肉苁蓉苷A通过JNK/MAPK通路抑制破骨细胞活性

doi:10.12307/2025.300

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (6): 1144-1151.doi: 10.12307/2025.300

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

肉苁蓉苷A通过JNK/MAPK通路抑制破骨细胞活性

李岳尧1，张民2，杨家驹2

1山西中医药大学，山西省晋中市 030619；2山西医科大学第二医院，山西省太原市 030001

收稿日期:2024-01-29 接受日期:2024-03-06 出版日期:2025-02-28 发布日期:2024-06-20
通讯作者: 张民，博士，主任医师，山西医科大学第二医院，山西省太原市 030001
作者简介:李岳尧，男，1999年生，山东省招远市人，汉族，山西中医药大学在读硕士，主要从事骨质疏松与骨关节疾病的研究。
基金资助:
山西省中医药管理局省中医药科研课题，项目负责人：张民

Cistanoside A mediates p38/MAPK pathway to inhibit osteoclast activity

Li Yueyao1, Zhang Min2, Yang Jiaju2

1Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; 2Second Hospital of Shanxi University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2024-01-29 Accepted:2024-03-06 Online:2025-02-28 Published:2024-06-20
Contact: Zhang Min, MD, Chief physician, Second Hospital of Shanxi University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Li Yueyao, Master candidate, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
Supported by:
Chinese Medicine Scientific Research Project of Shanxi Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (to ZM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肉苁蓉苷A(Cistanoside A，CisA)：是从肉苁蓉中提取的一类苯乙醇苷类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗骨质疏松的生物活性。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路：是细胞中的一条重要的信息传递链条，能够通过促进细胞凋亡和细胞增殖以及调节各种细胞因子的功能参与神经元发育、破骨细胞分化、细胞迁移和癌症等过程。

背景：研究证实肉苁蓉苷A具有抗炎、抗氧化和抗骨质疏松的作用，但其对破骨细胞分化和功能的影响及潜在的机制尚缺少研究。
目的：探讨肉苁蓉苷A对核因子κB受体活化因子配体诱导的体外破骨细胞分化和骨吸收功能的影响及作用机制。
方法：提取与培养4-6周龄C57BL/6小鼠股骨和胫骨中的骨髓巨噬细胞，采用CCK-8毒性实验检验不同浓度的肉苁蓉苷A(5，10，20，40，80，160 μmol/L)对骨髓巨噬细胞的毒性，抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察不同浓度的肉苁蓉苷A干预破骨细胞的分化情况，确定药物的有效干预浓度。将实验分为阳性对照组、肉苁蓉苷A低、中、高剂量组(40，80，160 μmol/L)，细胞贴壁后各组均加入50 ng/mL的核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞分化，肉苁蓉苷A低、中、高剂量组分别加入相应剂量的肉苁蓉苷A进行干预。采用肌动蛋白环鬼笔环肽染色和DAPI染色检测肉苁蓉苷A对破骨细胞形成的影响；骨磨片甲苯胺蓝染色观察肉苁蓉苷A对破骨细胞骨吸收功能的影响；Western blot检测JNK/MAPK通路上下游蛋白的表达情况；RT-qPCR检测抗酒石酸酸性磷酸酶、DC-STAMP、Nfatc-1、Ctsk和c-Fos等破骨细胞分化和骨吸收功能相关基因的表达情况。
结果与结论：①抗酒石酸酸性磷酸酶染色、肌动蛋白环染色和骨陷窝甲苯胺蓝染色结果表明，与阳性对照组相比，肉苁蓉苷A对核因子κB受体活化因子配体诱导的体外破骨细胞的分化和骨吸收功能具有呈剂量依赖性的显著抑制作用；②RT-qPCR结果表明，与阳性对照组相比，肉苁蓉苷A高剂量组和低剂量组的抗酒石酸酸性磷酸酶、DC-STAMP、Nfatc-1、Ctsk和c-Fos等的mRNA表达量均显著降低，且肉苁蓉苷A高剂量组的降低效果更加显著；③Western blot结果显示，高剂量肉苁蓉苷A干预10，20，30和60 min时显著抑制p-JNK蛋白的表达；与阳性对照组相比，肉苁蓉苷A低、中、高剂量组显著抑制Nfatc1和c-Fos蛋白的表达，且呈剂量依赖性；④结果说明，肉苁蓉苷A能够通过降低p-JNK蛋白水平，抑制MAPK通路的激活和破骨细胞关键基因的表达，进而抑制破骨细胞的形成和骨吸收功能。
http://orcid.org/0009-0001-3172-3776(李岳尧)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 肉苁蓉苷A, 破骨细胞, MAPK, JNK, RANKL, RANK, 骨质疏松, 苯乙醇苷

