抗纤维化与促“H”型血管核壳结构生物支架修复临界骨缺损

doi:10.12307/2025.418

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (16): 3420-3431.doi: 10.12307/2025.418

• 复合支架材料 composite scaffold materials • 上一篇下一篇

抗纤维化与促“H”型血管核壳结构生物支架修复临界骨缺损

李永航，李文铭，严才平，王星宽，向超，张袁，蒋科，陈路

川北医学院附属医院骨科，四川省南充市 637000

收稿日期:2023-12-02 接受日期:2024-03-13 出版日期:2025-06-08 发布日期:2024-09-04
通讯作者: 通讯作者：陈路，主任医师，川北医学院附属医院骨科，四川省南充市 637000 共同通讯作者：蒋科，博士，副主任医师，川北医学院附属医院骨科，四川省南充市 637000
作者简介:第一作者：李永航，男，1997年生，江苏省宿迁市人，汉族，硕士在读，医师，主要从事骨缺损再生研究。共同第一作者：李文铭，男，1996年生，四川省南充市人，汉族，主要从事软骨修复研究
基金资助:
四川省医学会科研课题项目(2015GK012)，项目负责人：陈路；南充市2022年市校合作项目(22SXQT0308)，项目负责人：蒋科；南充市2023年市级科技研发计划项目(23JCYJPT0036)，项目负责人：王星宽

Critical bone defect repaired with anti-fibrosis and “H”-type core-shell bionic scaffold

Li Yonghang, Li Wenming, Yan Caiping, Wang Xingkuan, Xiang Chao, Zhang Yuan, Jiang Ke, Chen Lu

Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China

Received:2023-12-02 Accepted:2024-03-13 Online:2025-06-08 Published:2024-09-04
Contact: Corresponding author: Chen Lu, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Co-corresponding author: Jiang Ke, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
About author:Li Yonghang, Master candidate, Physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Li Wenming, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Li Yonghang and Li Wenming contributed equally to this article.
Supported by:
Scientific Research Task of Sichuan Medical Association, No. 2015GK012 (to CL); Program of Cooperation between the Schools and Nanchong City in 2022, No. 22SXQT0308 (to JK); Nanchong 2023 Municipal Science and Technology Research and Development Plan, No. 23JCYJPT0036 (to WXK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
临界骨缺损：是指依靠自身修复能力无法达到愈合的最小尺寸骨缺损，往往是由创伤、肿瘤或先天性疾病所导致的后遗症。
静电纺丝技术：是一种高效的纳米纤维材料制备方法，其基本原理是利用高电压作用在聚合物溶液中形成纳米纤维，然后通过静电纺丝装置进行纺丝成型。静电纺丝技术具有可靠性高、工艺简单、成本低等诸多优点。

背景：在骨组织愈合过程中，促进新生骨的血管化是加速骨组织修复的常用策略，然而骨缺损修复过程中过快的纤维化进程常常被忽略。
目的：设计并制备一种具有调节新生骨痂内纤维化及血管化进程的核壳结构仿生支架，表征其物理学特征，验证其体内外抗纤维化与促成骨性能。
方法：制备具有调节新生骨痂内纤维化及血管化进程的核壳结构仿生支架，外层壳结构由聚己内酯静电纺丝纳米纤维负载成纤维细胞活化蛋白抑制剂组成，内层核结构由甲基丙烯酸酐明胶水凝胶负载去铁胺组成，表征静电纺丝和水凝胶的物理学特征，利用活死染色与CCK-8实验验证材料的生物相容性。通过成纤维细胞体外实验分析支架壳结构的抗纤维化作用，通过MC3T3-E1细胞体外实验分析支架壳结构中成纤维细胞活化蛋白抑制剂的促成骨作用，通过人脐静脉内皮细胞分析支架核结构中去铁胺的促血管形成作用。通过大鼠临界骨缺损实验评估核壳结构仿生支架的骨修复作用。
结果与结论：①核壳结构仿生支架具有良好的生物相容性，静电纺丝技术制备的聚己内酯电纺纤维具有疏水性，在物理层面上有效阻隔外源性纤维组织长入，电纺纤维膜在2周内可有效释放抗纤维化药物成纤维细胞活化蛋白抑制剂，释放的抗纤维化药物可以抑制骨缺损周围成纤维细胞的生长、黏附，有效降低成纤维相关蛋白的表达，同时可促进MC3T3-E1细胞成骨蛋白的表达，加快其矿化速度；支架核结构中的去铁胺可促进人脐静脉内皮细胞的迁移、成管能力，并促进其强烈表达“H”血管特征性蛋白。②在SD大鼠的股骨制造临界骨缺损模型中，相较于聚己内酯膜，核壳结构仿生支架实现了骨缺损的有效修复。③结果表明，核壳结构仿生支架在预防骨痂过度纤维化的同时促进新生骨痂内“H”血管形成，能有效避免骨不连的发生，加速临界骨缺损修复进程。
https://orcid.org/0009-0006-5771-265X (李永航)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 临界骨缺损, 核壳结构仿生支架, 静电纺丝, 聚己内酯, 水凝胶, 抗纤维化, “H”型血管

