光交联复合水凝胶支架中人牙髓干细胞的成骨/成牙分化能力

doi:10.12307/2025.071

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 4022-4028.doi: 10.12307/2025.071

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

光交联复合水凝胶支架中人牙髓干细胞的成骨/成牙分化能力

杨杜娟1，程梦可1，刘佳1，2

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2024-02-20 接受日期:2024-04-27 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-12
通讯作者: 刘佳，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:杨杜娟，女，1998年生，新疆医科大学在读硕士，主要从事儿童口腔医学方向研究。
基金资助:
新疆自治区研究生实践创新项目(XJ2023G176)，项目负责人：程梦可

Osteogenic/odontogenic differentiation ability of human dental pulp stem cells under photocrosslinked composite hydrogel scaffold

Yang Dujuan1, Cheng Mengke1, Liu Jia1, 2

1Department of Pediatric Dentistry-Preventive Stomatology, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Institute of Stomatology of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2024-02-20 Accepted:2024-04-27 Online:2025-07-08 Published:2024-09-12
Contact: Liu Jia, MD, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Pediatric Dentistry-Preventive Stomatology, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Institute of Stomatology of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Yang Dujuan, Master candidate, Department of Pediatric Dentistry-Preventive Stomatology, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Graduate Practice Innovation Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. XJ2023G176 (to CMK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

甲基丙烯酸酐改性明胶：是明胶和甲基丙烯酸酐反应产生的一种改性明胶，因含有甲基丙烯酰基而具有光交联的特征。经过紫外线交联可制成相对稳定的水凝胶，具有良好的生物相容性和降解率，可为细胞的黏附及增殖提供良好的生长环境。
经处理牙本质基质：颜色为淡黄色，主要成分为Ⅰ型胶原和非胶原蛋白，是从离体牙中将牙本质分离出来，通过脱矿、研磨、过筛后得到的一种天然物质，保留了天然牙本质小管的基本结构，其中含有多种生长因子，可促进细胞的增殖、分化。

摘要
背景：甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl，Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix，TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率，这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法。
目的：探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响。
方法：将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中，采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力。将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导，采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况，采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达。
结果与结论：①CCK-8检测结果显示，前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高，第10天时速度减缓；②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示，Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P < 0.05)；③RT-PCR结果显示，

Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P < 0.05)，且14 d基因表达量明显高于7 d(P < 0.05)。结果表明，培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力，能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力。

https://orcid.org/0009-0007-6928-9446 (杨杜娟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 牙髓再生, 甲基丙烯酸酐改性明胶, 牙本质基质, 复合支架, 牙髓干细胞, 成骨, 成牙本质

Abstract: BACKGROUND: The composite hydrogel scaffold formed by crosslinking of gelatin-methacryloyl (Gel-MA) and treated dentin matrix (TDM) under a certain proportion of ultraviolet light has good porosity, mechanical properties, swelling properties, and biodegradation rate, which provides a new idea and method for clinical pulp regeneration of young permanent teeth.
OBJECTIVE: To explore the effect of Gel-MA/TDM composite hydrogel scaffold with 1:2 mass ratio on the proliferation ability and osteogenic/odontoblast differentiation ability of human dental pulp stem cells.
METHODS: The passage 3 dental pulp stem cells were inoculated into the Gel-MA/TDM composite hydrogel scaffold with a mass ratio of 1:2. The proliferation ability of human dental pulp stem cells in the composite hydrogel scaffold was detected by CCK-8 assay. Dental pulp stem cells at passage 3 were cultured in Gel-MA/TDM composite hydrogel scaffold with a mass ratio of 1:2 for osteogenic induction. The formation of mineralized nodules was observed by alkaline phosphatase and alizarin red staining. The gene expression levels of odontogenic factors (dentin matrix protein 1, dentin sialophosphoprotein), and osteogenic factors (osteocalcin, Runt-related transcription factor 2) were detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of CCK-8 assay showed that the proliferation ability of dental pulp stem cells increased significantly in the first 7 days, and slowed down on day 10. (2) The results of alkaline phosphatase staining and alizarin red staining showed that the alkaline phosphatase activity and the formation of mineralized nodules of dental pulp stem cells in the Gel-MA/TDM composite hydrogel group were stronger than those in Gel-MA hydrogel group (P < 0.05). (3) RT-PCR results showed that the gene expression levels of dentin matrix protein 1, dentin sialophosphoprotein, osteocalcin, and Runt-related transcription factor 2 in dental pulp stem cells in Gel-MA/TDM composite hydrogel group were significantly higher than those in Gel-MA hydrogel group (P < 0.05). The gene expression level at 14 days was significantly higher than that at 7 days (P < 0.05). The results conclude that the dental pulp stem cells cultured on Gel-MA/TDM composite hydrogel scaffolds with a mass ratio of 1:2 exhibit a good proliferation ability, which can strengthen the osteogenic and odontogenic differentiation abilities of dental pulp stem cells.