Abstract:
BACKGROUND: Cistanoside A has the effects of anti-inflammation, antioxidation, antioxidation, reducing renal damage and anti-osteoporosis, but its effect on osteoclast differentiation, function and its underlying molecular mechanisms remain unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Cistanoside A on osteoclast differentiation and bone resorption induced by receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) in vitro and its mechanism.
METHODS: Bone marrow macrophages were obtained from the femur and tibia of 4-6-week-old C57BL/6 mice. The cytotoxic effect of Cistanoside A (5, 10, 20, 40, 80, and 160 μmol/L) on bone marrow macrophage viability was examined using the cell counting kit-8 assay kit. Tartrate-resistant acid phosphatase staining was performed to observe the effect of different concentrations of Cistanoside A on osteoblast differentiation and its effective intervention concentration was determined. There was positive control group, Cistanoside A low, medium, and high dose groups (40, 80, and 160 μmol/L). After cell attachment, 50 ng/mL RANKL was added to induce osteoblast differentiation, and the corresponding dose of Cistanoside A was added to the Cistanoside A low, medium, and high dose groups, respectively. F-actin ring and 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride staining were performed to detect the effects of Cistanoside A on the formation of osteoclasts. Toluidine blue staining of bone abrasion slices was used to observe the effects of Cistanoside A on bone resorption function of osteoclasts. The expression of upstream and downstream proteins of the JNK/MAPK pathway was detected by Western blot. The expression of genes related to osteoclast differentiation and bone resorption function such as tartrate-resistant acid phosphatase, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk and c-Fos was detected by RT-qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Tartrate-resistant acid phosphatase staining, F-actin ring staining and resorption pit assay showed that Cistanoside A significantly inhibited RANKL-induced osteoclast differentiation and bone resorption in a dose-dependent manner compared with the positive control group. The results of RT-qPCR showed that compared with the positive control group, both high and low dose groups of Cistanoside A could significantly downregulate the mRNA expression of tartrate-resistant acid phosphatase, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk and c-Fos in a dose‐dependent manner. The results of western blot assay showed that the high dose group of Cistanoside A significantly inhibited the expression of p-JNK protein at 10, 20, 30 and 60 minutes of intervention; compared with the positive control group, Cistanoside A significantly inhibited the expression of Nfatc1 and c-Fos proteins in a dose-dependent manner. To conclude, Cistanoside A could inhibit the formation and bone resorption of osteoclasts by reducing the level of p-JNK protein, inhibiting the activation of MAPK pathway and the expression of key genes in osteoclasts.

Key words: Cistanoside A, osteoclast, MAPK, JNK, RANKL, RANK, osteoporosis, phenylethanoid glycosides

中图分类号:

李岳尧, 张民, 杨家驹. 肉苁蓉苷A通过JNK/MAPK通路抑制破骨细胞活性[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1144-1151.

Li Yueyao, Zhang Min, Yang Jiaju. Cistanoside A mediates p38/MAPK pathway to inhibit osteoclast activity [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(6): 1144-1151.

图/表（结果） 5

2.1 肉苁蓉苷A抑制RANKL诱导的破骨细胞分化 TRAP染色的结果显示，与对照组相比，肉苁蓉苷A浓度为5，10，20，40，80，160 μmol/L时的破骨细胞数量明显减少，且肉苁蓉苷A在浓度为160 μmol/L时对破骨细胞生成的抑制作用最强(图1A，B)。CCK-8细胞毒性实验结果表明，在160 μmol/L浓度以下的肉苁蓉苷A对骨髓巨噬细胞无毒性作用(图1C)。
2.2 肉苁蓉苷A抑制破骨细胞表面肌动蛋白环的形成和破骨细胞骨吸收功能见图2。鬼笔环肽和DAPI荧光染色结果显示，与阳性对照组相比，肉苁蓉苷A低、高剂量组破骨细胞肌动蛋白环面积明显减少，且肉苁蓉苷A高剂量组破骨细胞肌动蛋白环面积小于肉苁蓉苷A低剂量组(图2A，C)。
骨磨片甲苯胺蓝染色结果显示，与阳性对照组相比，肉苁蓉苷A低、高剂量组骨磨片上的骨陷窝面积均显著减小，且肉苁蓉苷A高剂量组的骨陷窝面积小于肉苁蓉苷A低剂量组(图2B，D)。