Abstract: BACKGROUND: During bone tissue healing, promoting the vascularization of new bone is a common strategy to accelerate the repair of bone tissue. However, the rapid fibrosis process during bone defect repair is often ignored.
OBJECTIVE: To design and prepare a core-shell structure bionic scaffold to regulate the process of fibrosis and vascularization in new callus, characterize physical characteristics of the scaffold, and verify the anti-fibrosis and osteogenic properties in vitro and in vivo.
METHODS: A core-shell structure bionic scaffold to regulate the process of fibrosis and vascularization in new callus was designed and prepared. The outer shell structure of the scaffold was composed of polycaprolactone electrospun nanofibers loaded with fibroblast activating protein inhibitor; and the inner core structure was composed of gelatin methacrylate hydrogel loaded with deferoxamine. The physical characteristics of electrospun and hydrogel were characterized, and the biocompatibility of the material was verified by live-dead staining and CCK-8 assay. The antifibrotic effect of core-shell structure was analyzed by fibroblast in vitro assay. The osteogenic effect of fibroblast activating protein inhibitor in core-shell structure was analyzed by MC3T3-E1 cells in vitro assay. The vasogenic effect of deferoxamine in core-shell structure was analyzed by human umbilical vein endothelial cells. The effect of bionic core-shell scaffold on bone repair was evaluated by critical bone defect test in rats.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The core-shell structure bionic scaffold had good biocompatibility. Hydrophobic polycaprolactone electrospun fibers prepared by electrospinning technology could effectively block the ingrowth of exogenous fibrous tissue on the physical level. The electrospun fiber membrane could effectively release the anti-fibrosis drug fibroblast activating protein inhibitor within 2 weeks, and the released anti-fibrosis drug could inhibit the growth and adhesion of fibroblasts around bone defects, effectively reduced the expression of fibroblast-related proteins, promoted the expression of osteoblast protein in MC3T3-E1 cells, and accelerated its mineralization rate. The deferoxamine in the core-shell structure could promote the migration and vascular formation ability of human umbilical vein endothelial cells, and promoted their strong expression of “H” vascular characteristic protein. (2) In critical bone defect model of SD rats established in the femur, compared with polycaprolactone membrane, the core-shell structure bionic scaffold could effectively repair bone defects. (3) These findings indicate that the core-shell structure bionic scaffold can prevent excessive fibrosis of callus and promote the formation of “H” vessels in the new callus, which can effectively avoid the occurrence of nonunion and accelerate the repair process of critical bone defect.

Key words: critical bone defect, core-shell structure bionic scaffold, electrospinning, polycaprolactone, hydrogel, anti-fibrosis, “H”-type , blood vessels

中图分类号:

李永航, 李文铭, 严才平, 王星宽, 向超, 张袁, 蒋科, 陈路. 抗纤维化与促“H”型血管核壳结构生物支架修复临界骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(16): 3420-3431.

Li Yonghang, Li Wenming, Yan Caiping, Wang Xingkuan, Xiang Chao, Zhang Yuan, Jiang Ke, Chen Lu. Critical bone defect repaired with anti-fibrosis and “H”-type core-shell bionic scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(16): 3420-3431.

图/表（结果） 10

2.1 核壳结构仿生支架及其组成各部分的物理性质如图1A所示，聚己内酯静电纺丝纳米纤维直径在100-500 nm之间，具有良好的各向异性，可以很好地阻止细胞、组织长入；甲基丙烯酸酐明胶水凝胶存在孔隙结构，孔径均在300 μm以内，证明复合水凝胶内部存在连通孔隙；在支架的核壳结构内部，静电纺丝和水凝胶通过物理锚定的方式较好地结合在一起。采用X射线能谱、扫描电镜能谱和进一步分析聚己内酯的结构和成分，发现材料表面存在F元素，证明了FAPI-4药物成功负载在聚己内酯纤维膜上(图1B，C)；使用傅里叶红外光谱发现不同载药比例对静电纺丝表面的官能团没有影响(图1D)。

水接触角测量仪所拍摄的图像见图2A，载药比例0.2%聚己内酯纤维膜的水接触角[(113.0±0.8)°]较单纯聚己内酯纤维膜[(120.0±0.4)°]小，但整体改变幅度不大[14]，仍然保持较好的疏水性。各载药聚己内酯纤维膜在2周之内可以有效释放出抗纤维化药物FAPI-4，各水凝胶中的去铁胺在溶胀效果下1周内便释放完毕，见图2B。

