2.1   纳米颗粒h-PCuNF物理性能的表征   实验采用双乳化法制备出了纳米颗粒h-PCuNF和h-PCu，透射电镜下可见两种纳米颗粒均呈中空球形结构，粒径分布均匀，聚乳酸-羟基乙酸共聚物壳层中可见颗粒状CuNPs，表明其搭载成功；h-PCuNF纳米颗粒较h-PCu纳米颗粒的灰度增加，初步表明前叶碱搭载成功，见图1A。
元素分布分析结果显示，纳米颗粒h-PCuNF中含有C、Cu、P、N元素，其中C元素含量最高，主要来源于聚乳酸-羟基乙酸共聚物；Cu、P元素主要来源于CuNPs，进一步证明其搭载成功；N元素主要来源于荷叶碱，进一步证明荷叶碱搭载成功，见图1B。




激光粒度仪分析结果显示，纳米颗粒h-PCuNF的平均水合粒径为(309.2±10.0) nm，Zeta电位为(-12.5±0.9) mV，见图2A。采用电感耦合等离子体发射光谱仪检测纳米颗粒h-PCuNF和CuNPs中铜元素的含量，计算得出CuNPs在h-PCuNF纳米颗粒中的载药率和包封率分别为26.3%和63.2%。荷叶碱的紫外-可见光吸收光谱表明其特征性吸收峰位于273 nm处，并且吸光度值与荷叶碱的质量浓度呈线性关系，据此检测并计算得出荷叶碱在纳米颗粒h-PCuNF中的载药率和包封率分别为11.0%和52.6%，见图2B，C。这些结果表明纳米颗粒h-PCuNF中成功搭载了CuNPs和荷叶碱。
2.2   纳米颗粒h-PCuNF在生理环境中的悬浮稳定性   在生理盐水中，CuNPs在第2天可以观察到明显的聚集沉降，第7天基本完全聚集沉降；纳米颗粒h-PCuNF在7 d内没有发生明显的聚集沉降，见图2D，表明采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物搭载CuNPs可以显著增加其在生理环境中的悬浮稳定性。




2.3   纳米颗粒h-PCuNF的MRI成像功能   纳米颗粒h-PCuNF可以显著缩短纵向弛豫时间，其纵向弛豫率r1为3.51 L/(mmol?s)，见图3A。纳米颗粒h-PCuNF可以显著增强水的T1加权MRI成像信号，并且这种增强作用与h-PCuNF纳米颗粒的质量浓度呈正相关，见图3B。




2.4   纳米颗粒h-PCuNF介导光热、光动力和化学动力治疗的性能   纳米颗粒光热转换能力检测结果显示，无近红外照射的组中温度没有明显变化；近红外照射时，近红外组的温度增加，达到约34 ℃，h-PCu+近红外组和h-PCuNF+近红外组的温度显著升高，达到约50 ℃，见图4A。纳米颗粒光动力疗法检测结果显示，h-PCu+近红外组和h-PCuNF+近红外组的DPBF含量明显减低，表明这两组中生成了大量的活性氧，见图4B。此外，h-PCu+近红外组和h-PCuNF+近红外组之间温度变化和活性氧产量均没有明显差异，表明h-PCuNF纳米颗粒的光热转换和光动力治疗功能主要由其所搭载的CuNPs介导。
纳米颗粒消耗谷胱甘肽能力的检测结果显示，h-PCuNF和h-PCu具有消耗谷胱甘肽的能力，溶液pH值的降低可以显著提高这两种纳米颗粒对谷胱甘肽的消耗量，见图4C。纳米颗粒介导肿瘤微环境响应性化学动力治疗能力检测结果显示，在H2O2存在的情况下，h-PCuNF和h-PCu可以催化?OH的生成，加入谷胱甘肽可以进一步促进该反应，见图4D。此外，荷叶碱的存在不影响纳米颗粒消耗谷胱甘肽和介导化学动力治疗的能力。因此，纳米颗粒h-PCuNF消耗谷胱甘肽和介导化学动力治疗的能力主要归因于其所搭载的CuNPs。




