2.1   左旋聚乳酸多孔微球的形貌   扫描电镜下可见接枝与未接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球内部及表面均存在大量互相连通的孔状结构，并且接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸表面有颗粒样物质存在(箭头所示)，见图1A。未接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球的孔隙率为90.63%，接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球的孔隙率为89.83%。
2.2   基质细胞衍生因子1接枝表征   接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球在不同层面扫描时均激发绿色荧光，见图1B。最终将荧光图像层层扫描后拟合输出，可见基质细胞衍生因子1均匀分布于微球，几乎遍布多孔微球表面，见图1C。利用基质细胞衍生因子1 ELISA试剂盒测量接枝完成后上清液中未成功接枝的因子量，通过间接法得到基质细胞衍生因子1 接枝率约为93.75%，与图1C中绿色荧光拟合图像相符，均验证了良好的接枝效果。



2.3   基质细胞衍生因子1对软骨细胞增殖、迁移、软骨表型维持的影响   CCK-8检测结果显示，随着培养时间的延长，各组细胞数量逐渐增加，培养第8天，500 ng/mL 基质细胞衍生因子1组细胞增殖吸光度值高于0，1 000 ng/mL 基质细胞衍生因子1组(P < 0.000 1)，见图2A，说明添加500 ng/mL基质细胞衍生因子1对软骨细胞增殖具有促进作用。
Transwell细胞小室实验结果显示，500 ng/mL 基质细胞衍生因子1组细胞迁移能力强于0，1 000 ng/mL 基质细胞衍生因子1组(P < 0.01)，见图2B，C，说明500 ng/mL基质细胞衍生因子1可促进软骨细胞的迁移。



qRT-PCR检测结果显示，与0，1 000 ng/mL 基质细胞衍生因子1组比较，500 ng/mL基质细胞衍生因子1组软骨细胞内Ⅱ型胶原、弹性蛋白、增殖细胞核抗原、Bcl-2 mRNA表达均升高(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，P < 0.000 1)，见图3，说明500 ng/mL基质细胞衍生因子1可进软骨细胞的胶原蛋白合成能力，促进软骨细胞增殖并抑制其凋亡。



2.4   左旋聚乳酸多孔微球对软骨细胞增殖与黏附的影响   CCK-8检测结果显示，从培养第3天起，接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球组软骨细胞吸光度值显著高于未接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.000 1)，见图4，提示基质细胞衍生因子1有助于提高左旋聚乳酸多孔微球的细胞相容性。



两组微球活死染色结果如图5A所示，可见细胞分布均匀，以绿色活细胞为主。活死染色定量分析结果显示，接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球组细胞存活率高于未接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球组(P < 0.01)，如图5B所示，说明在左旋聚乳酸多孔微球表面接枝基质细胞衍生因子1有利于软骨细胞的黏附和存活。



两组微球Dil免疫荧光染色如图6A所示，可见接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球组细胞量更多、增殖速度更快；定量分析结果显示，接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球组细胞面积占比高于未接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球组(P < 0.01)，如图6B所示，说明基质细胞衍生因子1有利于软骨细胞增殖。



2.5   左旋聚乳酸多孔微球植入裸鼠皮下后体内成软骨检测  
2.5.1   实验动物数量分析   12只裸鼠全部进入结果分析。
2.5.2   各组复合物大体观察   对照组、多孔微球组、多孔微球修饰组的组织块大小及厚度无明显差别，形态维持良好，3组组织块硬度手感无明显差异，均可生成乳白色软骨样组织，见图7A。  
2.5.3   各组复合物组织学染色结果   苏木精-伊红染色结果显示，对照组软骨细胞散在分布于甲基丙烯酰胺基明胶中，相比之下，多孔微球组及多孔微球修饰组软骨细胞更倾向于聚集分布，多孔微球修饰组中有更多的细胞黏附、生长于多孔微球中，见图7B。Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示，多孔微球修饰组软骨细胞Ⅱ型胶原分泌多于对照组(P < 0.01)、多孔微球组(P < 0.05)，见图7C，D。阿利新蓝染色结果显示，多孔微球修饰组软骨细胞的细胞外基质糖胺聚糖沉积多于对照组、多孔微球组(P均< 0.001)，见图7E，F。