2.2 核壳结构仿生支架的生物相容性活死染色与CCK-8实验结果显示，当成纤维细胞在不同载药比例的静电纺丝膜上共培养时，活细胞数量增加，死亡细胞数量少，随纤维膜中载药比例增加，死细胞增多；同样，随纤维膜中载药比例的增加，细胞增殖率受到抑制，见图3。

活死染色与CCK-8实验结果显示，当成骨前体细胞与不同载药比例甲基丙烯酸酐明胶水凝胶共培养时，同样可以观察到细胞存活性好，随着水凝胶中载药含量的增加，死细胞增加，同时细胞增殖率受到抑制，见图4。这证明了一定载药量范围内核壳结构仿生支架具有良好的生物相容性。为了在支架功能和生物相容性中取得一定平衡，后续实验均采取FAPI-1(0.1%)和去铁胺60 μmol/L的载药量进行。

2.3 聚己内酯纤维膜的体外抗纤维化实验
2.3.1 聚己内酯纤维膜的物理阻隔作用共聚焦激光扫描显微镜下可见成纤维细胞集中在纳米纤维膜的表面，难以进入更深层次的纤维膜内部(图5A)。如图5B示意图所示，在具有静电纺丝膜阻挡的Transwell小孔中，成纤维细胞很少穿过聚碳酸酯膜，几乎没有细胞可以穿越过聚己内酯纤维膜，这得益于纳米纤维微纳米的孔隙和致密的结构[14，36]。而在没有纳米纤维膜阻隔的Transwell小室中，成纤维细胞很容易就穿过小室的聚碳酸酯膜(图5C)。

2.3.2 聚己内酯膜抑制成纤维相关蛋白表达图6显示各组成纤维细胞黏着斑和转化生长因子β1的免疫荧光染色。空白组成纤维细胞增殖数量最多，细胞形态最好，黏着斑和转化生长因子β1的表达最丰富；对照组细胞形态变化不大，细胞数量明显抑制，这是由于FAPI-4抑制成纤维细胞生长增殖的作用；实验组细胞形态不规则，伸展性不佳，黏着斑和转化生长因子β1的表达最弱。

2.4 聚己内酯纤维膜的促成骨性能茜素红染色与碱性磷酸酶染色显示，相较于空白组，实验组细胞钙沉积和碱性磷酸酶表达增强；Ⅰ型胶原蛋白免疫荧光染色结果显示，经地塞米松干预的细胞Ⅰ型胶原蛋白表达受到抑制，经特立帕肽和载药聚己内酯纤维膜浸提液干预的细胞明显表达更强的Ⅰ型胶原蛋白，并且均强于空白组，见图7。

2.5 甲基丙烯酸酐明胶水凝胶的促血管形成作用划痕实验、迁移实验与成骨实验结果显示，相较于空白组，血管内皮生长因子与载药甲基丙烯酸酐明胶水凝胶浸提液均可促进人脐静脉内皮细胞的迁移与成管，见图8。

CD31/Emcn免疫荧光染色结果显示，空白组细胞CD31和Emcn蛋白表达均较弱；使用血管内皮生长因子干预细胞后，仅CD31蛋白表达较强，Emcn蛋白表达较弱；使用载药甲基丙烯酸酐明胶水凝胶浸提液干预细胞后，CD31和Emcn蛋白表达均很强，见图9。

2.6 体内实验结果
2.6.1 实验动物数量分析 36只大鼠全部进入结果分析。
2.6.2 各组大鼠股骨X射线观察术后4周，各组骨缺损部分都处于原始骨痂时期，新生的骨痂质地稍硬但在影像学图片上并不能显影；术后8周，核壳支架组可见骨折断端有部分连接，空白对照组和聚己内酯组无骨性连接；术后12周，空白对照组与聚己内酯骨缺损修复不完整，核壳支架组骨缺损成功修复，骨皮质连续，见图10。
2.6.3 各组大鼠股骨CD31/Emcn免疫荧光染色术后4周，核壳支架组“H”型血管的表达高于假手术组、空白对照组与聚己内酯组，见图10。
2.6.4 大鼠股骨组织苏木精-伊红染色为了确定空白对照组和聚己内酯组股骨修复是否为纤维化组织，对其进行苏木精-伊红染色分析。术后12周苏木精-伊红染色结果显示，对空白对照组和聚己内酯组骨缺损部分的非骨化组织为成纤维组织，见图10。

