明胶三维微球装载人脐带间充质干细胞修复慢性肌腱病

doi:10.12307/2025.019

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (7): 1356-1362.doi: 10.12307/2025.019

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明胶三维微球装载人脐带间充质干细胞修复慢性肌腱病

李帝均1，酒精卫1，刘海峰1，闫磊1，李松岩2，王斌1，2

1山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030000；2浙江大学医学院附属第一医院骨科，浙江省杭州市 310006

收稿日期:2023-11-16 接受日期:2024-02-06 出版日期:2025-03-08 发布日期:2024-06-27
通讯作者: 王斌，博士，副主任医师，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030000；浙江大学医学院附属第一医院骨科，浙江省杭州市 310006
作者简介:李帝均，男，1994年生，湖北省宣恩县人，山西医科大学在读硕士，主要从事组织工程、再生医学对肌腱损伤修复的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81802204)，项目负责人：王斌；浙江省自然科学基金(LTGY23H060007)，项目负责人：王斌

Three-dimensional gelatin microspheres loaded human umbilical cord mesenchymal stem cells for chronic tendinopathy repair

Li Dijun1, Jiu Jingwei1, Liu Haifeng1, Yan Lei1, Li Songyan2, Wang Bin1, 2

1Department of Orthopedics, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; 2Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310006, Zhejiang Province, China

Received:2023-11-16 Accepted:2024-02-06 Online:2025-03-08 Published:2024-06-27
Contact: Wang Bin, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310006, Zhejiang Province, China
About author:Li Dijun, Master candidate, Department of Orthopedics, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81802204 (to WB); Natural Science Foundation of Zhejiang Province, No. LTGY23H060007 (to WB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

明胶微载体：由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率> 90%，粒径大小可控于50-500 μm区间，均一度≤100 μm，可用于贴壁细胞的培养并实现细胞、病毒、细胞产物的收获，具有良好可降解性与生物相容性。
人脐带间充质干细胞：从胎儿脐带组织中分离培养获得的一种间充质干细胞，具有良好的增殖分化与免疫调节能力。
组织工程化干细胞：利用组织工程技术制备明胶三维微载体，将人脐带间充质干细胞接种于明胶微载体进行细胞培养。明胶微载体三维细胞培养可以增加细胞间的信息交流以及细胞间连接，同时可改变干细胞的分化状态，实现三维仿生培养。

背景：肌腱组织因缺少血管而修复困难，如何促进肌腱的恢复和提高肌腱损伤后干细胞治疗的效果，一直是临床及科研的研究热点和重点。
目的：将人脐带间充质干细胞与明胶微载体支架结合构建组织工程化干细胞，通过体外实验与大鼠体内实验观察明胶微载体培养的人脐带间充质干细胞对肌腱病的治疗效果及作用机制。
方法：①体外细胞实验：将人脐带间充质干细胞接种于三维明胶微载体后观察细胞活性以及存活情况，以常规培养的人脐带间充质干细胞作为对照；②动物体内实验：将成年SD大鼠随机分为正常组、肌腱病组、2D组(肌腱病+常规培养人脐带间充质干细胞)、3D组(肌腱病+明胶微载体三维培养的人脐带间充质干细胞)，每组6只，治疗4周后进行动物行为学检测以及跟腱病理组织形态观察。
结果与结论：①体外细胞实验：接种于明胶微载体的人脐带间充质干细胞存活率高，且随着时间延长细胞增殖速率增加；与对照组相比，三维明胶微载体培养的细胞活性更好；②动物体内实验：治疗4周后，与肌腱病组比较，3D组大鼠下肢功能恢复良好及组织病理学评分显著改善，而2D组也可一定程度改善肌腱病损伤，但效果不及3D组；③结果表明，三维明胶微载体培养的人脐带间充质干细胞可以促进肌腱损伤组织修复再生，且修复效果优于常规培养人脐带间充质干细胞。

https://orcid.org/0009-0002-9484-9592 (李帝均)；https://orcid.org/0000-0002-5474-1002 (王斌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 肌腱病, 肌腱损伤, 人脐带间充质干细胞, 组织工程化干细胞, 微载体, 三维培养