2.5.4   qRT-PCR检测结果   多孔微球修饰组软骨相关基因Ⅱ型胶原、弹性蛋白的mRNA 表达明显高于对照组、多孔微球组(P < 0.000 1)，说明在接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球可更好地维持软骨细胞表型；多孔微球修饰组增殖相关基因增殖细胞核抗原和凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA表达明显高于对照组和多孔微球组(P < 0.001，P < 0.000 1)，见图8，说明接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球能够促进软骨细胞的增殖并抑制其凋亡。这些结果与体外实验中基质细胞衍生因子1对软骨细胞的作用是一致的。

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小耳畸形的治疗方法主要包括自体软骨移植及假体重建，但仍存在供体不足、供体部位受损、免疫排斥反应等问题[1-2]。耳软骨组织工程为小耳畸形的耳郭重建提供了新选择[3]。近年来，3D生物打印等技术的出现为组织工程的发展注入了新的活力。
生物材料支架是组织工程软骨成功构建的关键因素之一，需要具备良好的生物相容性、可降解性和力学支撑性能。与关节软骨相比，耳软骨组织构建不但对软骨形成质量有要求，对所构建软骨的形态维持能力也有要求。海藻酸盐、透明质酸、胶原衍生物等天然材料虽具备细胞毒性低、炎症反应弱等优势[4]，但机械强度不足、降解速率快等问题限制其在耳软骨构建中的单独应用[5-6]。聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯等合成高分子材料因具备较强的可塑性和机械性能而常常被用于耳软骨组织构建[7]。
其中，左旋聚乳酸具有较好的结晶度、化学稳定性、可塑性、抗酶降解性和力学性能[8]，但细胞相容性较差[9]，需在其表面进行蛋白修饰以促进细胞的黏附、增殖和基质分泌[10]。
近年来，多孔微球因具有高度多孔结构、比表面积大、密度低等特点成为材料研究的热点之一。将合成材料制备成多孔微球形式，在利用其机械强度的同时还可为细胞提供三维培养条件，模拟体内生长微环境，更有利于维持软骨细胞表型，而且避免了在扩增过程中因反复胰蛋白酶消化造成的细胞损伤[11-12]。通过多孔微球高度开放的孔隙结构和大比表面积还可促进细胞增殖、黏附和营养物质运输，提高细胞密度和生物活性[13]。课题组前期实验已证实，左旋聚乳酸多孔微球可应用于耳软骨组织构建，通过调整微球含量可使支架机械强度近似于天然软骨[14]。
为了进一步提高左旋聚乳酸多孔微球的细胞相容性，从而提高软骨构建质量，此次实验在左旋聚乳酸多孔微球上修饰基质细胞衍生因子1，基质细胞衍生因子1为强趋化效力的稳态细胞因子，是一种良好的材料修饰因子，在多种组织器官发育、细胞分布调节和肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。LIU等[15]制备了一种负载基质细胞衍生因子1的智能牙龈蛋白酶反应性水凝胶，体外实验结果表明该水凝胶具有较好的生物相容性，还可促进牙周韧带干细胞的增殖、迁移和成骨分化。WANG等[16]制备了基质细胞衍生因子1预处理的人工聚丙交酯-乙交酯支架，发现基质细胞衍生因子1可将体内骨髓间充质干细胞募集到软骨缺损部位进行再生修复。研究表明，基质细胞衍生因子1与软骨细胞上趋化因子受体4结合可调节软骨细胞的增殖、存活、分化和成熟，因此基质细胞衍生因子1常作为外源性调节靶点来探索软骨发育的机制，在修复软骨缺陷组织环境中也具备招募内源性干细胞的强大能力[17]。
此次实验采用复乳法制备直径在250-350 μm范围内的左旋聚乳酸多孔微球，再将基质细胞衍生因子1接枝于多孔微球上，通过体外实验验证基质细胞衍生因子1对软骨细胞黏附、增殖、以及迁移的影响。此外，将甲基丙烯酰胺基明胶与软骨细胞和多孔微球混合注模，以验证其体内软骨组织形成情况。甲基丙烯酰胺基明胶与光引发剂结合后可快速交联、固化，形成特定强度的三维结构。与其他水凝胶相比，甲基丙烯酰胺基明胶为细胞生长和迁移提供条件，是软骨3D生物打印中最常用的载细胞生物墨水成分[18-19]。与其他复合支架相比，接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球在提高微球细胞相容性的同时具备更好的可注射性，可以更好地填充损伤部位，其中的基质细胞衍生因子1不仅可促进细胞体外扩增，还可提高细胞在移植部位的趋化性，以进一步促进组织损伤的修复再生[20]。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1    设计   体外细胞实验与动物体内实验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。
1.2   时间及地点   实验于2022年10月至2023年6月在中国医学科学院整形外科医院研究中心完成。
1.3   材料