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引言

临界骨缺损是指依靠自身修复能力无法达到愈合的最小尺寸骨缺损，往往是由创伤、肿瘤或先天性疾病所导致的后遗症[1-2]。目前临床上仍以自体骨移植作为修复临界骨缺损的主要治疗手段，但由于移植骨供体的稀缺、手术创伤大、术后供体部位疼痛、治疗成本高等因素限制了其临床应用[3]。为了解决这一临床难题，国内外研究报道了多种组织工程策略以期弥补这一缺陷，旨在创造人工骨移植物/促骨生长因子以满足日益增长的临床需要[4-6]。
然而，目前针对骨组织再生的策略通常只关注骨组织本身，而忽视了临界骨缺损区域早期过度纤维组织长入而阻碍骨再生的问题[7-8]。在临界骨缺损区域的骨再生过程中，骨缺损区域内的纤维组织生长速度较快，而骨组织生长速度较慢，新生骨组织的生长速度与新生纤维组织的生长速度需维持一个相对平衡的状态才能有效促进正常骨组织再生[9]，如果这个平衡被打破将呈现出相应的病理状态，最终表现为骨折的延迟愈合甚至是骨不连[1，10]。通过对小鼠再生骨组织的细胞来源进行追踪发现，再生骨组织中的纤维细胞多来自于脂肪、肌腱等骨旁组织，当成纤维细胞过度活化时会导致骨缺损部位大量纤维组织填充，最终导致骨不连的发生[11]。针对临界骨缺损修复中这种成纤维化与成骨化速率失衡的病理机制，作者提出调控骨再生过程中成纤维化和成骨化的动态进程是治疗的关键。
为了避免因外源性纤维化进程过强而导致骨不连，此次实验设计并制备了一种能防止纤维化过度长入和促进血管、骨再生的“人工骨膜”[7]。聚己内酯是一种生物安全性良好且被FDA认证可用于临床的高分子材料[12-13]。静电纺丝是由聚合物溶液在强电场中进行喷射纺丝，可以生产出纳米级直径聚合物细丝的技术[14-15]。利用静电纺丝技术制备的聚己内酯纳米纤维膜具有良好的疏水性，可以有效阻挡细胞的迁移、生长，从物理角度阻挡外源性成纤维细胞的长入[7，16]。此外，在骨缺损形成和材料植入后的动态过程中，骨缺损处存在长期炎症修复过程。成纤维细胞活化蛋白抑制剂是一种成纤维细胞的生长抑制剂[17]，在肿瘤、创伤、炎症等多种情况下可有效降低炎症、抑制成纤维细胞的生长，并且有促进成骨的作用[18-19]。将成纤维细胞活化蛋白抑制剂与聚己内酯混合电纺制备的静电纺丝纤维膜[20]，不仅在物理层面上隔绝外源性成纤维细胞的长入，而且可以通过持续释放成纤维细胞生长抑制剂很好地降低炎症、抑制内源性纤维组织的生长，为成骨修复创建了一个良好的内在环境[21]。
在骨骼修复和重塑过程中，“H”型血管生成和骨再生密切相关[22-24]。“H”型血管是骨中一种特殊的血管亚型，其特征是内皮细胞中CD31蛋白和Endomucin(Emcn)蛋白均呈强阳性[23，25-26]。最近，各种靶向“H”型血管的生物活性小分子被探索作为生长因子的替代品来加速血管化，加速骨再生进程[23，27]。去铁胺是一种FDA批准的小分子铁螯合剂，一些研究发现去铁胺具有促进“H”型血管形成的特性[28]。然而，因为去铁胺在体内的半衰期非常短，因此经常需要高剂量给药或者多次重复给药以达到有效的药物浓度。在骨缺损组织中血管丢失的情况下，通过口服或腹腔注射等给药方式难以在局部组织中富集药物；相反，高剂量去铁胺治疗与许多全身毒性有关，例如对呼吸系统、心血管、胃肠道和皮肤的毒性[29]。因此，选择一种具有生物安全性、细胞活性的基质作为药物载体尤为重要[30-31]。甲基丙烯酸酐水凝胶由于优秀的生物相容性、高孔隙率、类细胞外基质结构等优点，被认为是优秀的生物材料支架[32]；此外，它还保留了明胶细胞相互作用促进基团的RGD序列和酶降解性，从而改善细胞黏附，促进细胞生长和增殖，调节细胞活力，具有促进血管生长的作用[33-34]。
此次实验通过静电纺丝技术和光固化技术将成纤维细胞活化蛋白抑制剂和去铁胺结合在核壳结构仿生支架中，构建了兼具抗纤维化和促进“H”型血管化及骨再生的骨单元再生体系，该支架由负载成纤维细胞活化蛋白抑制剂的聚己内酯静电纺丝纳米纤维“壳”和负载去铁胺的甲基丙烯酸酐水凝胶“核”组成，对该支架进行系统表征和生物学验证，旨在为设计和制造有效、安全的生物活性支架提供新的思路，为临界骨缺损骨再生提供一种有效的治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计生物材料制备、生物相容性验证、细胞学观察和体内实验，采用独立样本t检验评估两组间的统计学差异，多组间的统计学差异采用单因素方差分析(ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年6月在川北医学院风湿免疫实验室及川北医学院动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 