载富血小板血浆水凝胶对L929细胞氧化损伤的保护作用

doi:10.12307/2025.215

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (4): 771-779.doi: 10.12307/2025.215

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载富血小板血浆水凝胶对L929细胞氧化损伤的保护作用

王自林1，牟秋菊2，刘宏杰1，申玉雪1，祝丽丽1，2

1贵州医科大学医学检验学院临床检验基础与血液学检验教研室，贵州省贵阳市 550000；2贵州医科大学附属医院输血科，贵州省贵阳市 550000

收稿日期:2023-11-28 接受日期:2024-01-16 出版日期:2025-02-08 发布日期:2024-05-31
通讯作者: 祝丽丽，主任技师，贵州医科大学医学检验学院临床检验基础与血液学检验教研室，贵州省贵阳市 550000；贵州医科大学附属医院输血科，贵州省贵阳市 550000
作者简介:王自林，男，1996年生，四川省泸州市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，初级技师，主要从事临床输血研究。
基金资助:
贵州医科大学附属医院高层次人才项目(gyfygcc-2023-03)，项目负责人：祝丽丽

Protective effects of platelet-rich plasma hydrogel on oxidative damage in L929 cells

Wang Zilin1, Mu Qiuju2, Liu Hongjie1, Shen Yuxue1, Zhu Lili1, 2

1Teaching and Research Department of Clinical Laboratory Fundamentals and Hematology, School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China; 2Department of Blood Transfusion, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China

Received:2023-11-28 Accepted:2024-01-16 Online:2025-02-08 Published:2024-05-31
Contact: Zhu Lili, Senior technologist, Teaching and Research Department of Clinical Laboratory Fundamentals and Hematology, School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China; Department of Blood Transfusion, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China
About author:Wang Zilin, Master candidate, Junior technologist, Teaching and Research Department of Clinical Laboratory Fundamentals and Hematology, School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China
Supported by:
High-Level Talent Project of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, No, gyfygcc-2023-03 (to ZLL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
富血小板血浆：是通过离心方法从全血中分离出来的富含高浓度血小板的血浆，为血小板浓缩物，富含大量生长因子，既可对创面的止凝血、修复及抗感染发挥作用，又对细胞增殖、血管生成等具有促进作用。
氧化硫酸软骨素：是通过将硫酸软骨素(一种存在于软骨细胞外基质中的多糖，具有生物相容性和可降解性)暴露于高碘酸钠下进行氧化处理后得到的产品，不仅保留了硫酸软骨素的生物相容性，同时也增强了其生物活性。
背景：在慢性创面愈合过程中，活性氧的过量生成可能会损害L929成纤维细胞的功能，从而延缓创面修复，因此保护成纤维细胞免受氧化应激的影响对于促进创面愈合非常重要。
目的：评估羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素/富血小板血浆(CMC-OCS/PRP)水凝胶对H2O2刺激下L929细胞的保护作用。
方法：制备CMC-OCS/PRP水凝胶，表征水凝胶的微观形貌、降解性能、清除H2O2与羟基自由基的能力及生物相容性。取生长状态良好的L929细胞，分5组培养：对照组常规培养，H2O2组加入H2O2，CMC-OCS组加入羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶浸提液+H2O2，PRP组加入富血小板血浆凝胶浸提液+H2O2，CMC-OCS/PRP组加入羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素/富血小板血浆水凝胶浸提液处理+H2O2，每组先加入水凝胶浸提液处理6 h，然后再加入H2O2处理24 h。培养结束后，检测细胞活性氧及丙二醛水平，细胞凋亡、胶原纤维Ⅰ蛋白表达。在加入H2O2的情况下，将上述水凝胶浸提液分别与L929成纤维细胞直接或间接共培养36 h，通过划痕实验、Transwell小室实验检测细胞的迁移能力。
结果与结论：①CMC-OCS/PRP水凝胶具有均匀相互关联的多孔结构及良好的降解能力，体外可有效清除H2O2与羟基自由基，并且具有良好的生物相容性；②与对照组比较，H2O2组细胞凋亡率、细胞活性氧与丙二醛水平升高(P < 0.05)，细胞铺展面积减少(P < 0.05)，胶原纤维Ⅰ蛋白表达无明显变化(P > 0.05)；与H2O2组比较，CMC-OCS组、CMC-OCS/PRP组细胞活性氧水平降低(P < 0.05)，PRP组、CMC-OCS组、CMC-OCS/PRP组丙二醛水平降低(P < 0.05)、细胞铺展面积增加(P < 0.05)，CMC-OCS/PRP组细胞凋亡率降低(P < 0.05)，PRP组、CMC-OCS组、CMC-OCS/PRP组胶原纤维Ⅰ蛋白表达增加(P < 0.05)；③与对照组比较，H2O2组细胞迁移数量减少(P < 0.05)，迁移面积无明显变化(P > 0.05)；与H2O2组比较，PRP组、CMC-OCS组、CMC-OCS/PRP组细胞迁移数量、迁移面积均增加(P < 0.05)，并且以CMC-OCS/PRP组增加最显著；④在氧化应激条件下，CMC-OCS/PRP水凝胶可改善成纤维细胞的迁移能力，抗细胞凋亡并保护细胞伸展功能。