1.3.1   实验动物   6月龄健康新西兰白兔3只，雄性，体质量3.0-3.5 kg，用于提取兔耳软骨细胞；6周龄健康裸鼠12只，雌性，体质量20-25 g，用于支架材料植入实验，实验动物均由中国医学科学院整形外科医院实验动物中心提供。

实验方案已通过中国医学科学院整形外科医院实验动物伦理委员会批准(批准号：EAEC 2023-003)。

1.3.2   实验试剂   DMEM高糖培养基、青霉素-链霉素-新霉素抗生素混合物、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS(GIBCO公司，美国)；DMSO、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，美国)；甲基丙烯酰化明胶、光引发剂LAP(EFL公司，中国)；端羧基左旋聚乳酸(济南岱罡生物工程有限公司，中国)；NH4HCO3、2-(N-吗啡啉)乙磺酸、聚乙烯醇、 SN-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(天津希恩思生化科技有限公司，中国)；RNAiso Plus、PrimeScript RT Master Mix(Takara，日本)；LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche公司，瑞士)；阿利新蓝-核固红染色试剂盒、Calcein-AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、Cell Counting Kit-8(碧云天生物有限公司，中国)；重组人趋化因子CXCL12(基质细胞衍生因子1)、人基质细胞衍生因子1 ELISA试剂盒、结晶紫染液、Dil细胞膜橙色荧光探针(北京索莱宝科技有限公司，中国)；兔抗体免疫组化试剂盒(欣博盛生物有限公司，中国)；Ⅱ型胶原多克隆抗体(proteintech公司，美国)；重组Alexa Fluor 488荧光Anti-SDF1抗体(Abcam公司，英国)。
1.3.3   实验仪器   实验室数显高速分散均质机(上海沪析实业有限公司，中国)；悬臂式电动搅拌机、集热式恒温加热磁力搅拌器(上海力辰邦西仪器有限公司，中国)；CO2培养箱(Thermo 公司，美国)；倒置荧光显微镜(Olympus 公司，日本)；共聚焦荧光显微镜(Leica公司，德国)；ANDOR台式共聚焦显微镜(OXFORD公司，英国)；NanoDrop2000c微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；PCR仪(Eppendorf公司，德国)；LightCycler R96Ⅱ qRT-PCR系统(Roche公司，瑞士)。
1.4   实验方法 
1.4.1   兔耳软骨细胞的分离提取、传代扩增[21]   腹腔注射1%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉新西兰白兔，耳缘静脉注射空气栓塞处死，碘伏消毒、乙醇脱碘兔耳后无菌条件下剪取兔双耳，置于含1%青霉素-链霉素-新霉素抗生素混合物的PBS中，4 ℃低温转运至实验室。在超净台内将兔耳于含1%青霉素-链霉素-新霉素抗生素混合物的PBS中多次清洗，无菌剥离皮肤及结缔组织。将软骨剪碎至1 mm3小块，用PBS冲洗后转移至50 mL离心管内，加入5倍体积的0.25%胰蛋白酶，置于37 ℃孵箱中摇动(80-100 r/min摇动速率)消化30 min。1 000 r/min离心5 min后弃上清，去除胰蛋白酶，加入5倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，置于37 ℃孵箱中摇动(80-100 r/min摇动速率)消化10 h。用70 µm过滤筛过滤，1 000 r/min离心5 min后弃上清，用PBS清洗，收集沉淀。调整细胞至合适密度后接种于完全培养基(高糖DMEM培养基+体积分数10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素-新霉素)中，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温常氧培养箱中培养。3 d后换液，得到P0代兔耳软骨细胞。显微镜下观察细胞形态以判断细胞类型及状态，待细胞融合至80%-90%时吸去培养基，用PBS冲洗后加入0.25%胰蛋白酶消化，镜下观察到细胞变圆、间隙明显时加入等量完全培养基中止消化，收集细胞悬液后按1∶3进行传代，待第2代细胞融合至80%时用于后续实验。