Abstract: BACKGROUND: The absence of blood vessels in tendon tissue makes tendon repair challenging. Therefore, improving tendon healing and raising the efficacy of stem cell and other therapeutic cell transplantation after tendon damage have become hotspots for research in both clinical and scientific contexts.
OBJECTIVE: The stem cells and gelatin microcarrier scaffold were joined to form tissue engineered stem cells. Human umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in gelatin microcarriers were used to investigate the therapeutic impact and mode of action on tendinopathy healing in rats in vitro and In vivo.
METHODS: (1) In vitro cell experiments: After seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells with three-dimensional gelatin microcarriers, the cell vitality and survival were assessed. Human umbilical cord mesenchymal stem cells conventionally cultured were cultured as controls. (2) In vivo experiment: Adult SD rats were randomly assigned to normal group, tendinopathy group, 2D group (tendinopathy + conventional culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells), and 3D group (tendinopathy + gelatin microcarrier three-dimensional culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells), with 6 rats in each group. Four weeks after therapy, animal behavior tests and histopathologic morphology of the Achilles tendon was examined.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro cell experiments: the seeded human umbilical cord mesenchymal stem cells on gelatin microcarriers showed high viability and as time went on, the stem cell proliferation level grew. Compared with the control group, 3D stem cell culture preserved cell viability. (2) In vivo experiment: Following a 4-week treatment, the 3D stem cell culture group showed a significant improvement in both functional recovery of the lower limbs and histopathological scores when compared to the tendinopathy group. The 2D stem cell culture group also showed improvement in tendinopathy injury, but its effect is not as much as the 3D stem cell culture group. (3) The outcomes demonstrate that human umbilical cord mesenchymal stem cells cultured with three-dimensional gelatin microcarrier can promote the repair and regeneration of tendon injury tissue, and the repair effect is better than that of conventional human umbilical cord mesenchymal stem cells.

Key words: tendinopathy, tendon injury, human umbilical cord mesenchymal stem cell, tissue-engineered stem cell, microcarrier, three-dimensional culture

中图分类号:

李帝均, 酒精卫, 刘海峰, 闫磊, 李松岩, 王斌. 明胶三维微球装载人脐带间充质干细胞修复慢性肌腱病[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1356-1362.

Li Dijun, Jiu Jingwei, Liu Haifeng, Yan Lei, Li Songyan, Wang Bin. Three-dimensional gelatin microspheres loaded human umbilical cord mesenchymal stem cells for chronic tendinopathy repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(7): 1356-1362.

图/表（结果） 1

2.1 明胶微载体的形态特征实验所使用明胶微载体支架由多达数万个微载体压缩而制成，最终呈多层多个状态(图2A)。将200 μL 人脐带间充质干细胞悬液接种于明胶微载体上，整片微载体吸水膨胀而不散开(图2B)，便于细胞贴壁；接种2 h后随着细胞的贴壁及营养物质消耗，微载体颜色变黄但仍呈圆形膨胀状态(图2C)，添加培养基后微载体能均匀分布于培养皿中(图2D)。此外，使用扫描电镜观察明胶微载体的显微结构呈现疏松多孔蜂窝状，具有较高的孔隙率(大于90%)，这均为细胞的贴壁吸附提供了条件(图2E，F)。
2.2 明胶微载体培养对人脐带间充质干细胞活性的影响人脐带间充质干细胞接种于明胶微载体1，3，5 d后，对明胶微载体三维培养的人脐带间充质干细胞进行死活染色以观察接种后细胞存活情况和增殖状态(图3A)，可见大多数细胞存活(85%以上)，仅少量细胞死亡；随着接种时间的推移活细胞数量明显增加，显示出良好的增殖状态(图3B，C)。
同时探索了明胶微载体三维培养对人脐带间充质干细胞活力的影响，CCK-8检测发现随着时间的增加，细胞活性不受影响(P > 0.05)(图3D)，由此可见：三维培养环境可维持人脐带间充质干细胞的活力。该结果进一步说明明胶微载体支架具有良好的生物相容性。
2.3 实验动物数量分析实验选用24只SD大鼠全部存活良好，并纳入最终结果分析。
2.4 动物行为学治疗4周后使用CatWalk进行大鼠步态分析，大鼠自由通过固定跑道时能清晰记录四肢印记(图4A，B)。正常组大鼠节律整齐地通过固定跑道；肌腱病组大鼠在通过跑道时节律紊乱；与肌腱病组及2D组相比，3D组大鼠下肢步态节律更齐(图4C)，恢复效果更好。进一步分析发现肌腱病形成后局部痛阈减小，大鼠触地面积以及站立的时间减少(图4D)，3D组治疗后大鼠功能显著恢复，同时2D组也显示出一定治疗效果(P < 0.05)，但疗效不及3D组。
2.5 组织病理学分析苏木精-伊红染色显示，正常组细胞和细胞外基质良好；肌腱病组结构不完整，纤维排列结构混乱，伴有大量炎性细胞浸润及新生血管生成；3D组纤维排列对齐，无明显炎症细胞浸润(图5A)。组织学评分(纤维结构、纤维排列、核圆程度、炎症细胞、血管数量、细胞数量)也显示，与肌腱病组相比，3D干细胞治疗后组织学评分更低恢复更佳(图5B)。同时行Masson染色进一步观察各组纤维分布排列情况，结果显示正常组为排列整齐的肌纤维与胶原纤维，而肌腱病组胶原纤维明显水肿(蓝色区域)，3D组的胶原纤维水肿程度被逆转(图5A)；同时，胶原容积分数显著低于肌腱病组和2D组(P < 0.001)(图5C) 。
2.6 组织炎症因子分泌结果通过免疫荧光染色法观察组织中炎症因子分泌情况，结果显示：正常组具有少量炎症因子(白细胞介素6及肿瘤坏死因子α)表达，肌腱病组炎症因子明显增多，而3D组白细胞介素6及肿瘤坏死因子α的表达明显降低(图6，7)。