https://orcid.org/0009-0003-3251-2705(王自林)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 富血小板血浆, 羧甲基壳聚糖, 氧化硫酸软骨素, 水凝胶, L929细胞, 抗氧化

Abstract: BACKGROUND: During healing process of chronic wounds, excessive production of reactive oxygen species can impair the function of L929 fibroblasts, thereby delaying wound repair. Therefore, protecting fibroblasts from oxidative stress is important to promote wound healing.
OBJECTIVE: To assess the protective effects of carboxymethyl chitosan-oxidized chondroitin sulfate/platelet-rich plasma (CMC-OCS/PRP) hydrogel on L929 cells under H2O2 stimulation.
METHODS: CMC-OCS/PRP hydrogels were prepared, and the micromorphology, degradation performance, scavenging ability of H2O2 and hydroxyl radical and biocompatibility of the hydrogels were characterized. L929 cells with good growth state were taken and cultured in five groups. The control group was cultured conventionally. H2O2 was added to the H2O2 group. Carboxymethyl chitosan-oxidized chondroitin sulfate hydrogel extract + H2O2 was added to the CMC-OCS group. Platelet-rich plasma gel extract + H2O2 was added to the PRP group. The CMC-OCS/PRP group was treated with carboxymethyl chitosan-oxidized chondroitin sulfate/platelet-rich plasma hydrogel extract + H2O2. Each group was treated with hydrogel extract for 6 hours, and then H2O2 for 24 hours. After culture, the levels of active oxygen and malondialdehyde, apoptosis and expression of collagen fiber I protein were detected. In the presence of H2O2, the above hydrogel extracts were directly or indirectly co-cultured with L929 fibroblasts for 36 hours, respectively. Migration ability of the cells was detected by scratch test and Transwell chamber test.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CMC-OCS/PRP hydrogels had uniform and interrelated porous structure and good degradation ability, could effectively remove H2O2 and hydroxyl radicals in vitro, and had good biocompatibility. (2) Compared with the control group, the apoptosis rate, reactive oxygen species, and malondialdehyde levels were increased (P < 0.05); the spread area of cells was decreased (P < 0.05), and the expression of collagen fiber I protein had no significant changes (P > 0.05) in the H2O2 group. Compared with the H2O2 group, reactive oxygen species level was decreased in the CMC-OCS group (P < 0.05), malondialdehyde level was decreased (P < 0.05), and cell spread area was increased (P <0.05) in the PRP group, CMC-OCS group, and CMC-OCS/PRP group; apoptosis rate was decreased in the CMC-OCS/PRP group (P < 0.05), and collagen fiber I protein expression was increased in the PRP group, CMC-OCS group, and CMC-OCS/PRP group (P < 0.05). (3) Compared with the control group, the number of cell migration was decreased (P < 0.05), and the migration area had no significant change (P > 0.05) in the H2O2 group. Compared with the H2O2 group, the number and area of cell migration were increased in the PRP group, CMC-OCS group, and CMC-OCS/PRP group (P < 0.05), and the increase was most significant in the CMC-OCS/PRP group. (4) Under oxidative stress, CMC-OCS/PRP hydrogel can improve the migration ability of fibroblasts, resist cell apoptosis, and preserve cell extension function.

Key words: platelet-rich plasma, carboxymethyl chitosan, oxidized chondroitin sulfate, hydrogel, L929 cell, antioxidation

中图分类号:

王自林, 牟秋菊, 刘宏杰, 申玉雪, 祝丽丽. 载富血小板血浆水凝胶对L929细胞氧化损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 771-779.

Wang Zilin, Mu Qiuju, Liu Hongjie, Shen Yuxue, Zhu Lili. Protective effects of platelet-rich plasma hydrogel on oxidative damage in L929 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(4): 771-779.