1.4.2   左旋聚乳酸多孔微球的制备与筛选   将200 mg的左旋聚乳酸溶于8 mL二氯甲烷中，制成油相。通过单通道注射泵以1 mL/min的速率将2.5 mL 1%碳酸氢铵溶液匀速滴加到油相中，置于高速分散均质机中搅拌(搅拌速率3 600 r/min)混合均匀，制得初乳。迅速将初乳以1 mL/s的速率匀速滴加至200 mL 0.1%聚乙烯醇水溶液中，制得复乳。将复乳置于悬臂式电动搅拌机中(搅拌速率400 r/min)搅拌3 h，得到左旋聚乳酸多孔微球。用去离子水洗涤多孔微球3次，每次20 min。将左旋聚乳酸多孔微球转移至0.1 mol/L氢氧化钠溶液中水解20 min，用去离子水再次洗涤3次。
   将制备的多孔微球以此经过400，300，200 µm的滤网过滤，最终筛选出球径200-300 µm 的多孔微球，经60Co辐照消毒备用。
1.4.3   接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球的制备   将2 mL 左旋聚乳酸多孔微球溶于6 mL 0.1 mol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，加入72 mg SN-羟基丁二酰亚胺和90 mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，室温孵育30 min；加入60 µL 100 µg/mL基质细胞衍生因子1，使其终质量浓度为1 µg/mL，置于4 ℃摇床上孵育24 h，使左旋聚乳酸表面经碱性水解后形成的亲水羧基与基质细胞衍生因子1上的氨基结合为酰胺键，即完成接枝，备用。
1.4.4   基质细胞衍生因子1接枝效果检测   取接枝与未接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球各1 mL，放入小皿中备用。将重组Alexa Fluor488荧光基质细胞衍生因子1抗体用PBST(10 mL PBS+10 µL Tween-20)稀释1 000倍，分别加入小皿中4 ℃避光孵育过夜。用PBS洗3次后，将微球转入共聚焦小皿内，利用共聚焦荧光显微镜进行观察和拍照，在488 nm波长激光激发下基质细胞衍生因子1因子呈绿色荧光，观察判断其接枝情况。此外，收集基质细胞衍生因子1与多孔微球接枝24 h后的上清液，双蒸水稀释50倍，通过人基质细胞衍生因子1 ELISA试剂盒检测上清液中基质细胞衍生因子1水平，即未接枝的量。在已知接枝总量的前提下，可间接得到成功接枝因子的量，进而计算接枝率。
1.4.5   左旋聚乳酸多孔微球形貌表征   将接枝与未接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球分别于-40 ℃冻干48 h，通过场发射扫描电镜、汞压测试(中科百测检测技术有限公司)获得多孔微球大致形貌及孔隙率。
1.4.6   基质细胞衍生因子1对兔耳软骨细胞增殖、迁移与表型维持的影响  
细胞增殖检测：将第2代兔耳软骨细胞以1 000个/孔的密度接种至96孔板中，每孔加入200 µL完全培养基，分3组培养，分别添加0，500，1 000 ng/mL基质细胞衍生因子1。培养第0，2，4，6，8天分别加入CCK-8工作液，检测各孔在450 nm波长下的吸光度值，绘制细胞增殖曲线，判断细胞增殖情况。
细胞迁移检测：用200 µL高糖DMEM培养基重悬第2代兔耳软骨细胞，接种于8 µm孔径Transwell细胞小室中，细胞密度为104/孔，分3组培养，在下室600 µL高糖完全培养基中分别添加0，500，1 000 ng/mL基质细胞衍生因子1。培养24 h后去取出细胞小室，40 g/L多聚甲醛固定后1%结晶紫染色，镜下观察拍照。取下聚碳酸酯膜于30%冰醋酸中脱色，在590 nm波长下检测吸光度值，检测细胞迁移。