Key words: dental pulp regeneration, gelatin-methacryloyl, dentinal matrix, composite scaffold, dental pulp stem cell, osteogenesis, odontogenic

中图分类号:

杨杜娟, 程梦可, 刘佳. 光交联复合水凝胶支架中人牙髓干细胞的成骨/成牙分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4022-4028.

Yang Dujuan, Cheng Mengke, Liu Jia. Osteogenic/odontogenic differentiation ability of human dental pulp stem cells under photocrosslinked composite hydrogel scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 4022-4028.

图/表（结果） 2

2.1 人牙髓干细胞的培养及鉴定结果 培养第 7 天可见有部分牙髓干细胞贴壁，见图 1A。细胞传代后 24 h 镜下可见大部分细胞贴壁完成，细胞呈长梭形，形态似成纤维细胞。传代至第 3 代可见细胞生长良好，形态均匀，见图 1B。流式细胞技术鉴定结果显示，细胞表面标记物 CD29 和 CD105 的阳性率为 99.84% 和 82.81%，CD14 和 CD45 的表达为阴性，见图 2。 2.2 Gel-MA/TDM 复合水凝胶的溶胀性能不同质量比的 Gel-MA/TDM 复合水凝胶大体观如图 3 所示，1 ∶ 2 Gel-MA/ TDM 复合水凝胶呈微黄色圆柱形的凝胶状，Gel-MA 浓度越高，复合水凝胶的颜色越透明。单纯 Gel-MA 水凝胶为透明的圆柱形凝胶状。不同质量比的复合水凝胶及单纯 Gel-MA 水凝胶的溶胀曲线如图 4 所示，1 ∶ 2 质量比的 Gel-MA/TDM 复合水凝胶溶胀比最高，在 4 h 左右达到溶胀平衡，4 h 溶胀比为 (629.36±83.27)%。在初始 4 h 内可见水凝胶迅速吸收溶胀 (0.5，2，4 h 溶胀比明显增高， P < 0.05)，然后溶胀速度开始减慢，直至溶胀平衡 (12， 24 h 溶胀比未见明显变化，P > 0.05)。 2.3 Gel-MA/TDM 复合水凝胶的孔隙率及生物降解率孔隙率检测结果如图 5 所示，4 组水凝胶的孔隙率差异有显著性意义 (P < 0.05)。其中 1 ∶ 2 Gel-MA/TDM 复合水凝胶支架的孔隙率最高，为 (44.43±1.42)%，其次是 1 ∶ 1 Gel-MA/TDM 复合水凝胶支架和 2 ∶ 1 Gel-MA/TDM 复合水凝胶支架，分别为 (34.41±1.07)% 和 (23.04±1.27)%，单纯 Gel-MA 组的孔隙率最低，为 (13.77±1.07)%。生物降解率如图 6 所示，4 组支架的生物降解率差异有显著性意义 (P < 0.05)。在第 14 天时，1 ∶ 2 Gel-MA/TDM 复合水凝胶支架的生物降解率最高，达到了 25% 以上，为 (27.71±0.51)%。 2.4 细胞活力 CCK-8 细胞增殖实验显示：牙髓干细胞在 1 ∶ 2 质量比 Gel-MA/TDM 复合水凝胶支架中，第 3，5， 7 天可见明显增殖 (P < 0.05)，第 10 天可见增殖速度减缓，第 7 天与第 10 天增殖无明显差异 (P > 0.05)，见图 7。与对照组相比，在第 1 天未见明显差异 (P > 0.05)，第 3，5， 7，10 天时可见在复合水凝胶支架中的牙髓干细胞增殖能力明显增强。 2.5 碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果牙髓干细胞在成骨诱导液中连续培养 7，14 d 进行碱性磷酸酶染色，结果显示 14 d 染色强度明显高于 7 d(P < 0.05)，且在 1 ∶ 2 质量比 Gel-MA/TDM 复合水凝胶支架中碱性磷酸酶活性更高 (P < 0.05)，见图 8。连续成骨诱导 14，21 d 后进行茜素红染色，结果显示 21 d 染色强度明显强于 14 d (P < 0.05)，与对照组相比，1 ∶ 2 质量比 Gel-MA/TDM 复合水凝胶支架内可见更明显的矿化结节生成(P < 0.05)，见图9。 2.6 RT-PCR 检测成骨诱导 14 d 的成骨 / 成牙本质相关基因表达量明显高于 7 d(P < 0.05)。1 ∶ 2 质量比 Gel-MA/ TDM 复合水凝胶支架中的成骨 / 成牙本质相关基因表达高于对照组及单纯 Gel-MA 组，单纯 Gel-MA 组中成骨 / 成牙本质相关基因表达高于对照组 ( 均 P < 0.05)，见图 10。