2.3 肉苁蓉苷A下调破骨细胞关键基因的表达以GAPDH基因的平均表达水平作为对照标准，结果显示与阳性对照组相比肉苁蓉苷A低剂量组能够显著下调破骨细胞调节分化相关基因TRAP、Nfatc-1、DC-STAMP和骨吸收相关基因c-Fos和Ctsk的表达水平(图3)。

2.4 肉苁蓉苷A抑制JNK/MAPK通路下游蛋白的表达 Western blot结果显示，与阳性对照组相比，40，80和160 μmol/L浓度的肉苁蓉苷A能够显著抑制Nfatc-1和c-Fos蛋白的表达量，且这一作用呈剂量依赖性(图4)。

2.5 肉苁蓉苷A抑制p-JNK蛋白的表达 Western blot结果显示，在0，5，10，20，30，60 min的时间梯度中，p-JNK蛋白的表达量呈现先高后低的趋势，并且与阳性对照组相比，160 μmol/L浓度的肉苁蓉苷A能够在干预10，20，30和60 min时显著抑制p-JNK蛋白的表达(P < 0.01，P < 0.000 1)，见图5。

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引言

流行病学研究表明，随着全球人口增长和老龄化进展，骨质疏松和骨性关节炎等溶骨性疾病的发病率将进一步提高[1]。目前研究表明，在溶骨性疾病的发病机制中，破骨细胞功能的过度激活引起的骨吸收和骨重建功能的失衡，会导致骨体积的显著减少、骨密度的降低和骨微结构的有害恶化，进而导致骨脆性增加，加大骨折风
险[2-3]。因此，破骨细胞是鉴定和开发有效治疗骨质疏松症制剂的主要细胞靶标。但目前常用的抑制破骨细胞的药物如地诺单抗(抗RANKL抗体)、双膦酸盐等具有诸如肾毒性、骨坏死、子宫内膜癌风险和颌骨坏死等不良反应[4-5]。
因此寻找新的能够抑制破骨细胞活性的药物具有很高的临床意义。
破骨细胞的分化与骨吸收功能主要受到巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体(receptor
activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)两种信号分子的共同调控[6]。破骨前体细胞膜上的集落刺激因子1受体(c-fms)与巨噬细胞集落刺激因子结合，促进核因子κB受体活化因子(receptor activator of NF-KB，RANK)的表达，RANKL与细胞表面的RANK结合，激活核因子κB、JNK、p38、JNK等转录因子，进而在细胞核内激活转录因子c-Fos、T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，Nfatc-1)等，激活破骨前体细胞形成多核细胞，最终分化为破骨细胞[7-9]。
肉苁蓉是临床最常用的中药材之一，为列当科植物肉苁蓉或管花肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎[10]。传统医学认为肉苁蓉性温，味甘、咸，归肾与大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，用于治疗肾阳不足、精血亏虚导致的阳痿不孕、筋骨无力等疾病，符合传统医学治疗溶骨性疾病采用的补益肝肾的治疗方法。药理学研究表明肉苁蓉的主要活性成分为苯乙醇苷类化合物，具有良好的安全性和广泛的药用功能[11]。肉苁蓉苷A(Cistanoside A，分子式：C36H48O20)是分离提纯自中药肉苁蓉的一种天然苯乙醇苷类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作
用[12-14]。有研究表明肉苁蓉A能够降低乙醇诱导的急性肝损伤小鼠原代细胞中的c-Fos水平[15]。另有研究表明，肉苁蓉苷A可以通过RANKL/TNF受体相关因子6(TRAF6)途径改善去卵巢骨质疏松小鼠的骨小梁结构参数[16]。但肉苁蓉苷A对破骨细胞分化的影响和潜在的分子机制尚缺乏进一步研究，此项研究旨在探究肉苁蓉苷A对体外破骨细胞分化和骨吸收功能的影响及潜在的分子机制，以期寻找新的抑制破骨分化的潜在药物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，进行t检验和单因素方差分析。
1.2 时间及地点 2022年12月至2023年12月在山西医科大学第二医院的骨与软组织损伤修复实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级4周龄C57BL/6小鼠，雌雄不限，购于山西医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK (晋)2019-0004。实验小鼠饲养于标准环境中：室温26 ℃，湿度约 55%，每天光照 12 h，自由活动，自主进食。实验方案获得山西医科大学第二医院实验动物福利伦理委员会批准(批准号：DW2023031)。