图/表（结果） 7

2.1 水凝胶的结构与降解性能表征通过宏观图片观察了水凝胶的结构(图1A)，其中CMC-OCS及CMC-OCS/PRP能很好地形成水凝胶，当小瓶倒置时仍然可以保持稳定的形状。在红外光谱中(图1B)，相对于硫酸软骨素，OCS在1 735 cm处出现了一个特征峰。此外，利用盐酸羟胺滴定法测定了OCS氧化程度，从微分曲线得到消耗的NaOH体积为5.6 mL(图1C)，计算得到醛基浓度为5.6×
10-3 mol/g，醛基氧化程度为51.90%。扫描电镜下可见CMC-OCS及CMC-OCS/PRP水凝胶都具有均匀的、相互关联的多孔结构，PRP的引入进一步提高了OCS和PRP之间的交联密度，在加入PRP后CMC-OCS水凝胶的孔隙减小，使水凝胶内部结构更加紧凑(图1D)，CMC-OCS/PRP水凝胶在前7 d降解较快，第10天之后趋于平稳，14 d时降解率为71.25%(图1E)。

2.2 水凝胶体外清除H2O2及·OH的能力实验通过分析CMC-OCS和CMC-OCS/PRP水凝胶在特定波长下的吸光度，评估了其对H2O2和·OH的清除能力。吸光度值的降低反映水凝胶清除活性氧物种的能力增强。
对于H2O2的清除能力，在0-60 min时间内，CMC-OCS/PRP组相较于CMC-OCS组表现出更低的吸光度值；特别是在30-60 min时间内，CMC-OCS/PRP组吸光度值降低更为显著，这表明PRP的加入显著提高了CMC-OCS对H2O2的清除效果(图2A，B)。
对·OH的清除能力，在20-80 min时间内，CMC-OCS/PRP组吸光度值相较于CMC-OCS组降低明显，表现了更强的·OH清除活性；特别是在40-80 min时间内，CMC-OCS/PRP组吸光度值降低显著(图2C，D)，这可能与PRP中含有的天然抗氧化成分通过清除自由基来保护细胞免受活性氧诱导的损伤有关。

2.3 水凝胶的生物相容性活/死细胞染色法观察L929细胞活性，各组均未引起明显的细胞死亡，即使在长时间的培养条件下，PRP组、CMC-OCS组及CMC-OCS组的细胞仍然呈现出良好的细胞形态和活力(图3A，B)。此外，CCK-8细胞活力检测显示，与对照组相比，PRP组、CMC-OCS组及CMC-OCS/PRP组细胞活力明显上升，尤其在第72小时，CMC-OCS/PRP组细胞活力明显大于其他组(图3C)。进一步证实CMC-OCS/PRP水凝胶对L929细胞生长和分化具有良好支持作用。
2.4 水凝胶对H2O2诱导成纤维细胞氧化应激的影响通过测定各组的活性氧和丙二醛水平能够详细了解PRP凝胶、CMC-OCS水凝胶及CMC-OCS/PRP水凝胶的抗氧化作用。

活性氧水平检测：与对照组比较，H2O2组活性氧水平显著增加，达到了对照组的6倍左右(P < 0.000 1)；与H2O2组比较，CMC-OCS组、CMC-OCS/PRP组活性氧水平显著降低(P < 0.01，P < 0.000 1)，其中CMC-OCS/PRP组降低幅度最大，与其他组相比差异均有显著性意义(P < 0.05，P < 0.001，P < 0.000 1)，暗示其具有强大的抗氧化潜力，CMC-OCS组抗氧化作用较PRP组强，这可能与CMC的羧甲基化结构有关(图4A，B)。
丙二醛水平检测：与对照组比较，H2O2组丙二醛水平升高(P < 0.000 1)；与H2O2组比较，CMC-OCS/PRP组丙二醛水平降低(P < 0.01)；PRP组、CMC-OCS组、CMC-OCS/PRP组丙二醛水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但CMC-OCS/PRP组丙二醛水平最低(图4C)，变化趋势与活性氧水平相一致，进一步凸显了CMC-OCS/PRP水凝胶在减缓氧化应激方面的重要作用。

2.5 水凝胶凝胶对H2O2诱导成纤维细胞凋亡的影响凋亡是细胞生物学中的一个复杂过程，涉及多种信号转导途径。这种有序的细胞死亡机制在细胞的生长、发育和正常功能中都起到关键作用[21]。流式细胞术检测结果表明，对照组细胞凋亡率平均值约为4.41%，H2O2组细胞凋亡率平均值较对照组显著升高(P < 0.01)，约为6.51%；CMC-OCS组、PRP组和CMC-OCS/PRP组细胞凋亡率平均值分别约为5.20%，5.99%和4.93%，CMC-OCS/PRP组细胞凋亡率低于H2O2组(P < 0.05)，显示出较好的抗凋亡效果，PRP组、CMC-OCS组细胞凋亡率平均值与H2O2组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.6 水凝胶对H2O2诱导成纤维细胞形态和胶原纤维Ⅰ表达的影响在H2O2诱导的氧化应激条件下，胶原纤维Ⅰ显著减少，但与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)，同时观察到细胞形态由正常的纤维状变为圆形，细胞铺展面积明显减小，这可能是由于细胞骨架F-actin的重组；相比之下，CMC-OCS组、PRP组和CMC-OCS/PRP组细胞显示出较为扩展的形态，特别是CMC-OCS/PRP组细胞扩展面积最大，同时胶原纤维Ⅰ也增加最明显，但CMC-OCS组、PRP组和CMC-OCS/PRP组胶原纤维Ⅰ表达及细胞铺展面积比较差异无显著性意义(P >0.05)，见图6，这表明了协同效应可能促进了细胞骨架的稳定性和细胞的迁移能力。