试剂与仪器聚己内酯(相对分子质量80 000)、去铁胺(Solarbio生命科学公司，北京)；地塞米松磷酸钠、特立帕肽、血管内皮生长因子购自索莱宝；甲基丙烯酸酐明胶(EFL公司，苏州，中国)；成纤维细胞蛋白抑制剂FAPI-4(Abmole，US)；DMEM-F12培养基、胎牛血清、PBS和青霉素/链霉素等细胞培养相关试剂(GibcoBRL，Rockville，MD，USA)；DAPI、鬼笔环肽、碱性磷酸酶及相应试剂盒(北Solarbio生命科学公司，北京，中国)；黏着斑、转化生长因子β1、Ⅰ型胶原、Emcn抗体(Affinity，江苏，中国)；CD31抗体及荧光二抗(proteintech公司，US)；扫描电子显微镜(Zeiss Sigma 300，Germany)；Avatar 380红外光谱仪(ThermoNicolet Nicolet Nexus/Nicolet continum，USA)；能量色散X射线光谱仪(Thermo Scientific K-Alpha，USA)；水接触角测量仪(SUNGOLL，苏州)。
1.3.2 实验动物 6-8周龄SD大鼠36只，雄性，SPF级，体质量180-200 g，购自川北医学院动物中心，许可证号：SYXK(川)2018-076。实验方案获得川北医学院动物实验中心伦理委员会批准，批号：(2023)063。
1.4 实验方法
1.4.1 核壳结构仿生支架的制备和表征将0.5 g聚己内酯溶解在4.5 mL氯仿溶剂中制备静电纺丝溶液，加入0.1 g二甲基甲酰胺平衡溶液性能。在溶解聚己内酯过程中直接加入成纤维细胞蛋白抑制剂FAPI-4，依据成纤维细胞蛋白抑制剂FAPI-4/(成纤维细胞蛋白抑制剂FAPI-4+聚己内酯)质量分数设置不同载药组，载药分组设置为0%，0.05%，0.1%，0.2%。采用静电纺丝法制备聚己内酯纤维膜。将静电纺丝溶液转移到10 mL注射器针头中，高压电极与接收器设置为18 kV电压、20 cm的收集距离，流速控制在2.5 mL/h，在铝箔上收集制备的纤维膜。在进一步研究之前，将制备的纤维膜在真空中干燥过夜。取商品化的甲基丙烯酸酐明胶200 mg，加入2 mL纯水37 ℃水浴溶解，待样品充分溶解后分别加入不同浓度去铁胺(30，60和90 μmol/L)，相当于1 g水凝胶分别含有42.05，84.10和126.15 μg去铁胺，采用涡旋振荡仪混匀药物(1 500 r/min，15 s)，使去铁胺被甲基丙烯酸酐明胶均匀吸收，加入光引发剂(5 g/L)，于405 nm波长紫外光照射30 s固定成胶。将聚己内酯纤维膜卷成圆筒状置于圆柱形特定模具中，放入水凝胶于405 nm紫外光下固化，形成核壳结构仿生支架。取出支架样本制样，喷金，于扫描电子显微镜下观察聚己内酯静电纺丝纤维、水凝胶和核壳支架的微观形态。使用扫描电镜能谱、能量色散X射线光谱分析静电纺丝的元素组成。使用Avatar 380红外光谱仪记录衰减全折射傅里叶变换红外光谱分析静电纺丝纤维膜的化学成分和结构。使用水接触角测量仪测定不同载药比例聚己内酯静电纺丝纤维膜水接触角的变化。
1.4.2 支架的药物释放曲线配制含FAPI-4药物的标准溶液，使用高效液相色谱测定其吸光度值，绘制成药物浓度曲线。将各载药支架裁剪成质量50-100 mg膜片并放置于2 mL EP管中，每管加入1 mL PBS，放入37 ℃恒温箱摇床中。在一定的时间节点(1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d，7 d，2周)，取出100 µL的溶液，同时加入等体积的PBS，利用高效液相色谱来检测吸收峰和峰面积。配制FAPI-4标准品，计算出药物浓度与峰面积的函数方程，依据各个样品的出峰面积计算药物浓度。同理，检测甲基丙烯酸酐明胶水凝胶释放的去铁胺浓度。
1.4.3 细胞培养实验使用的细胞包括成骨前体细胞MC3T3-E1、大鼠成纤维细胞RAT2和人脐静脉内皮细胞，均购自Procell生物有限公司(苏州，中国)。加入完全培养基进行培养，取传至第3-5代的细胞用于后续
实验。
完全培养基含有细胞基础培养基DMEM-F12(88%)、胎牛血清(体积分数10%)和青霉素-链霉素(1%)，每 3 d换液1次。细胞在37 ℃、体积分数5%CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。当细胞融合度达到80%时用胰蛋白酶化传代。