参考文献

[1] MILLAR NL, SILBERNAGEL KG, THORBORG K, et al. Tendinopathy. Nat Rev Dis Primers. 2021;7(1):1.
[2] LUI PP, CHAN LS, FU SC, et al. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. Am J Sports Med. 2010; 38(4):757-764.
[3] DOCHEVA D, MÜLLER SA, MAJEWSKI M, et al. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 2015;84:222-239.
[4] CHILDRESS MA, BEUTLER A. Management of chronic tendon injuries. Am Fam Physician. 2013;87(7):486-490.
[5] VOLETI PB, BUCKLEY MR, SOSLOWSKY LJ. Tendon healing: repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 2012;14:47-71.
[6] AICALE R, BISACCIA RD, OLIVIERO A, et al. Current pharmacological approaches to the treatment of tendinopathy. Expert Opin Pharmacother. 2020;21(12):1467-1477.
[7] MAZZOCCA AD, CHOWANIEC D, MCCARTHY MB, et al. In vitro changes in human tenocyte cultures obtained from proximal biceps tendon: multiple passages result in changes in routine cell markers. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2012;20(9):1666-1672.
[8] KOKUBU S, INAKI R, HOSHI K, et al. Adipose-derived stem cells improve tendon repair and prevent ectopic ossification in tendinopathy by inhibiting inflammation and inducing neovascularization in the early stage of tendon healing. Regen Ther. 2020;14:103-110.
[9] TANG Y, CHEN C, LIU F, et al. Structure and ingredient-based biomimetic scaffolds combining with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell sheets for bone-tendon healing. Biomaterials. 2020;241:119837.
[10] TSUCHIYA A, TAKEUCHI S, WATANABE T, et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as “conducting cells” for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflamm Regen. 2019; 39:18.
[11] TROYER DL, WEISS ML. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 2008;26(3):591-599.
[12] ROURA S, FARRÉ J, SOLER-BOTIJA C, et al. Effect of aging on the pluripotential capacity of human CD105+ mesenchymal stem cells. Eur J Heart Fail. 2006;8(6):555-563.
[13] WANG B, LIU W, LI JJ, et al. A low dose cell therapy system for treating osteoarthritis: In vivo study and in vitro mechanistic investigations. Bioact Mater. 2021;7:478-490.
[14] LIU H, YAN X, JIU J, et al. Self-assembly of gelatin microcarrier-based MSC microtissues for spinal cord injury repair. Chem Eng J. 2023;451: 138806.
[15] YANG Z, WANG B, LIU W, et al. In situ self-assembled organoid for osteochondral tissue regeneration with dual functional units. Bioact Mater. 2023;27:200-215.
[16] ZHOU T, YUAN Z, WENG J, et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. J Hematol Oncol. 2021; 14(1):24.
[17] DORON G, WOOD LB, GULDBERG RE, et al. Poly(ethylene glycol)-Based Hydrogel Microcarriers Alter Secretory Activity of Genetically Modified Mesenchymal Stromal Cells. ACS Biomater Sci Eng. 2023;9(11): 6282-6292.
[18] CHEN AK, REUVENY S, OH SK. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 2013;31(7): 1032-1046.
[19] LOUBIÈRE C, SION C, DE ISLA N, et al. Impact of the type of microcarrier and agitation modes on the expansion performances of mesenchymal stem cells derived from umbilical cord. Biotechnol Prog. 2019;35(6):e2887.
[20] YAN X, ZHANG K, YANG Y, et al. Dispersible and Dissolvable Porous Microcarrier Tablets Enable Efficient Large-Scale Human Mesenchymal Stem Cell Expansion. Tissue Eng Part C Methods. 2020;26(5):263-275.
[21] 李帝均,王桂杉,刘海峰,等.肌腱病动物模型的研究进展[J].中国实验动物学报,2022,30(2):260-266.
[22] ZHANG H, CHEN Y, FAN C, et al. Cell-subpopulation alteration and FGF7 activation regulate the function of tendon stem/progenitor cells in 3D microenvironment revealed by single-cell analysis. Biomaterials. 2022;280:121238.
[23] MILLAR NL, MURRELL GA, MCINNES IB. Inflammatory mechanisms in tendinopathy - towards translation. Nat Rev Rheumatol. 2017;13(2): 110-122.
[24] OREFF GL, FENU M, VOGL C, et al. Species variations in tenocytes’ response to inflammation require careful selection of animal models for tendon research. Sci Rep. 2021;11(1):12451.
[25] JIAO X, ZHANG Y, LI W, et al. HIF-1α inhibition attenuates severity of Achilles tendinopathy by blocking NF-κB and MAPK pathways. Int Immunopharmacol. 2022;106:108543.
[26] ACKERMAN JE, BEST KT, MUSCAT SN, et al. Metabolic Regulation of Tendon Inflammation and Healing Following Injury. Curr Rheumatol Rep. 2021;23(3):15.
[27] LEE SY, KWON B, LEE K, et al. Therapeutic Mechanisms of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Tendon Injury Model. Am J Sports Med. 2017;45(6):1429-1439.
[28] RODAS G, SOLER-RICH R, RIUS-TARRUELLA J, et al. Effect of Autologous Expanded Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells or Leukocyte-Poor Platelet-Rich Plasma in Chronic Patellar Tendinopathy (With Gap >3 mm): Preliminary Outcomes After 6 Months of a Double-Blind, Randomized, Prospective Study. Am J Sports Med. 2021;49(6): 1492-1504.
[29] XUE Y, KIM HJ, LEE J, et al. Co-Electrospun Silk Fibroin and Gelatin Methacryloyl Sheet Seeded with Mesenchymal Stem Cells for Tendon Regeneration. Small. 2022;18(21):e2107714.
[30] CHEN G, ZHANG W, ZHANG K, et al. Hypoxia-Induced Mesenchymal Stem Cells Exhibit Stronger Tenogenic Differentiation Capacities and Promote Patellar Tendon Repair in Rabbits. Stem Cells Int. 2020; 2020:8822609.