2.7 水凝胶对H2O2诱导成纤维细胞迁移能力的影响细胞迁移是许多生物学过程的关键环节，尤其在组织修复和再生中起着关键的作用[22-23]。通过划痕愈合实验和Transwell小室实验结果显示，H2O2处理明显抑制了成纤维细胞的迁移能力，这可能是由于氧化应激对细胞骨架和细胞黏附能力的不利影响；然而，所有处理组，特别是PRP组和CMC-OCS/PRP组，不仅克服了H2O2诱导的迁移能力下降，而且迁移率和面积均超过了对照组，PRP中丰富的生长因子可能促进了细胞的迁移，这一点在CMC-OCS/PRP组中表现得尤为明显，见图7，表明这种复合材料可能为细胞提供了更有利的微环境，以促进其迁移和再生。

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引言

氧化应激是创伤愈合过程中的一个关键影响因素，过量的活性氧可能对细胞和组织造成损害，从而干扰正常的创伤愈合过程[1-2]。L929细胞作为一种成纤维样细胞株常用于研究创面愈合过程，成纤维细胞迁移是填补创面的首要步骤，成纤维细胞增殖则有助于快速补充损伤区域所需的细胞数量；此外，L929细胞在新细胞外基质的形成中起着至关重要作用[3-5]。因此，保护成纤维细胞免受氧化应激影响对于促进创面愈合非常重要。
硫酸软骨素是一种自然存在的硫酸化糖胺聚糖类多糖，广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面。壳聚糖具有多重生物功能，包括促进软骨生长、调控生长因子和加速创面愈合[6]。当壳聚糖在高碘酸钠(NaIO4)环境下被氧化处理时会产生氧化硫酸软骨素(oxidized chondroitin sulfate，OCS)，OCS不仅保持了壳聚糖的生物相容性，还具有更强的抗氧化性能。引入的活性醛基使OCS成为一种有效的生物交联剂[7-9]。羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMC)是一种在医学领域广泛应用的物质，因其分子结构中吡喃糖环的C-2、C-3和C-6位置上连接了氨基和羟基，可从自由基中轻松提取氢原子，因此具有显著的抗氧化和抗菌特性[10-14]。将CMC与OCS结合，OCS中的双醛基官能团可以与CMC中含有的游离氨基发生化学交联反应，从而不仅提高了OCS的稳定性，而且增强了其抗氧化效果[11]。CMC-OCS水凝胶具有高生物相容性、多孔结构和可调节的弹性形状，在药物载体和细胞支架等生物医学领域得到了广泛应用。FAN 等[11，15]制备了CMC-OCS水凝胶，并且将负载牛血清蛋白的壳聚糖基微球嵌入其中，该复合水凝胶显示出在软骨组织工程中用于注射给药的潜力。富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)是通过离心方法从全血中分离出的富含高浓度血小板的血浆，血小板在激活后释放多种生长因子、黏附分子和趋化因子，有助于清除体内自由基，防止氧化应激[16-18]。
基于以上，此次实验合成了具有多重抗氧化性能的CMC-OCS/PRP水凝胶，并且在体外模拟氧化应激环境，探索该水凝胶对L929细胞的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验观察，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年7月至2023年8月在贵州医科大学临床检验诊断学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物实验使用了35-41 d龄雄性SD大鼠，总共8只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物使用许可证号为SCXK(粤)2022-0063。实验方案已获得贵州医科大学伦理委员会的批准，批准号：SYXK (贵)2023-0002。实验严格遵守了相关的伦理指南和法规，确保了动物福利和实验的科学性。
1.3.2 细胞、试剂与仪器硫酸软骨素、CMC、二甘醇、乙二醇和高碘酸钠(麦克林生化科技有限公司)；葡萄糖酸钙(济南华润双鹤药业公司)；成纤维细胞系L929(中乔新舟生物科技有限公司)；细胞计数试剂盒(北京博奥森生物科技有限公司，BA00208)；鬼笔环肽试剂盒(Servicebio，G1028)；细胞凋亡试剂盒(七海生物，A005-3)；活性氧检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，CA1410)；Transwell小室、1%结晶紫(北京索莱宝科技有限公司)；丙二醛检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，S0131S)；胎牛血清(以色列BI公司)；活/死细胞染色试