1.3.2 试剂与药物肉苁蓉苷A (纯度98%，CAS 93236-42-1)购自上海麦克林生化科技股份有限公司；胎牛血清、高糖α-MEM培养基购自美国HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液0.25%、红细胞裂解液、1×PBS、青链霉素混合液(×100)、甲苯胺蓝染色液(1/100，硼酸盐法)、罗丹明标记鬼笔环肽(货号CA1610)、DAPI染液(即用型)购自北京索莱宝科技有限公司，小鼠重组巨噬细胞集落刺激因子、小鼠重组肿瘤坏死因子配体超家族RANKL购自北京北京泽溪源生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒购自美国MCE公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartarte resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司，RNAiso Plus，Premix型反转录试剂、TB Green® Fast qPCR Mix、Prime Script TM RT Master Mix和Trizol购自美国Takara公司；树突状细胞特异性跨膜蛋白(dendritic cell-specifific transmembrane protein，DC-STAMP)、TRAP、Ctsk、c-Fos、NFATc-1特异性pcr引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；β-actin 抗体、c-Fos抗体、Nfatc-1 抗体、JNK抗体和p-JNK抗体、m-IgG Fc BP-HRP购自美国 Santa Cruz Biotechnology 公司。
1.4 实验方法
1.4.1 药物制备肉苁蓉苷A标准品采用含有1%二甲基亚砜有机溶剂的无菌PBS，按分子质量计算制备成1 600 μmol/L的肉苁蓉苷A溶液，放置于-20 ℃冻存。使用时加入完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素混合液的α-MEM培养基)制备终浓度分别为 5，10，20，40，80，160 µmol/L的含药完全培养基，各组含药培养基在配制过程中均将有机溶剂二甲基亚砜浓度调整为0.1%。
1.4.2 骨髓巨噬细胞的提取与培养用50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉C57BL/6小鼠后，采用颈椎脱臼法处死，体积分数75%乙醇浸泡消毒10 min后移入超净台，用高温高压灭菌后的眼科剪与镊子取下双后肢，剔除皮毛与肌肉组织，剥离出股骨与胫骨，浸泡在PBS中洗去毛发等杂物[17]。剪去骨的两端，用注射器将小鼠的股骨和胫骨中的骨髓细胞冲入10 mm培养皿中，至长骨变为白色为止，用1 mL移液枪吹打均匀后，用100 μm孔径的细胞过滤器过滤，将过滤后的含细胞培养基吸入15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入2 mL红细胞裂解液重悬，插入冰盒中裂解15 min，1 000 r/min再次离心5 min，弃上清，将细胞接种至有含20 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基的T75 培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5% CO2恒温箱中培养过夜，待细胞贴壁后隔天换液，直至细胞融合度达90%后进行细胞传代，取 1-3 代用于实验。
1.4.3 CCK-8法检测药物对细胞活性的影响将骨髓巨噬细胞以7×103/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL完全培养液至细胞完全贴壁后，以3孔为1组，每组分别加入肉苁蓉苷A浓度为0(对照组)、5，10，20，40，80，160 μmol/L的含药和20 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基培养48 h，然后在避光条件下每孔中加入含 10% CCK-8的α-MEM培养基，继续在培养箱中孵育2 h 后取出，采用多功能酶标仪，在 450 nm 波长处检测吸光度值。
