-融合-外排等一系列调控过程而形成的膜性囊泡[31]，内含RNA、蛋白质、DNA 片段等多种成分，在血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等多种体液中均有分布，且可通过血脑屏障，具有介导细胞间通讯及信息传递的作用[32]。miRNA是一种17-24个核苷酸的小非编码RNA，通过与mRNA上互补序列结合的方式促进mRNA降解或翻译抑制[33]，以此介导基因转录后调控，参与癌症进展。miR-34a-5p是miR-34a前体5’端产生的成熟microRNA，两项体内和体外实验分别证实了过表达miR-34a-5p通过靶向靶基因MET或VEGFA可以抑制HCC细胞增殖、侵袭并促进细胞凋亡，阻止肝癌裸鼠移植瘤的生长[34]。CPUⅡ的抗肝癌作用机制与其调控miR-122的表达来影响IGF-1R信号通路以抑制下游PI3K、Akt等基因表达有关。此外，在肝细胞癌患者血清和细胞中miR-16显著低表达，而胸腺醌通过上调miR-16和miR-375的表达发挥抗肝癌特性[35]。外泌体miRNA在肝癌发展机制中的作用不容忽视，于是从肝癌大鼠血浆提取外泌体，并运用透射电子显微镜、纳米流式分析、Western blot对提取到的样本行外泌体表征鉴定，结果显示提取到的样本在形态结构、粒径浓度、蛋白标志物表达上面均符合公认的外泌体标准。
近年来，miRNA高通量测序技术的出现为肝癌临床诊断和靶向治疗提供了诸多潜在的生物标志物[36]。因此该研究以外泌体miRNA为研究对象，通过高通量测序筛选出肝癌外泌体中差异表达的miRNA，旨在阐明加味逍遥散通过外泌体miRNA途径发挥治疗肝癌的机制。首先，对肝癌大鼠血浆外泌体进行miRNA测序，并对测序结果进行交叉比对，目的是筛选肝癌模型组vs.空白对照组和加味逍遥散组vs.肝癌模型组共同调节的miRNA，结果筛选出6个miRNA。加味逍遥散可能是通过这6个miRNA途径发挥抗肝癌作用，这提示加味逍遥散发挥的治疗作用不仅是下调和(或)上调某一类miRNA，而且同时上调和(或)下调多种miRNA发挥整体调节作用。通过文献研究发现关于miR-223-3p的研究颇多，加味逍遥散上调的miR-223-3p既可以在肺癌等肿瘤中充当抑制剂又可以加速胃癌的发展，在癌症中发挥双重作用[37]。miR-223与肿瘤的发生、炎症等密切相关，研究证明miR-223的过表达导致NLRP3蛋白减少并抑制炎性小体产生白细胞介素1b[38]，此外过表达miR-223-3p抑制HCC细胞增殖和克隆形成并促进细胞凋亡，其机制可能与靶向下调RAC1表达有关[39]。已有实验表明，miR-223-3p在肝癌组织以及肝癌血浆外泌体中显著低表达[40-42]。基于以上文献研究可见miR-223-3p在肝癌中的表达与此次测序结果相一致，它在包含癌症等很多疾病中下调。于是，为了进一步探索加味逍遥散的抗肝癌机制，通过生物信息学的方式对加味逍遥散上调miR-223-3p的下游调控因子进行预测。
首先，为进一步明确加味逍遥散治疗肝癌的作用机制，利用TCMSP和GeneCards数据库整合加味逍遥散全方靶基因和肝癌靶基因，通过网络药理学分别构建加味逍遥散-肝癌-miR-223-3p的交集靶基因图，获得交集基因3个：NCOA1、E2F1、RASA1。从生存分析和COX回归分析来看，高表达NCOA1和E2F1组预后较差，尤其是E2F1与肝癌的预后显著相关，结果提示TNM分期可能成为治疗肝癌的一个独立预后因素。泛癌分析显示：NCOA1和E2F1在多种癌症中高表达，与癌旁组织相比，两者在肝癌组织中均高表达。通过GEO公共基因表达数据库中的肝癌数据集GSE76427对NCOA1和E2F1的表达水平进行验证，结果与预测结果一致。已有实验证明miR-223-3p通过结合E2F1的3’UTR负向调控E2F1，为了证明miR-223-3p对E2F1和NCOA1的靶向性，利用生物信息学数据库StarBase和TargetScan，将miRNA和靶基因mRNA序列特征比对发现，miR-223-3p与靶基因E2F1、NCOA1的mRNA结合位点互补，说明该miRNA-mRNA存在潜在结合位点。由此认为加味逍遥散可能是通过上调miR-223-3p靶向下调E2F1或NCOA1的表达来抑制肝癌的发生
发展。
E2F1是由人类E2F1基因编码出的第一个蛋白质，它作为E2F转录家族的一员，在多种癌组织和癌细胞中高表达，与癌症的发生发展密切相关[43-44]。对E2F1在肝细胞癌中的功能和相关通路分析显示：E2F1作为细胞周期调节因子，调节G1期到 S期的转换，参与DNA修复以及细胞凋亡[45]。另外负调控生物素代谢，对DNA复制发挥正调控的作用；E2F1转录因子具有转录依赖性功能，可促进损伤部位的DNA修复，如在细胞发生DNA损伤时，E2F1受到生长因子等刺激被活化，促进S期进入G1期，并诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长[46-48]。它也参与血管生成，与肿瘤增殖呈正相关。E2F1可以充当促癌因子，为肿瘤提供氧气和养分，加速肿瘤生长、扩散。另外E2F1正调控PI3K/AKT/mToR信号通路，在肝细胞肝癌中，E2F1转录激活GINS2通过PI3K-AKT-mTOR途径促进肿瘤进展[49]。E2F1可通过转录与USP11形成正反馈环并调节其表达从而激活ERK/mTOR信号通路，发挥促癌并抑制自噬的作用[50]。转录因子E2F1通过与其启动子结合来增强CKS2表达，并调节癌症相关的PI3K-AKT通路[51]。E2F1是一种非常重要的转录调节因子，参与细胞周期进程和凋亡，在肿瘤发生和发展中的机制有待深入。
NCOA1即核受体共激活剂，具有转录激活子的功能，可以直接结合多种核受体，例如类固醇、类维生素A、甲状腺激素、前列腺素和诸多转录因子结合并以激素依赖性增强它们的转录活性[52-53]，此外，对NCOA1在肝细胞癌中的功能和相关通路进行了分析，结果提示NCOA1与血管生成、DNA复制、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤增殖等正相关，并通过P53、TGF-β以及PI3K/AKT/mTOR等信号通路参与肝细胞癌的进展。已有研究表明，抑制NCOA1的过表达会阻碍癌细胞的增殖与转移，在乳腺癌中，NCOA1的过表达会导致巨噬细胞集落刺激因子的表达上调，从而导致较多的巨噬细胞募集促进癌细胞的转移[54]。在内毒素诱导的心肌功能障碍下，NCOA1可调节促炎细胞因子的表达，通过转录CREB结合蛋白和NF-κB亚基组装，依赖性结合促炎细胞因子基因的启动子并激活其表达[55]，NCOA1可以调节基因表达并影响多个信号通路，在血管生成、DNA复制和细胞凋亡等多个细胞生物学过程中发挥重要作用，有望成为肝癌的潜在治疗靶标。综上所述，推测加味逍遥散可能是通过上调血浆外泌体miR-223-3p靶向负调控E2F1、NCOA1发挥抗肝癌的
效应。
该研究通过构建大鼠肝癌模型对加味逍遥散在体内发挥抗肝癌作用进行了相关检测，运用高通量测序技术结合生物信息学等综合分析提示加味逍遥散抗肝癌作用可能是通过外泌体miR-223-3p靶向负调控E2F1/NCOA1介导的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

