年轻和老年小鼠脂肪来源干细胞生物学特性对比

doi:10.12307/2025.076

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 4063-4068.doi: 10.12307/2025.076

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年轻和老年小鼠脂肪来源干细胞生物学特性对比

林美玉1，2，3，姚翔1，2，3，高景1，2，3，赵玺龙1，2，3，潘兴华1，2，3，阮光萍1，2，3

1解放军联勤保障部队第九二〇医院基础医学实验室，云南省昆明市 650032；2干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程研究中心，云南省昆明市 650032；3云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032

收稿日期:2024-03-15 接受日期:2024-05-07 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-13
通讯作者: 阮光萍，博士，副主任医师，解放军联勤保障部队第九二〇医院基础医学实验室，云南省昆明市 650032；干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程研究中心，云南省昆明市 650032；云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032
作者简介:林美玉，女，1999年生，山东省临沂市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事干细胞抗衰老的研究。
基金资助:
云南省科技计划项目重大科技专项(2018ZF007)，项目负责人：潘兴华；云南省重点项目(202101AS070039)，项目负责人：阮光萍；中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院院管课题(2020YGD12)，项目负责人：阮光萍

Comparison of biological characteristics of adipose-derived stem cells in young and old mice

Lin Meiyu1, 2, 3, Yao Xiang1, 2, 3, Gao Jing1, 2, 3, Zhao Xilong1, 2, 3, Pan Xinghua1, 2, 3, Ruan Guangping1, 2, 3

1Basic Medical Laboratory of 920 Hospital of the Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 2Integrated Engineering Research Center of Cell Biological Medicine of State and Regions, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 3Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2024-03-15 Accepted:2024-05-07 Online:2025-07-08 Published:2024-09-13
Contact: Ruan Guangping, MD, Associate chief physician, Basic Medical Laboratory of 920 Hospital of the Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Integrated Engineering Research Center of Cell Biological Medicine of State and Regions, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Lin Meiyu, Master candidate, Basic Medical Laboratory of 920 Hospital of the Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Integrated Engineering Research Center of Cell Biological Medicine of State and Regions, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
Major Science and Technology Project of Yunnan Science and Technology Plan Project, No. 2018ZF007 (to PXH); Key Project of Yunnan Province, No. 202101AS070039 (to RGP); In-Hospital Technology Plan of 920 Hospital of the Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, No. 2020YGD12 (to RGP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脂肪来源干细胞：是一种从脂肪组织分离提取的成体间充质干细胞，可自我更新并分化为脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞、成骨细胞、神经细胞等细胞谱系。
衰老：机体从构成物质、组织结构到生理功能的丧失和退化过程。近来在动物体内已发现一些与衰老有关的基因，例如p21和p27基因对细胞衰老进程有重要影响。

摘要
背景：脂肪来源干细胞具有抗衰老的作用，但来自不同年龄供者的脂肪来源干细胞是否有区别，还需深入研究。
目的：对比老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞的生物学特性。
方法：分别从8周龄、14周龄C57BL小鼠脂肪组织中提取脂肪来源干细胞，对比分析老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞的细胞周期、凋亡、增殖能力的差异，定量PCR和Western blot检测老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞衰老相关P21、P27基因和蛋白的表达。

结果与结论：与老年小鼠脂肪来源干细胞相比，年轻小鼠脂肪来源干细胞更有活力，形态更规则，凋亡更少，增殖更快，衰老相关P21、P27基因和蛋白表达量更低，说明年轻小鼠脂肪来源干细胞具有更好的抗衰老作用。

https://orcid.org/0000-0002-3784-7040 (阮光萍)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪来源干细胞, 脂肪组织, 年轻, 老年, 小鼠, 抗衰老

Abstract: BACKGROUND: Adipose-derived stem cells have anti-aging effects, but whether adipose-derived stem cells from donors of different ages are different needs further study.
OBJECTIVE: To compare the biological properties of adipose-derived stem cells in old and young mice.
METHODS: Adipose-derived stem cells were extracted from adipose tissue of C57BL mice aged 8 and 14 weeks, respectively. The differences of cell cycle, apoptosis, and proliferation of adipose-derived stem cells in old and young mice were compared. The expression levels of aging-related P21 and P27 genes and proteins of adipose-derived stem cells in old and young mice were detected by quantitative PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with old mouse adipose-derived stem cells, young mouse adipose-derived stem cells were more active, more regular in morphology, less apoptosis, faster proliferation, and lower in expression of age-related P21 and P27 genes and proteins. It has been proven that adipose-derived stem cells from young mice have better anti-aging effects.