引言

肌腱病是一种以疼痛和功能障碍为主要特征的过度使用损伤性慢性疾病，主要是肌腱基质的进行性紊乱和改变，包括肌腱的微观结构、组成和细胞数量异常等[1-2]。疼痛是肌腱病最常见的症状，临床肌腱病治疗的主要目标是减轻患者疼痛。局部或全身用药及外科手术是修复损伤肌腱常用的手段[3-4]。由于肌腱组织缺少血管，且手术本身所造成的瘢痕形成也会导致肌腱组织功能减轻，易发生再撕裂[3-5]，重建手术难以达到预期的修复效果。目前，对于退行性肌腱疾病还缺少有效的治疗方案[6]，需要新的治疗干预措施。
最近，肌腱组织工程的发展给肌腱病治疗带来新的前景。肌腱细胞是肌腱组织最常见细胞来源，但作为终末分化细胞在连续传代后会降低细胞代谢活性及成腱谱系相关标记物的表达[7]。已有研究证明骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞以及肌腱来源干细胞与支架结合可促进肌腱组织结构再生[8-9]，然而这些干细胞广泛应用仍受到限制，包括细胞获取时技术的侵入性、收集效率低、随着供者年龄的增长干细胞多能干性降低等[10]。除了上述干细胞外，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)作为候选干细胞展现出巨大潜力，它具有更快的增殖能力、传代后仍保持更高的细胞活性[11]、受到老化的影响较小等特征[12]。此外，人脐带间充质干细胞具有较低的免疫排斥反应。近年来，有研究表明人脐带间充质干细胞可改善退行性骨关节炎[13]、脊髓损伤[14]、骨软骨再生等疾病的预后转归[15]。由此推测人脐带间充质干细胞具有促进肌肉骨骼损伤修复的能力，在组织再生工程领域可与支架产生协同作用。
组织工程化干细胞将组织工程技术与干细胞培养相结合，利用组织工程技术改变干细胞性能以满足研究需求。干细胞的培养表现出多能性，其中培养基质、培养基环境等都可改变其分化状态以及分泌功能[16-17]。微载体支架的出现加速了细胞二维培养向三维培养的转变，在促进细胞“工业化”培养的同时还可增加细胞间的沟通连接，进一步影响干细胞的定向分化与旁分泌功能[18-20]，为干细胞在组织工程领域的应用提供理论基础。
该研究开发了一个可注射的三维明胶微载体培养系统，用于人脐带间充质干细胞的功能维持，并对其促进肌腱修复的有效性进行了体外和体内验证(图1)。研究通过体外细胞培养表明明胶微载体可较好地维持人脐带间充质干细胞的活性，同时通过组织学和跟腱运动功能评估证明经过明胶微载体培养的功能化干细胞可促进损伤肌腱的修复。