1.4.4 破骨细胞的TRAP染色将骨髓巨噬细胞以7×103/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL培养液，分为阳性对照组和药物组，每组设置3个复孔。待细胞贴壁后，阳性对照组和药物组均加入50 ng/mL的RANKL诱导破骨细胞分化，药物组分别加入5，10，20，40，80，160 μmol /L的肉苁蓉苷A，每48 h换液1次，培养5 d至阳性对照组出现成熟破骨细胞。采用无菌PBS清洗各组细胞，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定10 min，每孔加入配置好的TRAP染液50 μL，置于37 ℃恒温箱孵育1.5 h，染色完成后用无菌PBS洗去残余染液，将细胞置于体式显微镜下观察拍照。染色后的破骨细胞呈紫红色，采用mage J软件统计各组成熟破骨细胞(细胞核≥3)的数量，并确定药物的有效干预浓度进行后续实验。
1.4.5 破骨细胞的肌动蛋白环(F-actin环)染色和DAPI染色将骨髓巨噬细胞以7×103/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL培养液，分为阳性对照组、肉苁蓉苷A低剂量组(40 μmol/L)和肉苁蓉苷A高剂量组(160 μmol/L)，每组设置3个复孔。待细胞贴壁后，阳性对照组和肉苁蓉苷A组均加入50 ng/mL的RANKL诱导破骨细胞分化，肉苁蓉苷A低、高剂量组分别加入40 μmol/L或160 μmol/L的肉苁蓉苷A进行干预，每48 h换液，诱导5 d至阳性对照组出现成熟破骨细胞。用无菌PBS清洗细胞，用40 g/L多聚甲醛固定10 min后，每孔加入100 μL 0.1%Triton X-100透化固定后的细胞5 min，在避光条件每孔加入配置好的FITC-鬼笔环肽染液20 μL染色30 min，染色后用无菌PBS洗去残余染液，加入DAPI染液复染30 s，用无菌PBS洗去残余染液后，使用倒置荧光显微镜观察细胞并拍照，采用Image J软件统计破骨细胞(细胞核≥3)肌动蛋白环的面积和数量。
1.4.6 骨吸收实验检验破骨细胞骨吸收能力将骨髓巨噬细胞以7×103/孔的密度接种于提前置入灭菌后的牛骨片的96孔板中，每孔加入100 μL培养液，分为阳性对照组、肉苁蓉苷A低剂量组(40 μmol/L)和肉苁蓉苷A高剂量组(160 μmol/L)，每组设置5个复孔，其中3个复孔置入牛骨片，另外2复孔观察骨髓巨噬细胞的贴壁和破骨细胞的形成情况。待细胞贴壁后，阳性对照组和肉苁蓉苷组均加入50 ng/mL的RANKL诱导破骨细胞分化，肉苁蓉苷A低、高剂量组分别加入40 μmol/L或160 μmol/L的肉苁蓉苷A进行干预，每48 h换液。培养14 d后取出牛骨片，用PBS 洗涤骨片2次，加入70%异丙醇高功率超声清洗15 min洗去残余细胞，加入甲苯胺蓝(1%，溶于水中)染液室温染色2 min后用双蒸水冲洗骨片清除残留染液。采用体式显微镜观察染色后的骨片并拍照，采用Image J软件统计骨吸收陷窝的面积。
1.4.7 RT-PCR检测细胞内骨吸收功能和破骨相关基因的表达将骨髓巨噬细胞以1.5×105/孔接种于6孔板中，每孔加入100 μL培养液，分为阳性对照组、肉苁蓉苷A低剂量组(40 μmol/L)和肉苁蓉苷A高剂量组(160 μmol/L)，阳性对照组和肉苁蓉苷组均加入50 ng/mL的RANKL诱导破骨细胞分化，肉苁蓉苷A低、高剂量组分别加入40 μmol/L或160 μmol/L的肉苁蓉苷A进行干预，每48 h换液，在诱导三四天时于倒置显微镜下进行观察，在镜下观察到骨髓巨噬细胞刚出现融合。加入TRIzol 裂解细胞，加入氯仿，置于冰上静置裂解10 min，将混合液吸入1.5 mL EP管中，每管加入200 μL氯仿，振荡15 s后在冰上静置15 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min后取上清液，加入等量异丙酮，在冰上静置10 min，弃上清后4 ℃下120 000 r/min离心，用无菌无酶水配置的体积分数75%乙醇溶液洗涤后，晾干即获得总RNA。采用Prime ScriptTM RT Master mix 反转录试剂盒配置20 μL体系进行反转录合成cDNA后，根据试剂盒说明书配置PCR工作体系，在荧光定量PCR仪中进行检测。PCR反应条件为：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 10 s，退火及延伸60 ℃ 30 s，共计40个循环。引物序见表1。