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司，KGA9501-1000)；PBS、青-链霉素、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；无血清细胞冻存液(苏州新赛美生物科技有限公司)；6/24/12/96孔板(无锡耐思生命科技有限公司)；冷冻干燥机(德国Christ)；扫描电镜(JSM-7500F，JEOL，日本)；酶标仪(美国Thermo)；全自动血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司)；倒置显微镜尼康公司；流式细胞仪(美国BD公司)；紫外-可见光谱仪(Shimadzu，UV-2600，日本)；傅里叶变化红外光谱仪(Nicolet 6700，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 OCS的合成与表征在30 ℃下将5 g硫酸软骨素溶于100 mL蒸馏水中，待溶解完全后向其中加入3.3 g NaIO4避光反应8 h，加入5 mL乙二醇，将混合物避光条件下搅拌0.5 h，将产物用蒸馏水透析3 d，即得OCS，在-30 ℃冷冻干燥并储存在4 ℃下，直到再次使用。
OCS氧化程度及结构表征：利用盐酸羟胺滴定法测OCS氧化程度。配制0.25 mol/L的盐酸羟胺溶液，加入适量甲基橙溶液以染色；取0.1 g冻干OCS加入25 mL盐酸羟胺-甲基橙溶液中，得到均匀透明粉色溶液；配制0.1 mol/L的NaOH溶液，以它为滴定剂，通过电位滴定法测定释放的HCl量，记录NaOH消耗体积及相应pH值，直至溶液变为黄色(pH值≈5.0)，根据消耗的NaOH量来计算醛基浓度，由醛基浓度计算氧化程度。使用傅里叶红外光谱仪获得了硫酸软骨素、OCS的特征吸收峰。
1.4.2 水凝胶的制备将30 mg/mL的CMC溶液和30 mg/mL的OCS溶液，将两种溶液按体积比1∶1混合，搅拌充分后静置，即可得到CMC-OCS水凝胶。
用枸橼酸钠抗凝管采集SD大鼠全血，在4 ℃条件下500×g离心10 min，弃上清，收集血浆层和血小板层，室温下再以1 200×g离心15 min，取下层1/4血浆层、白膜层和1.0-2.0 mm红细胞层，即为PRP，置于-80 ℃储存，无需添加其他成分。先将PRP与CMC溶液(30 mg/mL)混合，然后加入含有钙离子的OCS溶液(30 mg/mL)，PRP、CMC溶液及OCS溶液的体积比1∶1∶1，制得CMC-OCS/PRP水凝胶[19]。室温下将PRP和葡萄糖酸钙溶液按10∶1的体积比混合，即可制得PRP凝胶。
1.4.3 水凝胶的表征
微观形貌：取冷冻干燥后的CMC-OCS水凝胶、CMC-OCS/PRP水凝胶，使用刀片将水凝胶样品切开，暴露出横截面，喷金后通过扫描电子显微镜观察水凝胶的孔隙结构。
体外降解性能：在 5 mL玻璃瓶中加入0.9 mL的CMC-OCS/PRP水凝胶，然后加入预热的PBS(37 ℃)，将玻璃瓶置于 37 ℃恒温恒湿培养箱中，每隔1 d除去PBS并称水凝胶质量。实验重复3次。水凝胶降解速率=(m0-mt)/m0×100%，其中，mt为降解一段时间后水凝胶的剩余质量，m0为水凝胶的初始质量。体外清除H2O2和羟基自由基(·OH)的能力：将10 mL的H2O2(1 mmol/L)分别与500 mg的CMC-OCS/PRP
(或CMC-OCS)水凝胶混合，在37 ℃下静置孵育，在设置的时间点下，取50 μL上清液与100 μL钛硫酸溶液混合，测量405 nm处的吸光度值，评估水凝胶清除H2O2的能力。将FeSO4(0.2 mmol/L)1 mL、H2O2(0.2 mmol/L)1 mL与500 mg CMC-OCS/PRP(或CMC-OCS)水凝胶混合，在37 ℃下静置孵育，在设置的时间点下，取1 mL混合溶液加入到1 mL的水杨酸溶液(1 mmol/L)中，检测510 nm处的吸光度值，评估水凝胶清除•OH的能力。
水凝胶的生物相容性：①制备水凝胶浸提液：将CMC与OCS材料在超净工作台紫外线照射1 h，进行灭菌处理，制备对应的水凝胶。将CMC-OCS水凝胶、PRP凝胶、CMC-OCS/PRP水凝胶分别浸入RPMI-1640培养基中，其中水凝胶的体积分数为3%，放入4 ℃冰箱中 24 h；取出样品，3 000 r/min离心15 min，取上清，即得水凝胶浸提液。②L929细胞增殖实验：选取生长状态良好的L929 细胞，以2×103/孔的密度接种到96孔板中，培养24 h后吸弃原培养基，实验组分别加入100 μL的CMC-OCS水凝胶、PRP凝胶、CMC-OCS/PRP水凝胶浸提液，对照组加入100 μL 无血清培养基。培养24，48，72 h后，加入CCK-8 试剂，检测450 m 处吸光度值。③L929细胞活/死染色实验：选取生长状态良好的L929细胞，以3×104/孔的密度接种到24孔板中，培养24 h后吸弃原培养基，实验组分别加入600 μL的CMC-OCS水凝胶、PRP凝胶、CMC-OCS/PRP水凝胶浸提液，对照组加入600 μL无血清培养基。培养72 h后吸弃原培养基，加入600 μL含有Calcein-AM(5 μg/mL)和PI(8 g/mL)的染料稀液孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况，其中呈现绿色荧光的是被Calcein-AM 染色的活细胞，呈现红色荧光的则是被PI染色的死细胞。