材料方法

1.1 设计细胞实验+随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年10月在山西医科大学第二医院骨科基础实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康成年雄性SD大鼠24只，体质量200-250 g，购于山西医科大学实验动物中心。动物实验获得山西医科大学第二医院动物福利伦理委员会批准(伦理备案号：DW2023008)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，所有操作最大限度地减少其痛苦和死亡。
1.3.2 细胞实验中所使用的人脐带间充质干细胞购自北京华龛生物有限公司(批号：HK-QD-P2)。
1.3.3 主要试剂明胶购自美国Sigma公司，聚甲基丙烯酸甲酯板购自美国Sunjin Electronics Co公司，戊二醛购自美国Sigma公司，硼氢化钠购自美国Sigma公司，聚乳酸购自美国Sigma公司，人间充质干细胞专用培养基购自北京华龛生物有限公司(批号：RMZ010-GY)，死活染色试剂盒购自中国贝博生物有限公司(批号：BB23101)，PBS购自中国美伦生物有限公司(批号：MA0015)，CCK-8试剂盒购自美国MCE生物公司(批号：# HY-K0301)，白细胞介素 6 抗体购自NOVUS生物公司(批号：NB600-1131SS)，肿瘤坏死因子 α 抗体购自NOVUS生物公司(批号：NBP1-19532SS)，苏木精及伊红染液购自中国雷根生物有限公司(批号：DH0006)，Masson 染液试剂盒购自中国索莱宝有限公司(批号：# G1340)。
1.3.4 主要仪器细胞培养箱购自美国Thermo公司(批号：BB150)，荧光倒置显微镜购自德国Leica公司(批号：DMi8)，细胞超净工作台购自上海力申科学仪器有限公司(批号：HFsafe-1200)，高速离心机购自德国Eppendorf公司(批号：5810R)，激光雕刻机购自澳大利亚Rayjet Laser System公司，石蜡切片机购自德国Leica公司(批号：ArcadiaH+C)。
1.4 实验方法
1.4.1 明胶微载体的制备由课题组成员与清华大学医学院生物医学工程系共同完成(后续由于实验需要量较大，购买于北京华龛生物公司)。
实验步骤简述如下：首先配制4%的明胶溶液形成预制的明胶微载体支架溶液，其次使用激光雕刻机对聚甲基丙烯酸甲酯板进行雕刻，结束后将聚甲基丙烯酸甲酯板放在等离子体清洗器内进行表面活性处理。将明胶支架聚合物溶液缓慢地添加在聚甲基丙烯酸甲酯板的圆柱体孔中，置于-20 ℃冷冻16 h成型，结束后用冷冻干燥机干燥3 h，得到多孔明胶微载体支架。使用0.1 mol/L NaBH4溶液清洗明胶微载体支架中残留的戊二醛溶液，去离子水清洗后铺成单层预冷，冷冻干燥机干燥，即得到可使用的明胶微载体支架。扫描电子显微镜下观察明胶微载体的形貌。
1.4.2 人脐带间充质干细胞培养采用人间充质干细胞专用培养基培养细胞，待细胞生长至80%-90%按1∶3比例进行传代，选取第3-5代干细胞用于实验。
1.4.3 人脐带间充质干细胞与明胶微载体的体外结合取明胶微载体置入低吸附的6孔板中待用，取第3代人脐带间充质干细胞，消化、离心并重悬，将细胞浓度调整为2.5×109 L-1，将200 μL细胞悬液接种于明胶微载体上，在6孔板的孔隙中添加2.0-3.0 mL PBS以构建湿盒环境，随后置于细胞培养箱中培养，2 h后向每孔中添加干细胞专用培养基4 mL，隔天更换培养基，用于后续实验。