qRT-PCR检测：将第2代兔耳软骨细胞接种于6孔板内，每孔加入2 mL完全培养基，细胞密度为3×105/孔，分3组培养，分别添加0，500，1 000 ng/mL基质细胞衍生因子1。培养7 d后，采用Trizol法提取总RNA后，利用NanoDrop 2000c微量分光光度计检测RNA浓度及纯度，符合条件后将RNA反转录为cDNA。在SYBR荧光染料作用下，通过实时荧光定量PCR法检测成增殖细胞核抗原、Ⅱ型胶原、弹性蛋白、Bcl-2 mRNA相对表达量，以GAPDH作为内参对照物。每个样品设3个复孔，用 2-ΔΔCt 法计算各基因mRNA的相对表达量。实时荧光定量PCR反应条件为：预热反应：95 ℃10 min；扩增为 45 个循环：95 ℃15 s 变性，60 ℃30 s 复温。引物由擎科公司代为合成(中国，北京)，基因引物序列见表1。

1.4.7   左旋聚乳酸多孔微球对兔耳软骨细胞增殖与黏附的影响 
活死细胞染色：将接枝与未接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球分别放入低细胞黏附24孔板中，每孔100 µL；将1 mL第2代兔耳软骨细胞悬液接种于多孔微球表面，细胞密度为106/孔。培养7 d后，用活死细胞染色试剂盒进行细胞染色，置于共聚焦荧光显微镜下观察、拍照，在对应波长光的激发下，活细胞呈绿色，死细胞呈红色，利用Image J软件对采集图像进行细胞计数。细胞存活率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。
Dil染色：将接枝与未接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球分别放入低细胞黏附24孔板中，每孔100 µL；将1 mL第2代兔耳软骨细胞(经10 µmol/L Dil标记)悬液接种于多孔微球表面，细胞密度为107/孔，培养于活细胞工作站中。培养1，5 d后，置于台式共聚焦显微镜下观察、拍照，利用Image J软件统计细胞在多孔微球上所占面积比，以此判断细胞增殖。
CCK-8检测：将接枝与未接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球分别放入低细胞黏附24孔板中，每孔100 µL；将1 mL第2代兔耳软骨细胞悬液接种于多孔微球表面，细胞密度为106/孔，每2 d换液1次。培养第1，3，5，7，9天，用PBS清洗微球后放入新24孔板中，每孔加入0.5 mL CCK-8工作液，置于培养箱内避光孵育2.5 h，吸取上清液转移至96孔板中，检测各孔在450 nm波长下的吸光度值，检测细胞增殖。
1.4.8   左旋聚乳酸多孔微球裸鼠皮下植入实验  