1.4.8 Western blot法检测RANKL通路相关蛋白的表达 ①长效蛋白的提取：骨髓巨噬细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板中，分为阳性对照组、肉苁蓉苷A低剂量组(40 μmol/L)、肉苁蓉苷A中剂量组(80 μmol/L)和肉苁蓉苷A高剂量组(160 μmol/L)。细胞贴壁后阳性对照组和肉苁蓉苷A组均加入50 ng/mL的RANKL诱导破骨细胞分化，肉苁蓉苷A低、中、高剂量组分别加入40，80，160 μmol/L的肉苁蓉苷A进行干预，每48 h换液，诱导5 d后，提取蛋白用来检测 c-Fos、NFATc-1等长效蛋白的表达。②短效蛋白的提取：骨髓巨噬细胞以1.2×104/孔的密度接种于6孔板中，分为阳性对照组和肉苁蓉苷A组。待细胞接近融合时，阳性对照组和肉苁蓉苷A组都加入单纯α-MEM培养基饥饿 3 h，肉苁蓉苷A组同时加入160 μmol/L的肉苁蓉苷A进行干预。饥饿结束后各组均加入100 ng/mL RANKL进行刺激，刺激时间分别为 0，10，20，30，60 min，刺激时间完成后，弃掉培养基，预冷的 1×PBS 洗涤 3 次，提取蛋白用来检测p-JNK、JNK及 β-actin 蛋白的表达。
蛋白提取完成后，采用凝胶电泳分离蛋白后转膜至PVDF膜上，加入5%牛血清白蛋白(BSA)4 ℃封闭1 h，弃封闭液，TBST缓冲液洗膜3次，加入一抗(Nfatc-1抗体1∶1 000，c-Fos抗体1∶1 000，p-JNK抗体1∶1 000，JNK抗体1∶1 000，β-actin抗体1∶1 000)，4 ℃孵育14-16 h，TBST缓冲液洗膜3次，加入二抗(m-IgG Fc BP-HRP，稀释比例1∶5 000)，常温孵育2 h，洗膜后加入荧光液在凝胶成像系统下显影，Image Lab 软件对所得条带灰度值进行分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①肉苁蓉苷A干预后RANKL诱导的破骨细胞分化结果；②肉苁蓉苷A干预后破骨细胞表面肌动蛋白环的形成和破骨细胞骨吸收功能变化；③肉苁蓉苷A干预后破骨细胞关键基因的表达；④肉苁蓉苷A干预后JNK/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路下游蛋白及p-JNK蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析和绘图，所有数据用x±s表示，选择t检验和单因素方差分析进行组间比较。P < 0.05被定义为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经由山西医科大学统计学专家审核。