1.4.4 人脐带间充质干细胞与明胶微载体结合后进行死活染色用巴士管吸取适量上述人脐带间充质干细胞与明胶微载体结合悬液于96孔板中，PBS清洗3次，然后取细胞活死染色试剂，按说明书配成工作液，加入96孔板，细胞温箱孵育30 min，吸出染色液，PBS清洗细胞两三次，在荧光显微镜下观察细胞死活情况。
1.4.5 CCK-8检测将明胶微载体负载人脐带间充质干细胞悬液接种于96孔板中培养，每孔细胞量约4 000个，接种后第1，3，5天检测细胞活力。具体如下：提前配置CCK-8检测工作液，每孔加入的人间充质干细胞专用培养基与CCK-8检测液按9∶1比例配置待用。第1，3，5天分别去除96孔板中培养基，PBS清洗1遍，每孔加入提前配置的CCK-8检测工作液100 μL，细胞培养箱中孵育2 h后收集细胞上清液，使用酶标仪测量450 nm波长吸光度值。
1.4.6 动物模型建立及分组使用Ⅰ型胶原酶注射构建大鼠肌腱病模型[21]，建模前将24只大鼠分笼适应性饲养1周，自由进食，随机分成4组，每组6只。正常组：注射等量生理盐水；肌腱病组：使用Ⅰ型胶原酶注射建立肌腱病模型；2D组：使用Ⅰ型胶原酶注射建立肌腱病模型，并注射普通贴壁培养人脐带间充质干细胞；3D组：使用Ⅰ型胶原酶注射建立肌腱病模型，并注射明胶微载体三维培养人脐带间充质干细胞。
使用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉大鼠，定位SD大鼠右后肢跟腱，微量注射器注射Ⅰ型胶原酶50 μL (2 mg/mL，每3 d注射1次，共5次)，2周后肌腱病模型建立成功，然后使用微量注射器给予干细胞移植治疗(50 μL，1×1010 L-1，共注射1次)。
1.5 主要观察指标
1.5.1 行为学观察治疗4周，采用小动物步态分析仪(CatWalk)检测大鼠功能恢复情况。避光条件下大鼠适应周围环境，将大鼠放置于提前设定好步态参数的小动物步态分析仪跑道上，大鼠匀速通过固定检测区域跑道时，依据大鼠四肢产生的压力可检测其通过跑道过程中步态特征(步频，周期，节律，足底压力，触地面积，站立时间等)。每组测量数据重复3次，取平均值作为测量结果。
1.5.2 组织学观察治疗4周，动物安乐死后于肌腱-骨联合点与肌腱-肌肉连接点横断跟腱组织，40 g/L多聚甲醛固定24 h，组织脱水，石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红染色和Masson染色，中性树脂封固，光镜下观察结果。根据组织纤维结构、纤维排列、核圆度、炎症细胞、血管数量、细胞数量等进行组织学评分[22]；胶原容积分数使用Image J.1.53t量化所得。
1.5.3 组织学免疫荧光观察采用免疫荧光染色方法观察组织内炎症因子分泌情况。组织切片脱蜡、脱水，37 ℃胃蛋白酶抗原修复45 min，清洗3次后山羊血清封闭1 h，滴加兔抗大鼠肿瘤坏死因子α及白细胞介素6抗体(稀释比均为1∶100)，4 ℃孵育过夜；次日用PBS 冲洗3次，滴加相应二抗后避光室温孵育1 h；清洗后DAPI 复染细胞核20 min，冲洗切片后加入抗荧光淬灭剂，封固剂封固，荧光显微镜下观察，荧光强度使用Image J.1.53t量化所得。

1.6 统计学分析使用SPSS 21.0软件进行统计分析，Shapiro-Wilk 检验进行正态性分析，如果数据呈正态分布，采用t检验评价，多组间比较采用单因素方差分析，如果数据呈非正态分布，采用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。使用GraphPad Prism 9.0 软件进行图片处理。文章的统计学方法已由山西医科大学统计学专家审核。