参考文献

[1] CUI D, LI H, WAN M, et al. The Origin and Identification of Mesenchymal Stem Cells in Teeth: from Odontogenic to Non-odontogenic. Curr Stem Cell Res Ther. 2018;13(1):39-45.
[2] SCHMALZ G, WIDBILLER M, GALLER KM. Clinical Perspectives of Pulp Regeneration. J Endod. 2020;46(9S):S161-S174.
[3] KıLıÇ Y, KARATAŞLıOĞLU E, KAVAL ME. The Effect of Root Canal Preparation Size and Taper of Middle Mesial Canals on Fracture Resistance of the Mandibular Molar Teeth: An In Vitro Study. J Endod. 2021;47(9):1467-1471.
[4] SISMANOGLU S, ERCAL P. Dentin-Pulp Tissue Regeneration Approaches in Dentistry: An Overview and Current Trends. Adv Exp Med Biol. 2020;1298: 79-103.
[5] SUGIAMAN VK, DJUANDA R, PRANATA N, et al. Tissue Engineering with Stem Cell from Human Exfoliated Deciduous Teeth (SHED) and Collagen Matrix, Regulated by Growth Factor in Regenerating the Dental Pulp. Polymers (Basel). 2022;14(18):3712.
[6] YUAN SM, YANG XT, ZHANG SY, et al. Therapeutic potential of dental pulp stem cells and their derivatives: Insights from basic research toward clinical applications. World J Stem Cells. 2022;14(7):435-452.
[7] YOSHIDA S, TOMOKIYO A, HASEGAWA D, et al. Insight into the Role of Dental Pulp Stem Cells in Regenerative Therapy. Biology (Basel). 2020;9(7):160.
[8] 张浩,高淑君,武沐洋,等.低氧浓度促进人牙髓干细胞增殖及神经分化[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2022,31(2):133-138.
[9] XIE Z, SHEN Z, ZHAN P, et al. Functional Dental Pulp Regeneration: Basic Research and Clinical Translation. Int J Mol Sci. 2021;22(16):8991.
[10] LIU P, ZHANG Y, MA Y, et al. Application of dental pulp stem cells in oral maxillofacial tissue engineering. Int J Med Sci. 2022;19(2):310-320.
[11] FERNANDES TL, CORTEZ DE SANTANNA JP, FRISENE I, et al. Systematic Review of Human Dental Pulp Stem Cells for Cartilage Regeneration. Tissue Eng Part B Rev. 2020;26(1):1-12.
[12] DAS M, SLOAN AJ. Stem cell sources from human biological waste material: a role for the umbilical cord and dental pulp stem cells for regenerative medicine. Hum Cell. 2023;36(4):1312-1325.
[13] 赵阳鹏,陈佳楠,朱强.组织工程技术在牙髓再生中的研究进展[J].临床口腔医学杂志,2023,39(10):634-637.
[14] CHANSORIA P, ASIF S, POLKOFF K, et al. Characterizing the Effects of Synergistic Thermal and Photo-Cross-Linking during Biofabrication on the Structural and Functional Properties of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels. ACS Biomater Sci Eng. 2021;7(11):5175-5188.
[15] SUN M, SUN X, WANG Z, et al. Synthesis and Properties of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels and Their Recent Applications in Load-Bearing Tissue. Polymers (Basel). 2018;10(11):1290.
[16] PEPELANOVA I, KRUPPA K, SCHEPER T, et al. Gelatin-Methacryloyl (GelMA) Hydrogels with Defined Degree of Functionalization as a Versatile Toolkit for 3D Cell Culture and Extrusion Bioprinting. Bioengineering (Basel). 2018;5(3):55.
[17] ZHANG X, ZHOU S, ZHAN Y, et al. Molecular insights into the proteomic composition of porcine treated dentin matrix. Mater Today Bio. 2024;25: 100990.
[18] LI R, GUO W, YANG B, et al. Human treated dentin matrix as a natural scaffold for complete human dentin tissue regeneration. Biomaterials. 2011; 32(20):4525-4538.
[19] ZHU T, GUO WH. Dentin matrix in tissue regeneration: a progress report. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2019;37(1):92-96.