Key words: adipose-derived stem cell, adipose tissue, young, old age, mouse, anti-aging

中图分类号:

林美玉, 姚翔, 高景, 赵玺龙, 潘兴华, 阮光萍. 年轻和老年小鼠脂肪来源干细胞生物学特性对比[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4063-4068.

Lin Meiyu, Yao Xiang, Gao Jing, Zhao Xilong, Pan Xinghua, Ruan Guangping. Comparison of biological characteristics of adipose-derived stem cells in young and old mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 4063-4068.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞观察实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年1-12月在解放军联勤保障部队第九二〇医院基础医学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 C57BL小鼠10只，其中8周龄5只，14周龄5只，雌雄不限，体质量24-25 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2019-0010，SPF级饲养环境。实验方案经联勤保障部队第九二〇医院动物实验伦理委员会批准，审批号为伦审2019-002(科)-01。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂和仪器 磷酸盐缓冲液(索莱宝，P1003)；胎牛血清(Bio-Channel，BC-SE-FBS07)；α-MEM培养基(Bio-Channel，BC-M-020)；EDTA-胰酶(Biosharp，BL512A)；双抗(Biosharp，BL505A)；胶原酶Ⅱ(索莱宝，C8150)；TRIzol®Reagent(Life，Cat.no.15596-018)；SureScript™ First-Strand cDNA Synthesis Kit(GeneCopoeia，QP056)；BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR Mix 2.0(GeneCopoeia，QP031)。二氧化碳培养箱[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，CI-191C]；高压灭菌锅(山东新华医疗器械股份有限公司，LMQC-801)；电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司，DK-8D)；无菌操作台(苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-1FD)；倒置显微镜(卡尔蔡司，AE2000)；流式仪细胞(Thermo Fisher)。
1.4 实验方法
1.4.1 年轻和老年小鼠ADSCs的分离培养 从年轻和老年小鼠腹部、大腿内侧、椎旁区、肠系膜和睾丸的皮下组织中剥离脂肪组织，用5%双抗浸泡30 min，PBS清洗。将处理好的脂肪组织放入小皿中用灭菌的小剪刀剪碎至糜状，加入1 mg/mL胶原酶Ⅱ，完全浸泡组织，用注射器将组织转移至15 mL或者50 mL离心管中，用封口胶封住管口，放入37 ℃水浴锅中不断摇晃，消化30 min；加入α-MEM完全培养基终止消化，用尼龙网过滤，收集滤液，1 300 r/min离心10 min，弃去上清；换新的离心管加入PBS清洗1遍，离心，弃去上清，加入α-MEM完全培养基重悬接种于6孔板中；过夜贴壁之后换液(以减少潜在的内皮细胞和巨噬细胞污染)继续培养，每天拍照记录。待细胞长满后进行传代培养，实验用的是第3代ADSCs。
1.4.2 流式检测细胞表型 吸弃细胞培养板内的培养液，用PBS冲洗细胞两三次，至背景干净，无死细胞悬浮，加入适量(如1 mL)0.25%胰酶，润洗一遍后立即弃去，观察细胞的形态和聚集程度后，置于37 ℃培养箱孵育数十秒至细胞均皱缩变圆时，立即加入适量的含有胎牛血清的α-MEM完全培养基终止消化，轻轻吹打，使细胞分散，制成单细胞悬液，350×g离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS重悬细胞，350×g离心5 min，弃上清，加入1 mL staining buffer重悬细胞，350×g离心5 min，弃上清，加入100 μL staining buffer，按说明书加入流式抗体(CD11b，CD45，CD29，CD90.2抗体)，室温避光放置30 min，加入1 mL staining buffer重悬细胞，350×g离心5 min，弃上清，加300 μL staining buffer，上流式细胞仪检测。
1.4.3 细胞凋亡检测 收集第3代细胞(1×106)，用预冷PBS离心洗涤2次，用双蒸水稀释5 × Binding Buffer 为1 ×工作液，取500 μL 1 × Binding Buffer重悬细胞，每管加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5 min，上流式细胞仪检测。
1.4.4 细胞周期检测 收集第3代细胞(1×106)，消化后进行离心，弃上清，加入预冷的250 μL PBS，吹打混匀，缓缓滴入750 μL预冷的无水乙醇，混匀放于-20 ℃过夜。取出过夜固定的细胞，350×g离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS混匀再次350×g离心5 min，重复2次，尽量洗净残留的乙醇，弃净上清，加入500 μL PI/RNase染色溶液，室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。
1.4.5 细胞增殖能力检测 第3代细胞以3 000个/孔接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，每组设置5个副孔，并设置空白对照，培养24，48，72，96，120 h向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响吸光度值的读数)，在细胞培养箱内继续孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