体外软骨细胞-微球复合物的构建：高温高压消毒带有10 mm×10 mm×3 mm圆柱凹槽的模具。用DMEM高糖培养基配制10%甲基丙烯酰化明胶溶液，置于65 ℃水浴中使其充分溶解，加入终浓度0.25%蓝光引发剂LAP，通过0.22 µm过滤器除菌后备用。对照组将160 µL甲基丙烯酰化明胶、20 µL蓝光引发剂LAP与20 µL第2代兔耳软骨细胞悬液(细胞浓度1010 L-1)混匀后注入模具内；多孔微球组将甲基丙烯酰化明胶与左旋聚乳酸多孔微球混合(二者体积比为5∶1，总体积为160 µL)，再加入20 µL蓝光引发剂LAP与20 µL第2代兔耳软骨细胞悬液(细胞浓度1010 L-1)，混匀后注入模具内；多孔微球修饰组将甲基丙烯酰化明胶与接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球混合(二者体积比为5∶1，总体积为160 µL)，再加入20 µL蓝光引发剂LAP与20 µL第2代兔耳软骨细胞悬液(细胞浓度1010 L-1)，混匀后注入模具内。将注模块用405 nm蓝光光照交联3-5 s使其充分固化，加入完全培养基后置于CO2培养箱培养过夜，待植入。
裸鼠皮下植入：腹腔注射1%戊巴比妥(50 mg/kg)溶液麻醉12只裸鼠，在背部剪开一长为1.5 cm纵向切口，采用随机数字表法分为3组，分别将对照组、多孔微球组、多孔微球修饰组复合物植入裸鼠两侧背部皮下，每组4只，缝合切口。术后8周，腹腔注射1%戊巴比妥麻醉后颈椎脱位处死裸鼠，取出复合物，进行大体观察和组织学检测。
组织学检测：将复合物置于40 g/L多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片，切片厚度3 µm，进行苏木精-伊红、阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色。①阿利新蓝染色：切片常规脱蜡至水，用PBS充分冲洗，滴加阿利新蓝染液置于湿盒染色1 h，蒸馏水洗去多余染液，滴加核固红染色液染色5 min，洗涤5 min，常规脱水，二甲苯透明，风干后中性树脂封固。②Ⅱ型胶原免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡至水后，用PBS充分清洗，复合消化液抗原修复30 min，用PBS浸洗；加入内源性过氧化物酶阻断10 min，用PBS浸洗；加入体积分数10%山羊血清封闭30 min，吸去多余封闭液，加入Ⅱ型胶原抗体孵育(1∶200)于4 ℃孵育过夜，用PBS浸洗；加入二抗孵育37 ℃孵育30 min，用PBS浸洗，滴加链亲和素标记HRP孵育10 min，DAB显色，水洗、分化，常规脱水，二甲苯透明，风干后中性树脂封固。
qRT-PCR检测：采用Trizol法提取各复合物总RNA，通过实时荧光定量PCR法检测增殖细胞核抗原、Ⅱ型胶原、弹性蛋白、Bcl-2 mRNA相对表达量，检测方法同1.4.6。
1.5   主要观察指标   接枝基质细胞衍生因子1左旋聚乳酸多孔微球对软骨细胞生物学特性及软骨组织形成的影响。
1.6   统计学分析   应用 Graphpad Prism 6软件进行统计分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；P < 0.05代表差异有显著性意义。该文统计学方法已经北京协和医学院生物统计学专家审核。