[20] BI F, ZHANG Z, GUO W. Treated Dentin Matrix in Tissue Regeneration: Recent Advances. Pharmaceutics. 2022;15(1):91.
[21] YANG B, CHEN G, LI J, et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 2012;33(8):2449-2461.
[22] 程梦可,杨杜娟,刘佳.甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质生物活性支架的制备及性能[J].中国组织工程研究,2024,28(22): 3555-3560.
[23] 刘源,惠以宁,姜冰,等.LED红光上调MAPK信号促进炎性环境中人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化[J].口腔疾病防治,2023,31(10):701-711.
[24] MOUSSA DG, APARICIO C. Present and future of tissue engineering scaffolds for dentin-pulp complex regeneration. J Tissue Eng Regen Med. 2019;13(1):58-75.
[25] 黄波,陈明学,彭礼庆,等.可注射性甲基丙烯酸酐改性明胶/软骨源性基质微粒复合水凝胶支架的制备及生物相容性[J].中国组织工程研究,2022,26(16):2480-2486.
[26] KLOTZ BJ, GAWLITTA D, ROSENBERG AJWP, et al. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends Biotechnol. 2016;34(5):394-407.
[27] DUBEY N, RIBEIRO JS, ZHANG Z, et al. Gelatin methacryloyl hydrogel as an injectable scaffold with multi-therapeutic effects to promote antimicrobial disinfection and angiogenesis for regenerative endodontics. J Mater Chem B. 2023;11(17):3823-3835.
[28] CELIKKIN N, MASTROGIACOMO S, JAROSZEWICZ J, et al. Gelatin methacrylate scaffold for bone tissue engineering: The influence of polymer concentration. J Biomed Mater Res A. 2018;106(1):201-209.
[29] KHAYAT A, MONTEIRO N, SMITH EE, et al. GelMA-Encapsulated hDPSCs and HUVECs for Dental Pulp Regeneration. J Dent Res. 2017;96(2):192-199.
[30] HOLIEL AA, MUSTAFA HM, SEDEK EM. Biodegradation of an injectable treated dentin matrix hydrogel as a novel pulp capping agent for dentin regeneration. BMC Oral Health. 2023;23(1):126.
[31] GRAWISH ME, GRAWISH LM, GRAWISH HM, et al. Demineralized Dentin Matrix for Dental and Alveolar Bone Tissues Regeneration: An Innovative Scope Review. Tissue Eng Regen Med. 2022;19(4):687-701.
[32] TRAPHAGEN SB, FOURLIGAS N, XYLAS JF, et al. Characterization of natural, decellularized and reseeded porcine tooth bud matrices. Biomaterials. 2012;33(21):5287-5296.
[33] JIAO L, XIE L, YANG B, et al. Cryopreserved dentin matrix as a scaffold material for dentin-pulp tissue regeneration. Biomaterials. 2014;35(18): 4929-4939.
[34] LIU S, SUN J, YUAN S, et al. Treated dentin matrix induces odontogenic differentiation of dental pulp stem cells via regulation of Wnt/β-catenin signaling. Bioact Mater. 2021;7:85-97.
[35] 李鹏,杨秀.基于铜离子交联改善壳聚糖水凝胶力学性能和抗菌性能的研究[J].北京生物医学工程,2024,43(1):88-93.
[36] FATHIL MAM, KATAS H. Antibacterial, Anti-Biofilm and Pro-Migratory Effects of Double Layered Hydrogels Packaged with Lactoferrin-DsiRNA-Silver Nanoparticles for Chronic Wound Therapy. Pharmaceutics. 2023;15(3):991.
[37] LI L, YU F, ZHENG L, et al. Natural hydrogels for cartilage regeneration: Modification, preparation and application. J Orthop Translat. 2018;17:26-41.
[38] ZHOU Z, CUI J, WU S, et al. Silk fibroin-based biomaterials for cartilage/osteochondral repair. Theranostics. 2022;12(11):5103-5124.
[39] SEDEK EM, KAMOUN EA, EL-DEEB NM, et al. Photocrosslinkable gelatin-treated dentin matrix hydrogel as a novel pulp capping agent for dentin regeneration: I. synthesis, characterizations and grafting optimization. BMC Oral Health. 2023;23(1):536.
[40] LIU Y, LI T, SUN M, et al. ZIF-8 modified multifunctional injectable photopolymerizable GelMA hydrogel for the treatment of periodontitis. Acta Biomater. 2022;146:37-48.