1.4.4 水凝胶对氧化应激条件下L929细胞活性氧与丙二醛水平的影响将L929细胞以3×104/孔的密度接种于24孔板内，待细胞融合至70%左右，分5组培养：对照组更换为600 μL无血清培养基培养24 h，H2O2组更换为含100 μmol/L H2O2的无血清培养基600 μL处理24 h[20]，CMC-OCS组、PRP组、CMC-OCS/PRP组分别加入600 μL对应的水凝胶浸提液预处理6 h，然后再加入100 μmol/L H2O2处理24 h。培养结束后吸弃原培养基，每孔加入600 μL DCFH-DA试剂室温避光孵育20 min，用PBS洗涤3次，荧光显微镜下拍照分析，评估活性氧水平；采用脂质氧化丙二醛检测试剂盒检测丙二醛水平。
1.4.5 水凝胶对氧化应激条件下L929细胞凋亡的影响将L929细胞以3×104/孔的密度接种于24孔板内，待细胞融合至70%左右，实验分组与处理同1.4.4。培养结束后，根据凋亡检测试剂盒说明书，收集细胞，用冷PBS洗涤2次，将FITC-Annexin(10 μL)和PI(5 μL)分别加入300 μL细胞悬液中室温避光孵育15，5 min，使用流式细胞仪进行分析。
1.4.6 水凝胶对氧化应激条件下L929细胞胶原纤维Ⅰ表达的影响将L929细胞以8×104/孔的密度接种于12孔板内，待细胞融合至70%左右，实验分组与处理同1.4.4，其中水凝胶浸提液与培养基的体积均为1 mL。培养结束后，使用体积分数4%甲醛固定20 min，以PBS洗涤细胞，使用0.1%Triton X-100处理细胞膜，使抗体和染料能够进入细胞内部结构，洗涤细胞，加入山羊血清室温封闭1 h，加入一抗胶原纤维Ⅰ4 ℃过夜，以PBS洗涤细胞；滴加相应二抗(CY3山羊抗兔/鬼笔488)室温孵育1 h，以PBS洗涤细胞；加入50 μL鬼笔环肽工作液室温孵育2 h，以PBS洗涤细胞；滴加DAPI染液避光室温孵育10 min，封固，荧光显微镜下拍照分析。
1.4.7 水凝胶对氧化应激条件下L929细胞迁移能力的影响
划痕实验：将生长状态良好的L929细胞接种于12 孔板，细胞密度8×104/孔。待细胞融合成单层后，加入1 mL无血清 RPMI-1640培养基饥饿处理 24 h，用 200 μL枪头垂直于12孔板制造细胞划痕，用 PBS 洗涤以除去划痕周围的细胞碎片，拍照为0 h。随后分5组处理：对照组更换为新的无血清 RPMI-1640培养基，H2O2组更换为含100 μmol/L H2O2的无血清 RPMI-1640培养基，CMC-OCS组、PRP组、CMC-OCS/PRP组分别更换为含100 μmol/L H2O2的对应水凝胶浸提液，水凝胶浸提液与培养基的体积均为1 mL。培养36 h后拍照，使用 Image J 软件测量0，36 h的划痕面积，计算细胞迁移面积。
Transwell小室实验：将8 μm 的Transwell小室放入24孔板中，上室加入生长状态良好的L929细胞，细胞密度4×104/孔，在下室内分5组处理：对照组加入无血清 RPMI-1640培养基，H2O2组加入含100 μmol/L H2O2的无血清 RPMI-1640培养基，CMC-OCS组、PRP组、CMC-OCS/PRP组分别加入含100 μmol/L H2O2的对应水凝胶浸提液，水凝胶浸提液与培养基的体积均为600 μL。置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养36 h后，取出Transwell小室，用甲醇固定细胞20 min，结晶紫染色10 min，用PBS清洗细胞，使用棉签拭去Transwell上室细胞，显微镜下观察小室微孔膜下层细胞并拍照。
1.5 主要观察指标 CMC-OCS/PRP水凝胶体外清除H2O2和·OH的能力，以及对氧化应激状态下L929细胞的影响。
1.6 统计学分析采用 GraphPad Prism 9.0软件对数据进行分析绘图，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，当 P < 0.05时认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经通过贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