讨论

该研究首次提出并构建了组织工程化干细胞，探索了组织工程化干细胞在肌腱病损伤修复中的有效性。研究结果显示，整合到明胶微载体的人脐带间充质干细胞在体外维持了较好的细胞活性及增殖能力；进一步使用Ⅰ型胶原酶注射构建慢性肌腱病模型来探索组织工程化干细胞的治疗价值，在治疗4周后，整合到明胶微载体的人脐带间充质干细胞可抑制炎症反应，促进功能恢复，显示出持续的组织修复再生能力。
慢性肌腱病肌腱愈合的过程分为3个不同的阶段：炎症期、增殖期和重塑期[3]。众所周知，疾病早期首先形成Ⅲ型胶原蛋白组成的瘢痕组织，然后由于持续性机械刺激组织开始重建，被Ⅰ型胶原蛋白所取代。在肌腱病发生过程中，早期分泌大量的炎症因子，进一步加速肌腱炎性病变进展。肌腱病中分泌相关的促炎性递质包括白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、高迁移率族蛋白B1、缺氧诱导因子1α等[23-26]，其中白细胞介素1β是介导肌腱病基质降解的关键细胞因子，肿瘤坏死因子α可促进蛋白聚糖的降解，促进肌腱病分解代谢及促炎性因子的表达。现有肌腱组织工程都关注如何优化这一愈合过程，其中抑制早期炎症阶段的过度激活是治疗的关键，旨在减少炎症持续时间以促进炎症消退的同时增强成纤维细胞的增殖，以及协调细胞外基质的重构等。
人脐带间充质干细胞在增殖、分化及免疫调节特性等方面表现出巨大潜力，在肌腱组织工程再生研究领域得到了广泛的关注[10，14]，但其潜在的治疗机制尚未完全阐明。在以往的研究中发现肌腱损伤后，间充质干细胞可以通过分泌自身的蛋白质或遗传物质来促进肌腱愈合，其有可能作为人类肌腱病的治疗选择[27-28]。这些先前的研究描述了间充质干细胞注射治疗肌腱病的有效性，但单纯干细胞注射可引起部分细胞的机械性死亡，这要求在单次注射时保证一定细胞数量，而且单纯干细胞悬液注射后在宿主体内定植效率差。在传统的肌腱组织工程治疗策略中，单一的干细胞治疗存在药物流失、反复给药、局部感染等相关问题。
组织工程支架修复肌腱损伤是现阶段的研究热点，作为细胞递送的载体有较好的应用前景。研究已证实间充质干细胞应用于肌腱损伤治疗有利于肌腱组织再生，将间充质干细胞接种于静电纺丝丝素蛋白和明胶甲基丙烯酰片联合应用能促进肌腱组织修复[29]。但鉴于间充质干细胞疗法进行肌腱修复的临床效果欠佳，因此需要更好的策略来诱导间充质干细胞进行腱源分化。CHEN等[30]通过构建干细胞体外缺氧培养环境诱导其腱源分化，兔髌腱损伤模型也进一步验证缺氧环境可诱导骨髓间充质干细胞成肌腱分化，改善损伤肌腱的组织学及生物力学，提高骨髓间充质干细胞治疗肌腱损伤的有效性。
该研究以明胶为原材料，通过物理交联及激光打印可以制备具有丰富多孔隙三维明胶微球支架。微球支架内部呈现多孔网状结构，表面粗糙，这种形态结构有利于细胞的黏附以及细胞间的相互作用，促进人脐带间充质干细胞在其表面正常黏附、铺展。人脐带间充质干细胞接种于明胶微载体后无明显细胞死亡，并且随着培养时间的延长细胞数量逐渐增加。明胶微载体对细胞活性测定证实了明胶多孔微载体材料无明显细胞毒性，同时可以维持良好的细胞活性，可作为安全的组织工程材料。
选择大鼠跟腱慢性损伤模型进一步评估了明胶三维微载体支架联合人脐带间充质干细胞的治疗效果，结果显示注射三维培养干细胞 4 周后，大鼠运动行为学评分、组织病理学评分均较肌腱病组有显著改善，而单纯注射人脐带间充质干细胞虽也可一定程度缓解肌腱病损伤，但不及注射三维培养干细胞组。三维明胶微载体的疏松多孔结构可以调节细胞微环境，改善细胞之间的旁分泌信号，从而更理想地模拟体内的细胞环境，为细胞的生长、黏附等提供良好的局部微环境，因而可在一定程度上改善肌腱损伤。
但是该研究存在一定的局限性：首先仅在啮齿动物体内进行实验，未开展大型动物实验研究；其次仅观察到组织工程化干细胞的修复效果，但是未对其产生的机制进行更深层次探索；最后仅观察治疗4周时的效果，未对更长期干预时间节点(如：8，12周)进行评估。
综上所述，该研究制备的明胶微载体三维支架材料具有良好的生物相容性，同时负载人脐带间充质干细胞可保持细胞良好活性。进一步基于明胶微载体负载人脐带间充质干细胞治疗大鼠慢性跟腱病实验发现，人脐带间充质干细胞可加速大鼠损伤肌腱的修复，改善大鼠运动功能，这与其促进胶原纤维生成及抑制局部炎症、调控损伤组织局部微环境的作用有关。研究提示组织工程化干细胞有望成为肌腱病的一种新治疗策略。微载体作为人脐带间充质干细胞培养载体可以实现快速细胞扩增，同时作为体内递送载体提升了人脐带间充质干细胞治疗效果，为其在肌腱病等疾病治疗领域的应用拓展提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