1.4.4 支架的生物相容性
活死染色：采用活死染色实验评估核壳结构仿生支架的细胞毒性。将RAT2细胞以5×104/孔的密度接种于12孔板内，分别与0%(对照)，0.05%，0.1%，0.2%静电纺丝纤维共培养；将MC3T3-E1细胞以5×104/孔的密度接种于12孔板内，分别0(对照)，30，60，90 μmol/L水凝胶共培养。48 h后，使用活死染色试剂盒对细胞进行染色，在荧光显微镜下观察与拍摄。使用image J软件分析活细胞百分比。实验重复进行3次。
CCK-8实验：将RAT2细胞以5×104/孔的细胞密度接种于12孔板内，分别与0%，0.05%，0.1%，0.2%静电纺丝纤维共培养；将MC3T3-E1细胞以5×104/孔的密度接种于12孔板内，分别0，30，60，90 μmol/L水凝胶共培养。共培养1，3，5 d后，更换新鲜普通培养基，加入10 μL CCK-8溶液37 ℃避光孵育1 h，用酶标仪在450 nm测定吸光度值。计算细胞存活率。细胞存活率=[(实验孔-空白孔)]/[(对照孔-空白孔)]×100%，空白孔仅加入新鲜普通培养基无细胞。实验重复3次。
1.4.5 聚己内酯纤维膜的抗成纤维细胞黏附实验
聚己内酯纤维膜对纤维细胞的物理阻隔作用：将不载药的聚己内酯纤维膜裁剪合适大小，使用体积分数75%乙醇与紫外光消毒处理后置于Transwell孔板的上层小室中，使其完全覆盖聚碳酸酯膜。将RAT2细胞以5×104/孔的密度接种于聚己内酯纤维膜表面，以未加入聚己内酯纤维膜的为对照。培养48 h后，用PBS清洗小室3遍，固定、结晶紫染色，取下聚己内酯纤维膜，观察成纤维细胞对聚己内酯纤维膜的透过效果。实验重复3次。将纳米纤维膜上的细胞固定，分别用罗丹明鬼笔环肽和DAPI孵育，进行细胞骨架和细胞核染色，置于共聚焦激光扫描显微镜下观察。
聚己内酯纤维膜对成纤维细胞相关蛋白表达的影响：将聚己内酯静电纺丝膜裁剪合适大小，使用体积分数75%乙醇与紫外光消毒处理后备用。实验设置空白组、对照组与实验组，空白组将RAT2细胞接种于Transwell孔板的下层，将未载药的聚己内酯纤维膜置于Transwell孔板的上层；对照组将RAT2细胞接种于Transwell孔板的下层，将载药(0.1%)聚己内酯纤维膜置于Transwell孔板的上层；实验组将载药(0.1%)的聚己内酯纤维膜置于Transwell孔板的上层，然后将RAT2细胞接种于纤维膜表面，细胞密度均为2×106/孔。共培养48 h后，用PBS清洗细胞3次，40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，0.5% TritonX-100破膜15 min，快速封闭液室温下封闭1 h。分别加入黏着斑、转化生长因子β1一抗(1∶100)4 ℃下孵育过夜，室温下荧光二抗孵育2 h(1∶100)，再次用PBS洗涤，DAPI染色细胞核10 min，中性树脂封固，置于共聚焦激光扫描显微镜下观察。
1.4.6 聚己内酯纤维膜的促成骨性能
Ⅰ型胶原蛋白免疫荧光染色：将载药(0.1%)聚己内酯纤维膜浸泡于PBS中，置于摇床中浸提24 h获得材料浸提液。实验设置空白组、地塞米松组、特立帕肽组与实验组。将MC3T3-E1细胞以2×106/孔的密度接种于Transwell孔板的下层，空白组、地塞米松组、特立帕肽组与实验组分别将完全培养基、地塞米松溶液(5 mg/mL)、特立帕肽溶液(10 mg/mL)与材料浸提液加入Transwell孔板的上层，100 µL/孔。共培养48 h后，用PBS清洗细胞3次，40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，0.5%TritonX-100破膜15 min，快速封闭液室温下封闭1 h。加入、Ⅰ型胶原蛋白一抗(1∶100)4 ℃下孵育过夜，室温下荧光二抗孵育2 h(1∶100)，再次用PBS洗涤，DAPI染色细胞核10 min，中性树脂封固，置于共聚焦激光扫描显微镜下观察。使用Image J软件对荧光强度和荧光面积进行测量。实验均重复3次。
茜素红和碱性磷酸酶染色实验：将MC3T3-E1细胞以2×106/孔的密度接种于6孔板内，分2组：空白组加入完全培养基，实验组加入材料浸提液(100 µL，FAPI-4质量浓度约为25 µg/mL)与完全培养基。培养48 h后，将细胞固定于40 g/L多聚甲醛中，然后进行茜素红和碱性磷酸酶试剂盒染色，反复冲洗后置于显微镜下观察。
1.4.7 甲基丙烯酸酐明胶水凝胶的促血管形成作用