近年来，多孔微球因具有孔状结构和大比表面积等优势备受关注，常被用作细胞支架材料、3D生物打印墨水、可注射生物材料等[22-23]。多孔微球作为细胞支架材料可提供立体培养环境，更准确地模拟体内环境和细胞间的相互作用，为细胞的增殖和迁移提供空间，维持细胞形态和极性[24]。海绵、纤维网状物等多孔支架材料也可为细胞提供立体培养环境，但在移植体内过程中不可避免会形成创口，而多孔微球具备可注射性，既可减少创口带来的痛苦，又易于精确填充各种大小和形状的缺损[25]。
此外，与水凝胶等其他可注射支架相比，多孔微球可能具有更好的缓释和结构性能[26]，目前已被广泛用于骨、软骨、皮肤、心脏、肝脏和神经的再生[27-32]。
此次实验制备了接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球，以提高左旋聚乳酸的细胞生物相容性，为软骨细胞提供三维生长环境，促进软骨组织的形成。据报道，用于细胞负载的多孔微载体的理想粒径范围应在100-500 μm之间，孔径至少为20 μm，为细胞向支架内部深入生长提供可能性[33]。HUANG等[34]以平均直径约150 μm、孔径20-50 μm的多孔壳聚糖微球作为肝细胞体外培养的微载体，发现此多孔结构可促进细胞黏附、生长和细胞间的相互作用，说明多孔微载体合适的孔径可实现高质量的细胞培养。此次实验制备的微球粒径250-350 μm，孔径22-63 μm，孔隙率约90.63%，可适用于负载细胞、注射、3D生物打印等应用。在软骨组织工程中，理想支架材料应具备高孔隙率及合适的孔径范围，支架的高孔隙率(> 90%)有利于细胞在支架中的迁移和增殖[35]。目前，利于软骨细胞生长的最佳支架孔径仍存在争议，孔径过小则限制细胞向内部迁移，而孔径远大于细胞尺寸时为细胞提供了局部二维环境，此时细胞倾向附着于孔壁附近而无法有效利用孔隙空间[36]。研究发现，当支架孔径大小与细胞大小相当时更利于细胞迁移，最佳孔径取决于软骨细胞及支架类型[37-38]。此次实验发现软骨细胞黏附、长入在未修饰的左旋聚乳酸多孔微球上，再生组织中可见微球内有未降解的甲基丙烯酰胺基明胶和软骨细胞。甲基丙烯酰胺基明胶作为载体避免了软骨细胞与左旋聚乳酸材料的直接接触，为细胞提供更适合的生长条件。
在软骨再生领域，人们大多采用左旋聚乳酸、聚乙醇酸等合成高分子材料多孔微球作为细胞载体，其可塑性强且可提供足够的力学支持。因此，此次实验以左旋聚乳酸为主要成分制备多孔微球，但这类微球存在细胞相容性低的问题，严重限制了细胞的黏附和增殖。为解决此问题，微球常与水凝胶、丝素蛋白、蚕丝纤维等细胞相容性高的材料构建复合支架，前期研究曾构建丝素蛋白与左旋聚乳酸多孔微球复合支架，发现该复合支架有效促进了软骨细胞和脂肪干细胞的增殖及软骨组织形成[39]；此外，还可通过引入细胞黏附肽或其他官能团实现表面改性，提高材料表面亲水性[40]。BAI等[41]通过碳二亚胺法将壳聚糖负载到聚乙醇酸多孔微球表面形成微球复合物，微球表面带正电荷的涂层与带负电荷的细胞膜相互相引、产生黏附作用，进而提高了多孔微球的负载能力；在此基础上，又在微球中加入成软骨诱导剂以促进间充质干细胞分化为软骨细胞并表达软骨修复相关基因，体外实验及大鼠半月板损伤模型中均证实该复合支架有促进间充质干细胞迁移、扩增及组织再生的作用。
为了进一步提高微球与细胞的相容性，此次实验以碳二亚胺法将基质细胞衍生因子1接枝在左旋聚乳酸微球表面以实现改性，不仅可以均匀、稳定负载因子，还可以避免突释现象的发生。与其他修饰方式相比，碳二亚胺法修饰过程中的所有基团均为水溶性，易于在修饰完成后洗脱残留基团，并且细胞毒性较低[42]。NAIR等[43]通过碳二亚胺法化学交联胶原蛋白以改变其化学结构，实现对胶原蛋白生化和机械性能的精准控制。此外，还可以将壳聚糖、丝素蛋白等混合物以碳二亚胺法交联于单一支架材料上，为骨组织再生探索有潜力的生物支架材料[44]。此次实验证实基质细胞衍生因子1的修饰率可以达到93.75%，考虑到局部释放因素，在体内实验中将基质细胞衍生因子1质量浓度设置为1 μg/mL，后续可考虑增加质量浓度。
此次实验结果证实，基质细胞衍生因子1能够促进软骨细胞的增殖、迁移，以及软骨细胞在微球上的黏附、存活和增殖。研究表明，基质细胞衍生因子1与趋化因子受体4结合后可通过蛋白激酶C、核因子κB和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)信号通路分别调控细胞增殖、凋亡和迁移[45-46]。
结论：实验制备了基质细胞衍生因子1修饰的左旋聚乳酸多孔微球，基于多孔微球提供的细胞立体培养环境和基质细胞衍生因子1促进细胞增殖、迁移的作用，初步证实了修饰后左旋聚乳酸多孔微球的细胞相容性明显改善，有利于软骨细胞的增殖、迁移及表型维持，并且可促进体内软骨组织的形成。因此，基质细胞衍生因子1修饰的左旋聚乳酸多孔微球在软骨再生领域表现出一定的应用优势，但基质细胞衍生因子1的缓释浓度、微球比例、细胞与微球预混方式等因素都是影响最终组织形成的关键，仍需进一步深入研究和探讨，为软骨组织构建和再生提供新材料。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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文题释义：