引言

牙髓是负责牙本质生成、牙齿感觉的软组织，容易受到创伤和细菌侵袭，从而导致不可逆的牙髓炎和牙髓坏死[1]。目前临床上治疗牙髓炎和牙髓坏死的主要手段仍为根管治疗[2]，但在治疗过程中切削根管内部分牙本质，使根管壁变薄，增大了根折风险[3-4]，所以保持牙髓活力对于牙齿的抗力和持久应用至关重要。近年来基于组织工程的牙髓再生研究成为讨论热点。牙源性干细胞、支架、生长因子是牙髓再生工程的重要组成部分[5]。牙髓干细胞作为牙髓再生的重要干细胞来源之一[6]，具有较强的增殖能力和多向分化潜能[7-8]。牙髓干细胞相较于其他干细胞，更容易形成牙髓样组织[9]，目前在再生医学方面多被应用[10-12]。
支架为细胞的生长提供生物环境和结构支持[13]。在再生工程中，水凝胶具有良好的生物性能和物理性能，其中明胶作为高分子水凝胶因良好的可调节性，被广泛应用于生物医学[14]。甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl，Gel-MA)是明胶和甲基丙烯酸酐反应产生的一种改性明胶，具有光交联的特征，加入光引发剂，在紫外灯照射下可得到稳定的Gel-MA水凝胶[15]。Gel-MA水凝胶不仅具有良好的生物相容性和降解性，还能模拟细胞外基质，提供细胞生长的微环境[16]。但单纯Gel-MA水凝胶机械性能较差，在处理过程中极易碎裂。经处理牙本质基质(treated dentin matrix，TDM)是一种从人体牙齿中提取的非细胞三维网络支架[17]，颜色为淡黄色，其不仅具有良好的机械性能和生物相容性[18]，还保留了天然牙本质小管的基本结构，富含多种牙源性蛋白[19]，能更好地诱导牙髓干细胞的增殖、分化，促进牙髓、牙本质的再生[20-21]。
课题组前期研究得出经冷冻干燥的质量比为1∶2的Gel-MA/TDM复合支架具有更优的孔隙率及机械性能[22]，该研究拟探讨质量比为1∶2的Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架中牙髓干细胞的增殖及成骨/成牙本质能力，为后续在临床上使用该复合支架促进牙髓再生奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞分组观察实验，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2023年3-9月在新疆医科大学研究中心完成。
1.3 材料 Gel-MA(阿拉丁)；DMEM高糖培养基(Cytiva，美国)；胎牛血清(BI，以色列)；双抗(Gibco，美国)；谷氨酰胺(HyClone，美国)；PBS溶液(HyClone，美国)；0.25%胰蛋白酶(HyClone，美国)；Ⅰ型胶原酶(索莱宝，中国)；甲基丙烯酸酐明胶(阿拉丁，美国)；光引发剂(阿拉丁，美国)；EDTA(索莱宝，中国)；溶菌酶(索莱宝，中国)；CCK-8检测试剂盒(索莱宝，中国)；成骨诱导分化试剂盒(OriCell，中国)；茜素红染色试剂盒(Cyagen，美国)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，中国)；RT-PCR试剂盒(反转录及扩增试剂盒)(天根公司，中国)。
收集新疆医科大学第一附属医院颌面外科门诊拔除的新鲜离体牙。纳入标准：16-25岁患者因正畸或阻生拔除的前磨牙或第三磨牙，牙齿完整，无龋，无牙髓或根尖周病变，取得患者及家属的知情同意并签署同意书。
实验已通过新疆医科大学伦理委员会批准，伦理审批号：K202308-24。
1.4 方法
1.4.1 人牙髓干细胞的提取和鉴定 将新鲜拔除的离体牙置于含有4%双抗的PBS溶液中，在超净台内分离牙冠，弃其冠髓，取之根髓，弃根尖2 mm的牙髓，将剩余的牙髓组织放置在培养皿中，PBS反复冲洗两三次，用无菌刀片将其切碎，用1 mg/mL Ⅰ型胶原酶消化30 min，离心后加入完全培养基(含体积分数12%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基)重悬，置于细胞培养箱中培养，隔3 d换1次液，待细胞生长至80%-90%汇合传代，取第3-5代细胞用于后续实验。采用流式细胞技术检测牙髓干细胞表面标志物，其中阳性标志物为CD29、CD105，阴性标志物为CD14、CD45。