外泌体：是体内大多数细胞分泌的直径为30-150 nm的小囊泡。它们具有典型的双层膜结构，由核酸、蛋白质、脂质和氨基酸等内容物构成。外泌体广泛存在于脑脊液、血液、母乳等多种体液中，介导细胞间通讯，参与蛋白质和RNA的运输、免疫应答以及肿瘤生长和侵袭的调控。

高通量测序技术：又称次世代测序，它允许在极短的时间内同时测定数百万到数十亿个DNA分子的序列，是目前先进的基因组分析方法。高通量测序技术显著提升了测序速度和规模，降低了成本，使得全基因组测序、转录组学、表观遗传学和多组学研究变得可行且经济，为生物医学研究、精准医疗、遗传病诊断、个体化治疗提供了强大的分子基础和数据支撑。

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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

外泌体作为含有蛋白质和RNAs等多种组分的纳米囊泡，参与细胞间通讯，在人体各种体液中含量丰富且稳定存在。最新研究发现，外泌体液体活检因具有非侵入性、取材便捷、高效诊断等优势有望纵向采样跟踪肝癌进展。基于外泌体作为肝癌诊断标志物的热点及现有西药治疗肝癌的匮乏困境，中药以其天然、低毒、高效、经济的优势，成为临床辅助治疗肝癌的重要手段，但其发挥抗肝癌效应及其作用机制尚不明确。本研究借助miRNA测序和生物信息学技术，从肝癌大鼠血浆外泌体中筛选出具有肝癌诊断和疗效评价潜力的生物标志物，这不仅有助于开辟肝癌无创性诊断的新方向，而且也为加味逍遥散通过外泌体miRNA途径发挥抗肝癌效应提供有价值的实验依据。

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