此次实验重点探讨了CMC-OCS水凝胶与PRP复合体对L929细胞的保护作用，特别是在体外模拟的氧化应激环境中如何有效地维护细胞的稳定性和功能。L929细胞因培养简易和遗传稳定性而被广泛用于创面愈合研究，特别是在细胞迁移、增殖和细胞外基质合成方面。此次实验重点关注了活性氧在创面愈合中的双重作用，适量的活性氧对细胞增殖、分化和迁移具有积极作用[24-25]，过量的活性氧可能导致脂质过氧化、DNA损伤甚至细胞凋亡，从而阻碍创面愈合[26-27]。为解决这一问题，此次实验观察了CMC-OCS水凝胶的抗氧化特性，这两种物质不仅直接清除活性氧，还可能激活细胞内的抗氧化酶系统来增强细胞的抗氧化能力。此外，实验还探讨了PRP对缓解氧化应激、刺激细胞增殖和促进迁移的作用。此次实验发现将CMC-OCS与PRP结合使用时两者产生显著的协同效应，提供了一个更有利的微环境，保护细胞免受活性氧损害，同时增强对PRP中生长因子的响应，这一发现对于理解创面愈合过程中细胞功能的维持和恢复至关重要。
此次实验基于CMC-OCS/PRP构建仿细胞外基质微环境，单纯CMC-OCS成胶后呈透明状，随着PRP的加入呈淡黄色并逐渐加深，这可能与血清中富含的某些氨基酸、脂类物质、核酸衍生物等物质有关。CMC-OCS水凝胶扫描电镜图呈疏松多孔样，随着PRP的加入，CMC-OCS/PRP组超微结构呈致密趋势，相较于CMC-OCS水凝胶的孔隙率有所下降，孔径为30-200 μm的多孔结构可促进与创面愈合相关的角质形成细胞和成纤维细胞的生长，并有利于气体、营养物质和废物的扩散[28]。傅里叶变换红外光谱分析OCS在1 735 cm-1处出现了一个特征峰，这主要归因于醛对称振动，先前的研究报道了己糖醛酸的醛基和未氧化残基的羟基可以通过化学反应形成半缩醛，这可能是醛峰不太明显的原因[7]。此次实验表明，CMC-OCS/PRP水凝胶和其他文献所报道创面水凝胶拥有类似的降解性能，水凝胶的结构稳定性对降解性能有显著影响，结构稳定的水凝胶将尽可能紧密地留在创面表面，以止血以及减少外部细菌感染的风险[29]。通过CCK-8和活/死染色实验对CMC-OCS水凝胶、PRP凝胶及CMC-OCS/PRP水凝胶的生物相容性进行了评估，CCK-8通过测量细胞代谢活性来评价材料对细胞生存的影响，而活/死染色实验则直接显示了活细胞和死细胞的比例。此次实验结果显示，无论是单独使用CMC-OCS、PRP，还是它们的组合CMC-OCS/PRP，都未对成纤维细胞造成毒性影响，表明这些生物制剂在生物学上是安全的，为其在创面愈合等生物医学应用中的进一步研究和应用提供了重要依据。慢性创面中常见的活性氧过量会导致创面细胞过度凋亡，这一现象在创面愈合过程中成为一个显著的障碍，特别是在慢性创面区域，细胞因活性氧的高水平而容易进入凋亡状态。为了更深入地了解这一问题，此次实验采用DCFH-DA和丙二醛水平两种实验方法，评估了CMC-OCS水凝胶、PRP凝胶和CMC-OCS/PRP水凝胶的抗氧化效果。其中，DCFH-DA作为荧光探针专门用于检测活细胞中活性氧的产生[30]，而丙二醛则是细胞受到氧化应激后脂质过氧化过程中的主要副产物，是衡量脂质过氧化程度的标志物[31]。此次实验结果显示，CMC-OCS和PRP均能显著抑制H2O2诱导的细胞凋亡，暗示它们可能通过对成纤维细胞的保护来有助于创面愈合。值得注意的是，当CMC-OCS与PRP结合时，它们之间展现出了明显的协同抗氧化效果，而这可能通过不同的分子机制实现的，课题组前期研究已证实PRP具有抗氧化效果[32]。PRP通过激活NRF2/血氧合酶1通路对脂多糖诱导的BV2小胶质细胞展现出保护作用，这表明PRP可能通过同样的通路来抑制H2O2引起的氧化应激。另有研究表明，PRP能够增加Nrf2的核水平，并且诱导一些抗氧化/Ⅱ期解毒酶(超氧化物歧化酶2、过氧化氢酶、血红素加氧酶、S-转移酶)的表达[33]。CMC的抗氧化机制涉及其分子结构中的羟基和羧基与自由基反应，有效抑制氧化过程[34]。硫酸软骨素的抗氧化作用与激活信号通路PKC/PI3K/Akt和诱导抗氧化酶血氧合酶1表达有关[35]，这些机制共同提高了细胞在有害环境中的生存能力。