1.4.2 TDM的制取 离体牙以高速手机去除牙周组织、牙冠、根尖部分2 mm牙根、表面牙釉质、牙骨质及髓腔侧前期牙本质，蒸馏水超声清洗10 min，重复3次，依次置于17 mol/L EDTA溶液10 min；10 mol/L EDTA溶液5 min；5 mol/L EDTA溶液10 min梯度脱矿，经研磨后高压蒸汽灭菌消毒，4 ℃保存备用。
1.4.3 构建Gel-MA/TDM复合水凝胶支架 将冻干的Gel-MA以0.1 g/L的质量浓度溶于PBS中，加入0.5 g/L光引发剂，经过滤除菌后加入无菌TDM(Gel-MA与TDM质量比分别为1∶2，1∶1，2∶1)分散至Gel-MA溶液中，得到不同质量比的Gel-MA/TDM混合溶液，混匀后注入96孔板内，紫外线(365 nm，3 W)交联2 min，形成不同质量比的Gel-MA/TDM复合水凝胶支架。
1.4.4 复合水凝胶支架的溶胀性能测试 将交联后制成的质量比为1∶2，1∶1，2∶1的Gel-MA/TDM复合水凝胶及单纯Gel-MA干燥后称质量为m0，然后在室温条件下，将复合水凝胶放入PBS中，在不同的时间点(0.5，2，4，12，24 h)分别称质量为mt。设置3个平行样。溶胀比=(mt-m0)/m0。
1.4.5 复合水凝胶支架的孔隙率及生物降解率 采用比重瓶法测定不同质量比的Gel-MA/TDM复合水凝胶支架及单纯Gel-MA水凝胶支架的孔隙率，以无水乙醇为液体介质，称量充满无水乙醇的比重瓶质量，记为m1；将干质量m0的支架浸入无水乙醇中，真空脱泡30 min，直至支架完全被无水乙醇所饱和，加入乙醇直至比重瓶充满相同刻度，再次称质量，记为m2；取出充盈乙醇的样品，称量剩余的液体与比重瓶质量，记为m3。支架孔隙率=(m2-m3-m0) / (m1-m3)。
取冷冻干燥的不同质量比的Gel-MA/TDM复合水凝胶支架及单纯Gel-MA水凝胶支架，记录初始质量为m1，然后用含10 mg/mL溶菌酶的PBS(pH=7.4)在37 ℃孵育1，3，7，14 d，吸水纸吸去表面多余水分，冻干，冻干后的样品质量记为mt。生物降解率=(m1-mt)/m1×100%。
1.4.6 CCK-8细胞增殖实验 将第3代牙髓干细胞以2×103个/孔均匀接种至预先放置1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架的96孔板中，紫外线交联后添加适量完全培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，每3 d换液1次，分别于培养1，3，5，7，10 d，收集细胞，待检测孔加入10 μL CCK-8工作液及90 μL细胞悬液(避光下操作)，37 ℃培养箱中恒温孵育2 h，采用酶标仪检测450 nm波长处吸光度值。每组设置3个复孔。对照组牙髓干细胞常规培养。
1.4.7 碱性磷酸酶染色和茜素红染色 ①碱性磷酸酶染色：将第3代牙髓干细胞以1×104个/孔接种至预先放置1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架的6孔板中，培养24 h后加入成骨诱导液2 mL，隔天换液1次，成骨诱导培养7，14 d后，加入40 g/L多聚甲醛固定10-15 min，蒸馏水轻柔冲洗，加入碱性磷酸酶染色工作液，避光孵育10-15 min，于倒置显微镜下观察、拍照。用Image J软件对拍照的染色图片进行半定量分析。②茜素红染色：将第3代牙髓干细胞以1×104个/孔接种至预先放置1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架的6孔板中，培养24 h后加入成骨诱导液2 mL，隔天换液1次，成骨诱导培养14，21 d后，移除原有培养基，每孔加入适量PBS，静置1 min后移除，加入40 g/L多聚甲醛固定细胞10-15 min，PBS洗涤，加入茜素红S染色液均匀覆盖细胞，室温染色30 min，蒸馏水充分洗涤，于倒置显微镜下观察、拍照。用Image J软件对拍照的染色图片进行半定量分析。