讨论

骨质疏松是一类多发于老年女性，以骨量下降、骨微结构损坏导致骨骼脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病[18]。骨是一个保持动态平衡的器官，成人骨骼的骨重塑有助于去除和替换受损和老化的骨骼，以保持骨骼质量[19]。在重塑过程中，骨的结构和功能的维持依靠成骨细胞介导的骨形成作用和破骨细胞介导的骨吸收作用的平衡[20]。破骨细胞是一类来源于骨髓造血细胞系的多核细胞，是唯一具有吸收骨基质的能力的细胞[21]。破骨细胞的过度产生或活化会导致骨吸收功能的异常，进而导致骨皮质变薄，骨松质中骨小梁减少变细，增加骨质疏松等疾病的发病风险[22]。基于破骨细胞活化在溶骨性疾病中发挥的重要作用，目前临床上已运用抗破骨细胞的药物来治疗溶骨性疾病。临床最常用的破骨细胞抑制剂为双膦酸盐类药物，虽然其疗效显著且已经广泛应用，但研究表明该药可以引起以发热、肌肉骨骼疼痛、头痛和胃肠道反应为主要症状的急性期反应，长期使用可能导致药物相关性颌骨坏死[23-24]。地诺单抗已经有研究证实具有治疗溶骨性疾病的临床效果，但是停药后有骨量减少及椎体骨折等不良作用[25-26]。而肉苁蓉苷A作为一种天然的苯乙醇苷类物质，有研究表明其对小鼠的正常生长发育无明显毒性[27]，且能够显著改善去卵巢骨质疏松小鼠的骨流失情况[15]。为进一步探究肉苁蓉苷A是否通过JNK/MAPK信号通路抑制破骨细胞分化和骨吸收功能，进而起到治疗骨质疏松的作用，此次研究通过体外细胞实验，探究肉苁蓉苷A对破骨细胞分化及功能的影响和相应分子生物学机制。
破骨细胞由骨髓单核细胞/巨噬细胞祖细胞分化而来，因此，此次研究选用提取流程和效果都相对成熟的，从小鼠股骨和胫骨中提取的小鼠骨髓巨噬细胞作为诱导破骨细胞分化的前体细胞[28-29]。TRAP一直被认为是破骨细胞的组织化学标记物，成熟的破骨细胞具有TRAP活性，能被TRAP 染液染成红色或粉红色，而其前体细胞则几乎不会被染色[30]。因此，此次研究采用TRAP染色鉴定干预后破骨细胞和数量。破骨细胞骨吸收的过程中会进行极化，其肌动蛋白骨架重组后会在密封区形成肌动蛋白环，进而将破骨细胞锚定到骨基质上，隔离骨吸收区域和胞外微环境空间，因此，鬼笔环肽染色的肌动蛋白环的数量和面积可以体现破骨细胞的形成情况和骨吸收功能[31-32]。此次研究加入巨噬细胞集落刺激因子和RANKL诱导骨髓巨噬细胞分化，并同时加入肉苁蓉苷A进行干预。TRAP染色的结果显示，加入肉苁蓉苷A进行干预后，成熟破骨细胞数量减少，同时单个破骨细胞的体积减少，细胞中核体积所占比例增加，破骨细胞的分化受到明显抑制，且这种抑制作用呈剂量依赖性。鬼笔环肽染色和骨吸收实验的结果显示，用肉苁蓉苷A干预处理后，破骨细胞的肌动蛋白环的平均大小和数量均明显减少，且在牛骨片上造成的骨吸收陷窝的数量和面积也明显降低。上述结果说明肉苁蓉苷A在体外条件下确实可以抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能，但其详细的作用机制还并不明确，因此，进一步进行RT-qPCR和Western Blot 实验以对分子生物学机制进行研究。
破骨细胞的形成和功能的正常发挥主要受到RANK/RANKL通路的调节，其中JNK/MAPK通路作为RANKL通路的一个分支途径，对于维持破骨细胞的存活具有重要作用[33-34]。细胞表面的RANK与RANKL因子结合后，通过双特异性MAPK磷酸酶(MKP)、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和酪氨酸磷酸酶等磷酸酶将JNK蛋白的苏氨酸或酪氨酸残基的去磷酸化将其活化为p-JNK蛋白，进而上调下游c-Fos、Nfatc-1和Ctsk等基因的转录[35]。c-Fos是激活蛋白1(AP-1)转录因子家族的成员，参与破骨前体细胞分化为破骨细胞的过程[36]。NFATc-1则是RANKL介导的破骨细胞分化的主要执行者，通过与c-Fos的协同作用调节破骨细胞骨吸收相关基因的达[37-38]。Ctsk基因是破骨细胞骨吸收功能的关键基因，其表达产物主要降解有机骨机质，有研究表明敲除Ctsk基因可导致小鼠的骨吸收功能障碍引起骨石化症 [39]。DC-STAMP则在破骨前体细胞的融合过程中发挥着重要作用[40]。JIANG等[41]的研究表明，苯乙醇苷类能够通过阻止NFATc-1易位、下调NFATc-1表达和影响PI3K/Akt/c-Fos通路以抑制破骨细胞的形成骨吸收功能。LUO等[15]的研究也表明，肉苁蓉苷A能够下调小鼠急性酒精损伤后肝细胞RANKL通路下游基因c-Fos水平。这与此次研究的RT-qPCR和Western Blot实验结果所显示的肉苁蓉苷A干预能够显著降低经过诱导后破骨前体细胞的c-Fos、Nfatc-1、TRAP、Ctsk和DC-STAMP基因的mRNA的表达水平及Nfatc-1和c-Fos蛋白的表达水平相印证，提示肉苁蓉苷A能够通过抑制JNK蛋白的磷酸化，降低JNK/MAPK下游c-Fos、Nfatc-1等因子的表达，进而降低Ctsk、DC-STAMP和TRAP等骨吸收基因的表达，最终抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能。
综上所述，此次研究证实肉苁蓉苷A能够通过抑制JNK/MAPK通路，降低下游mRNA的表达，进而抑制体外破骨细胞的分化和骨吸收功能。然而研究为体外细胞实验，实验条件和刺激因素相对单一，未能验证肉苁蓉苷A在体内复杂的生理环境下对破骨细胞及其骨吸收功能的影响，今后应进一步查阅相关文献，设计动物实验验证肉苁蓉苷A在体内实验中对破骨细胞的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

肉苁蓉苷A通过JNK/MAPK通路抑制破骨细胞活性

Cistanoside A mediates p38/MAPK pathway to inhibit osteoclast activity

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