人脐静脉内皮细胞“H”血管相关蛋白表达：将载药(60 μmol/L)甲基丙烯酸酐明胶水凝胶浸泡于PBS中，置于摇床中浸提24 h获得材料浸提液。实验设置空白组、对照组与实验组。将人脐静脉内皮细胞以2×106/孔的密度接种于Transwell孔板的下层，空白组、对照组与实验组分别将完全培养基、血管内皮生长因子溶液(5 µg/mL)、材料浸提液(去铁胺质量浓度约为5 µg/mL)加入Transwell孔板的上层，100 µL/孔。培养48 h后，进行CD31/Emcn免疫荧光染色。染色步骤同前。
人脐静脉内皮细胞划痕实验：人脐静脉内皮细胞以2×106/孔的密度接种于6孔板内，当细胞融合达到100%时，用1 000 μL无菌枪头在每孔中画一条直线，用PBS洗涤孔板2次，分为空白组、对照组与实验组，分别加入完全培养基、血管内皮生长因子溶液(5 µg/mL)、材料浸提液(去铁胺质量浓度约为5 µg/mL)，100 µL/孔。培养0，24，48 h，对每个划痕取3个随机场图像。利用Image J软件定量分析细胞新增爬行面积。
人脐静脉内皮细胞迁移实验：将人脐静脉内皮细胞以2×105/孔的密度接种于Transwell孔板的上层中，分为空白组、对照组与实验组，分别将完全培养基、血管内皮生长因子溶液(5 µg/mL)、材料浸提液(去铁胺质量浓度约为5 µg/mL)加入Transwell孔板的下层。培养24 h后，取下PC膜，分析细胞的迁移能力。利用Image J软件定量分析聚碳酸酯膜上的细胞数量。实验均重复3次。
人脐静脉内皮细胞成管实验：基质Matrigel™涂层48孔板后，将人脐静脉内皮细胞以2×104/孔的密度接种于48孔板内，分为空白组、对照组与实验组，分别加入完全培养基、血管内皮生长因子溶液(5 µg/mL)、材料浸提液(去铁胺质量浓度约为5 µg/mL)，100 µL/孔。培养24 h后进行Calcein-AM染色，荧光显微镜下成像。采用Image J软件定量分析成管节点数量。实验均重复3次。
1.4.8 动物实验采用随机数字表法将36只SD大鼠分为假手术组、空白对照组、聚己内酯组、核壳支架组，每组9只。适应性喂养1周后，除空白对照组外，其余组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(20 mg/kg)进行麻醉处理，术区备皮、消毒、铺巾，切开皮肤及分离软组织，暴露股骨，使用线锯于右侧股骨干制造5 mm的骨缺损[2，35]，使用钛合金钢板固定(苏州云奥公司)，聚己内酯组、核壳支架组分别植入未载药聚己内酯纤维膜与核壳结构仿生支架(负载0.1%成纤维细胞活化蛋白抑制剂、60 μmol/L去铁胺)。术后4，8，12周，戊巴比妥钠过量麻醉后处死SD大鼠，每个时间点3只，无菌条件下迅速取出股骨，40 g/L多聚甲醛液固定后备检。
X射线片评估骨再生：术后4，8，12周，将股骨置入40 g/L多聚甲醛中固定24 h，用动物实验X射线仪器进行骨缺损再生评估。
CD31/Emcn免疫荧光染色：术后4周，收集完整的股骨样本(包括缺损区域)，固定、脱钙后嵌入80 g/L明胶中，置于20%蔗糖和2%聚乙烯吡罗烷酮混合溶液中固定，使用低温恒温器制作70 µm厚度的冷冻切片。0.3%Triton X-100渗透10 min，非特异性抗原用体积分数5%牛血清白蛋白溶液阻断60 min，加入CD31与Emcn抗体4 ℃孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次5 min，加入相应二抗在25 ℃孵育75 min。将切片置于安装介质中并用盖玻片覆盖，置于荧光显微镜下观察。
苏木精-伊红染色：术后12周，将股骨组织经40 g/L多聚甲醛固定 24 h，石蜡包埋切片，于60 ℃下烤片2.0 h；脱蜡至水，置于二甲苯中10 min×2 次；然后依次于体积分数 100%，95%，85%和75%乙醇中行梯度脱水；置于苏木精及伊红中各浸染5 min，每次染色后均用双蒸水冲洗；梯度乙醇(体积分数95%-100%)贯序脱水，每级5 min；置于二甲苯中透明10 min，中性树脂封固后显微镜下观察。
1.5 主要观察指标核壳结构仿生支架的抗纤维化与促成骨性能。
1.6 统计学分析使用SPSS 23.0(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)和GraphPad Prism 9(GraphPad Software，United States)进行统计学分析。采用独立样本t检验评估两组间的统计学差异，多组间的统计学差异采用单因素方差分析(ANOVA)。数据以x±s表示。当P < 0.05时认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经川北医学院学校生物统计学专家审核。