1.4.8 RT-PCR检测 用Trizol一步法提取成骨诱导分化7，14 d牙髓干细胞的总RNA，根据反转录试剂盒合成底物cDNA。RT-PCR检测牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、成骨相关因子骨钙素(osteocalcin，OCN)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)基因表达量，参照SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明书进行扩增。重复3次。选择GAPDH作为内参基因，DMP-1、DSPP、OCN、RUNX2基因相对表达量采用2-ΔΔCt方法进行分析。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架的溶胀性能、孔隙率及生物降解率，1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架对牙髓干细胞增殖、成骨/成牙本质分化的影响。

1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析并绘图，数据以x±s表示。两两比较使用独立样本 t 检验，多组间比较使用单因素方差分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。该文章统计学方法已通过新疆医科大学生物统计学专家审核。

讨论

牙髓再生工程是目前广大学者研究的热点，是延长无牙髓牙齿在口腔内存在时间的一种重要治疗方法。干细胞和细胞支架是牙髓再生的基础和关键。牙髓干细胞具有较强的生长及多向分化能力，免疫原性低，常作为牙髓再生的细胞来源[23]。支架材料为牙髓再生提供了稳定的环境。目前的牙髓再生支架包括天然来源支架和人工合成支架。常见的天然来源支架有多糖、明胶、丝、脱细胞外基质等[24]。
Gel-MA是由明胶通过化学修饰制备的一种半合成生物材料[25]，其结合了明胶的生物活性和理化性能可调节性[26]。研究证实Gel-MA水凝胶不仅支持人牙髓干细胞的黏附及增殖，同时也可促进组织新生血管的形成[27]。CELIKKIN等[28]研究表明Gel-MA水凝胶促进了细胞外基质的钙化。KHAYAT等[29]研究证实Gel-MA水凝胶可促进牙髓干细胞在牙本质表面的黏附、牙髓干细胞在牙本质小管内的伸展、修复性牙本质基质的形成。单纯Gel-MA水凝胶脆性是其较大的缺点，限制了在特定组织修复中的应用。因此，在Gel-MA中加入其他生物支架材料可中和其脆性较大的不足。
TDM是一种从人体牙齿中提取的天然物质，有研究表明TDM水凝胶具有与天然硬组织相似的力学性能[30]，同时可释放多种成骨和成牙相关因子及蛋白质，提供牙源性诱导环境，促进骨组织样结构及牙本质的形成[31-33]。研究显示TDM可通过直接靶向GSK3β和激活经典的Wnt/β-catenin信号通路来促进人牙髓干细胞的牙源性分化[34]，证明了TDM在牙齿再生方面具有较大的应用潜力。
此次实验通过不同质量比的Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架的性能分析，筛选出合适质量比的复合光交联水凝胶支架，检测人牙髓干细胞在此复合支架中的细胞活力及成骨/成牙本质相关基因表达，探究该支架对人牙髓干细胞增殖及分化能力的影响。
水凝胶的表面形态会影响其溶胀速率[35]，溶胀性能会影响水凝胶释放营养物质[36]。将光交联后的1∶1，2∶1，1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架和单纯Gel-MA水凝胶干燥后置于PBS中，观察到Gel-MA/TDM复合水凝胶在初始4 h内迅速吸收溶胀，在4 h以后达到溶胀平衡，且1∶2质量比的Gel-MA/TDM复合水凝胶支架溶胀性能更优。水凝胶的网状孔在细胞生长的信号传导以及营养输送中起着重要作用。合适的孔隙率可以促进细胞黏附和营养物质的运输，相互连接和开放的孔隙可以促进细胞生长、增殖和迁移[37]。对不同质量比的Gel-MA/TDM复合水凝胶支架的孔隙率进行检测，发现 1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架的孔隙率最高，单纯Gel-MA组的孔隙率最低。支架的生物降解性直接影响组织修复的速度和质量。在支架植入的早期阶段，支架材料应该是稳定的，可为细胞和组织提供机械支撑，在此之后支架材料需要逐渐降解以适应新的组织生长[38]。将不同质量比的复合水凝胶支架及单纯Gel-MA置于含溶菌酶的PBS中模拟生物环境，检测各组支架的生物降解能力，结果显示1∶2质量比 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架的生物降解率最高，在第14天时生物降解率达到了25%以上。随着Gel-MA的浓度增加，降解率随之降低，作者认为可能是光交联后的水凝胶网状结构较为紧密，所以降解效率降低。由此可知，1∶2质量比的Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架的孔隙率和生物降解率均优于1∶1，2∶1质量比的Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架及单纯Gel-MA，表现出良好的生物相容性，可为细胞的生长、增殖提供合适的环境。
CCK-8测试结果显示在1∶2质量比的Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架中，牙髓干细胞显示出较好的增殖能力。与对照组相比，牙髓干细胞在Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中显示出更好的细胞活力。在成骨诱导的环境下将牙髓干细胞在1∶2质量比的Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上培养，碱性磷酸酶活性及矿化结节生成高于对照组，推断培养在复合支架中的牙髓干细胞具有一定的成骨分化潜能。RT-PCR结果显示，与对照组及单纯Gel-MA组比较，牙髓干细胞在1∶2 Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架中的成骨、成牙相关基因表达较高，作者推断这有可能与TDM释放的生长因子通过多种通路进行信号传递以及Gel-MA能提供模拟细胞外基质的微环境有
关[39-40]。
综上，培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力，能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力，为后期研究该复合支架促进牙髓再生的作用机制奠定了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