基质细胞衍生因子1：是一类具有强趋化活性的细胞因子，在机体胚胎发育、细胞迁徙与归巢、血管形成与修复、细胞分化、免疫、肿瘤发生等方面均有重要调节作用。基质细胞衍生因子1可通过与软骨细胞趋化因子受体4结合来影响软骨细胞的增殖、存活、分化和成熟，还可在软骨组织工程环境中招募内源性干细胞来修复软骨缺损。

左旋聚乳酸多孔微球：是一种新的组织工程材料，具备高度开放的孔隙结构和大比表面积，可促进细胞增殖、黏附和营养物质运输。左旋聚乳酸多孔微球可塑性强、强度高、可生物降解吸收，已被应用于生物可吸收支架、药物缓释系统、组织缺损填充等研究领域。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

此次研究制备了接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球，粒径250-350 μm，孔径22-63 μm，孔隙率约90.63%，具备良好的孔状结构，为细胞的黏附生长提供立体培养环境。通过碳二亚胺法将基质细胞衍生因子1接枝于微球表面，成功解决了合成聚合物支架细胞相容性低的问题，还促进软骨细胞在微球中的存活及增殖。将软骨细胞分别与有无修饰的左旋聚乳酸多孔微球共混植入裸鼠皮下，结果发现修饰微球组在体内可形成质量较高的软骨组织，胶原形成及糖胺聚糖沉积显著增加，实时荧光定量PCR结果也显示多修饰微球组的培养条件能够促进软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡。总之，接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球在提高聚合物微球细胞相容性的同时有效促进细胞增殖及组织形成，为组织工程软骨构建提供了一种有前途的支架材料。

此次研究制备了接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球，粒径250-350 μm，孔径22-63 μm，孔隙率约90.63%，具备良好的孔状结构，为细胞的黏附生长提供立体培养环境。通过碳二亚胺法将基质细胞衍生因子1接枝于微球表面，成功解决了合成聚合物支架细胞相容性低的问题，还促进软骨细胞在微球中的存活及增殖。将软骨细胞分别与有无修饰的左旋聚乳酸多孔微球共混植入裸鼠皮下，结果发现修饰微球组在体内可形成质量较高的软骨组织，胶原形成及糖胺聚糖沉积显著增加，实时荧光定量PCR结果也显示多修饰微球组的培养条件能够促进软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡。总之，接枝基质细胞衍生因子1的左旋聚乳酸多孔微球在提高聚合物微球细胞相容性的同时有效促进细胞增殖及组织形成，为组织工程软骨构建提供了一种有前途的支架材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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