讨论

骨修复是一个高度动态的过程，在骨骼发育、成型和修复过程中，成骨进程与成纤维化、成血管化进程密切相关[7，9，11]。在临界骨缺损的修复过程中，由于骨缺损的尺寸大、成骨进程速度慢，而成纤维化进程过度活跃，纤维组织侵入并填充骨缺损区域，进而阻碍了成骨进程[37]。目前针对临界骨缺损的临床治疗主要以骨缺损区域填充自体骨、同种异体骨或其他生物活性材料，并结合促进成骨(骨形态发生蛋白2)或促血管(血管内皮生长因子)等药物应用为主[9，38-39]，并未关注骨缺损部位纤维化组织长入的问题。骨损伤后，成骨生成和血管生成与骨旁组织(脂肪、结缔组织等)密切相关，骨旁组织参与到成骨进程中来，一方面加快了成纤维化进程，另一方面降低成骨的质量，因此，隔绝骨缺损周围的成纤维化微环境，营造有利于成骨的再生微环境有望成为促进临界骨缺损修复的有力策略[11]。另外，鉴于临界骨缺损缺损尺寸大、成骨化速度慢的问题，提升成骨速度也是实现临界骨缺损有效修复的核心因素。H型血管是骨中一种特殊的血管亚型，在骨骼发育、成型和修复过程中，“H”型血管生成和成骨生成密切相关[22-23]。综上所述，在临床治疗中新生骨痂的抗纤维化与促“H”型血管化联合策略有望成为治疗临界骨缺损的新方向。为了解决这个问题，此次实验设计了一种“核壳”结构仿生支架聚己内酯-FAPI-4/甲基丙烯酸酐明胶-去铁胺，这种新型的功能化生物支架体系通过实现骨痂内纤维化和成骨化的平衡调控，有效抑制过强的纤维化，促进缺损部位成骨，可以显著增强SD大鼠临界骨缺损模型的骨再生作用，具有安全可靠的生物相容性。
聚己内酯是一种已获得FDA批准的高分子材料，由于丰富的可塑性和安全的生物相容性被广泛应用于医疗领域[12]。外层“壳”结构使用聚己内酯静电纺丝纳米纤维负载成纤维细胞活化蛋白抑制剂FAPI-4，聚己内酯电纺纤维具有疏水性，在物理层面上可有效阻隔外源性纤维组织长入。聚己内酯电纺纤维膜在2周内有效释放抗纤维化药物FAPI-4，抑制骨缺损周围成纤维细胞的生长、黏附，有效降低了成纤维相关蛋白的表达；同时，FAPI-4是一种成骨细胞促进剂，可以促进成骨前体细胞的成骨蛋白表达，加快其矿化速度[35]。为探究去铁胺对血管内皮细胞的干预效果，使用载去铁胺甲基丙烯酸酐明胶水凝胶处理血管内皮细胞，观察到细胞的迁移、成管能力均增强，并且强烈表达了“H”血管的特征蛋白CD31与Emcn[23]。
在SD大鼠股骨临界缺损模型中，空白对照组大鼠骨缺损部未达到有效修复，骨缺损处被大量纤维组织填充；仅使用聚己内酯纤维膜包裹的治疗组骨再生增强，仍然未实现修复临界骨缺损的有效修复；聚己内酯-FAPI-4/甲基丙烯酸酐明胶-去铁胺支架治疗组大鼠骨缺损处纤维组织明显减少，骨缺损达到有效修复。对空白对照组和聚己内酯组骨缺损处填充软组织进行苏木精-伊红染色，发现其成分即为成纤维组织。切片免疫荧光中可见，空白对照组和聚己内酯组再生骨组织中“H”血管表达少，而核壳支架组再生骨组织中“H”血管表达明显较高。植入核壳支架组在治疗过程中通过物理阻隔和药物干预的方式阻止了纤维组织的填充、占位，从而为成骨生长预留了位置，而释放的去铁胺则加强了骨再生组织的成管功能，因此在大鼠的临界骨缺损修复中，核壳支架实现了抗纤维化、促“H”血管化、促成骨修复的作用[40]。
综上所述，实验构建了一种基于抗纤维化和促“H”型血管化的多功能“核壳”结构生物支架聚己内酯-FAPI-4/
甲基丙烯酸酐明胶-去铁胺，该生物支架中的聚己内酯-FAPI-4部分具有降低骨缺损区域内纤维生长速度、阻挡骨缺损处周围软组织的长入，避免外源性纤维影响骨再生的作用，并且支架中负载的FAPI-4可加强成骨前体细胞本身的矿化、成骨能力以及降低组织炎症的作用；甲基丙烯酸酐明胶-去铁胺部分具有促“H”型血管化、调节骨生成等多种功能。此次实验结果表明，调控纤维化-成骨动态平衡理论及基于此理论构建的生物支架有望成为临界骨缺损中促进骨组织再生的新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

抗纤维化与促“H”型血管核壳结构生物支架修复临界骨缺损

Critical bone defect repaired with anti-fibrosis and “H”-type core-shell bionic scaffold

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