光交联复合水凝胶支架中人牙髓干细胞的成骨/成牙分化能力

Osteogenic/odontogenic differentiation ability of human dental pulp stem cells under photocrosslinked composite hydrogel scaffold

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[1]	韩海慧, 冉磊, 孟晓辉, 辛鹏飞, 向峥, 边艳琴, 施杞, 肖涟波. 靶向成纤维细胞生长因子受体1信号改善类风湿关节炎的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1905-1912.
[2]	赵济宇, 王少伟. 叉头框转录因子O1信号通路与骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1923-1930.
[3]	朱汉民, 王松, 肖文琳, 张文静, 周茜, 何烨, 李微, . 线粒体自噬调控骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1676-1683.
[4]	艾克帕尔·艾尔肯, 陈晓涛, 吾凡别克·巴合提. 成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体促进炎症微环境下人牙周膜干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1388-1394.
[5]	孙玉婷, 吴家媛, 张剑. 影响牙髓干细胞成骨及成牙本质分化的相关物理因素及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1531-1540.
[6]	朗么磋, 张义林, 汪莉. miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体影响牙槽骨成骨细胞增殖及凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 899-907.
[7]	肖放, 黄雷, 王琳. 磁性纳米材料与磁场效应加速骨损伤修复[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 827-838.
[8]	赵增波, 李晨曦, 窦晨雷, 马娜, 周冠军. 壳聚糖/甘油磷酸钠/海藻酸钠/益母草碱水凝胶的抗炎与促成骨作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 678-685.
[9]	余双奇, 丁凡, 万松, 陈伟, 张学俊, 陈东, 李强, 林作丽. PLGA/赖氨酸接枝氧化石墨烯纳米粒子复合支架对MC3T3细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 707-712.
[10]	葛霄, 赵状状, 郭舒瑜, 徐荣耀. HOXA10基因修饰骨髓间充质干细胞促进骨再生[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7701-7708.
[11]	周绍兰, 袁媛园, 潘露, 徐文, 瞿姝熳. miR-26b对人脱落乳牙牙髓干细胞向神经及血管分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7769-7775.
[12]	黎庭悦, 郭倩, 何文喜, 吴家媛. 长链非编码RNA TP53TG1促进根尖牙乳头干细胞成牙本质及成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7776-7782.
[13]	李蕴喆, 牛泽蕃, 王紫瑈, 艾崇毅, 陈刚, 王新兴. 川续断皂苷Ⅵ促进低氧环境下MC3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7481-7489.
[14]	柳承源, 过倩萍. Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7490-7498.
[15]	王凯刚, 郝东升, 马沛, 周硕, 李睿敏. 对比不同生物支架用于年轻恒牙牙髓血运重建效果的贝叶斯网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7447-7460.