1.4.6 定量PCR检测衰老相关基因的表达 参照RNA提取试剂盒说明书，收集第3代细胞提取总RNA，参照SureScript™ First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA，参照BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR Mix 2.0试剂盒说明书进行定量PCR扩增反应，采用20 μL反应体系，检测衰老相关基因P21和P27的表达，实验重复3次。引物序列见表1。

1.4.7 Western blot检测衰老相关蛋白的表达 收集第3代细胞，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)于冰上裂解，4 ℃、12 500 r/min离心15 min，收集上清即为总蛋白溶液。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白溶液按照4∶1的比例加入5*还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴变性7 min，放入-80 ℃冰箱保存备用。上样进行SDS-PAGE电泳，电泳后将蛋白质转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭30 min，加入一抗(兔抗P21抗体和兔抗P27抗体，稀释比例1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，1×TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP-羊抗兔二抗(稀释比例1∶5 000)，室温摇床孵育30 min，1×TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL化学发光液，放在凝胶成像中自动进行曝光。实验重复3次。
1.5 主要观察指标 老年和年轻小鼠ADSCs的细胞形态、生长状态、细胞表型、细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖情况；老年和年轻小鼠ADSCs衰老相关P21、P27基因和蛋白的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 11.0进行统计分析，两组间比较用非配对t检验，多组间比较用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过昆明医科大学生物统计学专家审核。

讨论

干细胞除了在组织微环境作用下多向分化为组织细胞，替代衰老死亡的细胞外，还具有强大的分泌功能，分泌一些生长因子、细胞因子，提升机体抗自由基能力，促进血管生成及细胞增殖分化、抑制炎症反应及趋化性、调节细胞黏附及迁移，刺激组织细胞的再生，加速伤口愈合和组织重塑，达到对抗衰老的目的[1，8，14，18-19]。
ADSCs分泌的细胞因子，如血管内皮生长因子、表皮生长因子、纤维生长因子、抗纤维化的细胞因子等，主要通过促进血管再生、免疫调节、中和活性氧等机制发挥作用，还可分化为各种皮肤细胞等，是目前抗衰老最具潜力、最实用的新手段。ADSCs还能够分泌白细胞介素6、白细胞介素12、白细胞介素14、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激因子等造血功能必需的细胞因子[18，20-22]，以及胶质源性神经营养因子、神经生长因子等神经营养因子[11，23-24]，从多个角度发挥抗衰老作用。
ADSCs对面部年轻化是有效和安全的，但采集ADSCs需要一定的技术和足够的设备。ADSCs通过许多机制来改善皮肤质量，这使得它们优于其他已知的抗衰老剂[25-28]。研究发现，ADSCs注射到真皮中，可以改善皮肤密度和整体皮肤外观，增加皮肤水合作用和毛细血管数量，在面部再生方向具有良好的作用[13， 29-31]。
自体ADSCs凭借其自身优势，科学家们已对它开展了大量的临床研究及批准上市项目[15-17， 32-34]。该研究结果显示，年轻小鼠ADSCs活性更好，增殖更明显，细胞形态更好，衰老相关P21、P27基因和蛋白表达低于老年小鼠ADSCs，说明随着年龄增长，ADSCs会出现逐渐衰老的现象，用于抗衰老功效的ADSCs最好取自年轻的供者。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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