此外，通过细胞骨架和胶原纤维Ⅰ表达来探究各组对L929细胞形态及功能的影响，细胞骨架在细胞中起着支持和维持形态的作用，它的稳定性直接影响到细胞的功能和行为，特别是在应对外部压力和物理变化时[36]；另一方面，胶原纤维Ⅰ作为主要的细胞外基质蛋白对于组织的结构完整性和功能至关重要，在创伤修复过程中，胶原纤维Ⅰ的合成和沉积是关键步骤，它不仅为新生组织提供支撑，还与其他分子互作调控创面愈合的速度和效果[37]。此次实验发现，CMC-OCS和PRP显著增强了过量氧化应激下细胞骨架的稳定性，这意味着细胞在CMC-OCS和PRP的作用下更能够抵抗外部压力，保持其形态和功能，尤其是CMC-OCS/PRP效果最为显著，并且CMC-OCS/PRP还促进了胶原纤维Ⅰ的合成，这对于加速创面愈合和提高修复组织的具有积极作用。细胞迁移在组织修复和创面愈合中的作用是不可或缺的。当身体受到外部伤害并产生创面时，身体会立即启动一系列复杂的生物反应，以尽快修复受损的组织，细胞迁移尤其是成纤维细胞的迁移是这一复杂过程中的关键环节。成纤维细胞不仅在创面愈合过程中作为“桥梁”填补创面空缺，更为重要的是它们在愈合过程中释放各种细胞因子，有助于新的细胞外基质的形成，促进新血管的生成，从而为创面提供更多的营养物质，加速创面的愈合[38-39]，这一系列的生物过程确保了创面得以有效、迅速地愈合，防止了慢性创面或并发症的发生。此次实验发现CMC-OCS/PRP复合物显著增强了成纤维细胞在氧化应激环境下的迁移能力，其机制可能与PRP中含有的血小板衍生生长因子B、成纤维细胞生长因子β和趋化因子CXCL-5等多种细胞因子有关，为细胞迁移提供初始信号。此外研究表明，PRP处理可以激活包括AKT、ERK1/2、paxillin和RhoA在内的多个信号通路，促进细胞黏附和迁移，揭示了PRP通过激活特定信号通路增强了成纤维细胞对有害环境的适应能力，从而促进了细胞黏附和迁移[40]。CMC-OCS水凝胶可能通过模拟天然细胞外基质的结构和功能为成纤维细胞提供一个适宜的三维支架，从而促进细胞迁移和生长，同时与PRP的结合可能增强了PRP中细胞因子的稳定性和生物活性，共同协同促进细胞迁移。
综上所述，此次实验结果明确指出，CMC-OCS与PRP在L929细胞的抗氧化、促细胞迁移和抑制凋亡的能力上有显著的促进效果，为进一步理解CMC-OCS和PRP在创面愈合中所发挥的潜在机制提供了坚实的理论基础。尽管实验提供了有关CMC-OCS和PRP及其组合在创面愈合中积极作用的初步证据，但具体的生物学机制还需要进一步明确。此外值得注意的是，实验仅限于细胞层面，而在真实的生物体内环境下这些结果是否得到确认仍是一个问题。因此，在考虑其在临床中的实际应用之前仍需进一步的验证研究，特别是在动物模型和人体试验中，以确保其治疗效果的安全性和有效性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

载富血小板血浆水凝胶对L929细胞氧化损伤的保护作用

Protective effects of platelet-rich plasma hydrogel on oxidative damage in L929 cells

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