明胶三维微球装载人脐带间充质干细胞修复慢性肌腱病

Three-dimensional gelatin microspheres loaded human umbilical cord mesenchymal stem cells for chronic tendinopathy repair

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[1]	金凯, 唐婷, 李美乐, 谢裕安. 人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1350-1355.
[2]	郑伊桐, 汪永新, 刘文, 阿木吉特, 秦虎. 神经内镜下人脐带间充质干细胞外泌体鞘内移植修复脊髓损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7743-7751.
[3]	黄海纳, 余艳荣, 毕戬, 黄淼, 彭维杰. 三维培养间充质干细胞成肝分化的表观遗传学特征[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7848-7855.
[4]	刘璐, 钟畅, 余欣, 任晨媛, 巩杨杨, 周平, 王迎斌. 体外合成微环境促进人多能干细胞来源心肌细胞成熟的学术进展及临床应用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7856-7862.
[5]	易小丁, 张迪, 郭鸿, 卿亮, 赵田芋. 脱细胞肌腱支架：一种用于肌腱损伤修复的生物医学材料[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7385-7392.
[6]	周莉娜, 黎芸, 刘夕霞, . 不同浓度高渗葡萄糖修复大鼠肌腱损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6885-6892.
[7]	何长良, 王炎, 罗玲, 刘坚. 人脐带间充质干细胞抑制脓毒症小鼠肺组织细胞的焦亡[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6642-6648.
[8]	任疏桐, 郝苗, 刘越, 侯平, 全娟花. 人脐带间充质干细胞共培养联合人参皂苷Rg1对心力衰竭细胞模型的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6625-6633.
[9]	卜宪敏, 梁迪, 张斌, 徐英杰, 丁豪, 吴彬, 田荣华 . 人脐带间充质干细胞来源外泌体治疗SD大鼠骨质疏松性股骨骨折[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6634-6641.
[10]	魏璐晓, 黄冰雪, 杜静, 石拴霞, 王纪田, 王玲. 人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗化疗致早发性卵巢功能不全的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5281-5288.
[11]	陶晨玥, 陈帅, 王丽萍, 孟德芳, 周东杰, 周罗晶. 人脐带间充质干细胞治疗多囊卵巢综合征模型小鼠卵巢组织中[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5289-5295.
[12]	冯乙芮, 高天芸, 王亚萍, 黄亚红, 王斌. 白细胞介素10工程化修饰人脐带间充质干细胞优效治疗炎症性肠病[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4878-4887.
[13]	徐杰, 酒精卫, 刘海峰, 赵斌. 生物3D打印仿生支架促进肩袖损伤后的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(22): 4761-4770.
[14]	马玥, 檀诗雨, 楚飞洋, 陈琢琦, 刘思宇, 刘文帅, 刘霞. 基质细胞衍生因子1修饰左旋聚乳酸多孔微球促进软骨细胞增殖和组织形成[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(22): 4653-4662.
[15]	杨朔, 张振, 白硕, 盛黎, 申亮, 孙青峰, 高蓓瑶, 葛瑞东, 江山. 线粒体功能障碍与肌腱病：靶向线粒体治疗的可能性[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(20): 4276-4285.