2.5   h-PCuNF纳米颗粒对肿瘤细胞的治疗作用   激光共聚焦显微镜下可见孵育1 h后，HepG2细胞内出现DiI红色荧光信号；随着孵育时间的增加，HepG2细胞中的DiI红色荧光信号增加，并且主要分布在细胞质中，见图5A，B。此外，将纳米颗粒h-PCuNF与HepG2细胞共孵育24 h后，MTT检测未观察到明显的细胞毒性，见图5C，表明该纳米颗粒具有良好的生物相容性。



纳米颗粒的化学动力和光动力治疗能力检测结果显示，h-PCuNF和h-PCu可以使肿瘤细胞内产生活性氧，表明h-PCuNF可以介导化学动力治疗作用。在近红外照射下，h-PCuNF+近红外组和h-PCu+近红外组细胞内活性氧产量明显增加，表明纳米颗粒h-PCuNF可以介导光动力治疗作用，见图6A，C。
活死细胞染色结果显示，与对照组相比，近红外组没有出现明显的细胞死亡，h-PCu组出现少量细胞死亡，这主要是由于CuNPs介导的化学动力治疗作用，h-PCu+近红外组出现大量细胞死亡，这主要是由于CuNPs+近红外介导的光热和光动力治疗作用以及CuNPs介导的化学动力治疗作用。此外，h-PCuNF+近红外组和h-PCuNF组分别较h-PCu+近红外组和h-PCu组的细胞死亡更加明显，见图6B，表明荷叶碱介导的化疗可以显著促进CuNPs介导的细胞死亡。MTT实验进一步定量验证了活死细胞染色实验中观察到的结果，见图6D。



2.6   纳米颗粒CuNPs与荷叶碱的协同治疗作用   纳米颗粒h-PCuNF具有光热、光动力、化学动力和化疗治疗功能，采用MTT法探究了它们的协同治疗作用：第一，光热和光动力治疗作用均由CuNPs+近红外介导，它们属于相同治疗的不同机制，而不是协同治疗；第二，CuNPs介导的肿瘤微环境响应性化学动力治疗增强了CuNPs+近红外介导的光热和光动力治疗作用，但它们的联合没有明显协同作用，见图7A；第三，CuNPs和荷叶碱的联合具有明显的协同治疗效果，见图7B。

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恶性肿瘤具有较高的发病率和死亡率，严重威胁人类健康[1-2]，传统的临床治疗策略包括手术、放疗和化疗等，在一定程度上改善了患者预后，然而传统治疗方式具有较大的创伤性和较严重的不良反应，因此亟需探究有效、精准、微创、安全的新型治疗方式[3-4]。
近年来，多功能纳米材料介导的可视化精准治疗在肿瘤治疗领域被广泛研究，具有疗效显著、安全无创及时间和空间可控性强等特点，主要包括近红外激光介导的光热疗法和光动力疗法、肿瘤微环境响应性化学动力治疗及化疗药物靶向递送等。光热疗法是利用光热转换剂的光热效应将从近红外激光中获取的能量转换为热能，以增加周围环境的温度，来诱导肿瘤细胞死亡。光动力疗法是利用近红外激光的能量使光敏剂从基态跃迁至三重激发态，三重激发态的光敏剂与肿瘤微环境中的O2等发生电子转移或能量传递，生成细胞毒性活性氧，从而发挥治疗作用[5-6]。化学动力疗法是利用过渡金属离子在酸性肿瘤微环境中介导芬顿或类芬顿反应，催化H2O2分解，促进细胞毒性羟基自由基(•OH)的生成，杀灭肿瘤细胞[7]。前期研究利用水热法合成了聚丙烯酸包被的碱式磷酸铜纳米颗粒CuNPs，并且证实该纳米颗粒具有良好的MRI成像和光声成像能力以及显著的光热和光动力治疗效果[8-9]，然而其在生理环境中容易聚集沉降，严重影响了进一步研究与应用。
化疗是肿瘤的有效治疗方式，然而传统的化疗药物常导致消化功能障碍、肝肾功能不全和骨髓抑制等不良反应[10]。荷叶碱是从荷叶中提取的一种天然阿朴啡类生物碱，具有调节血脂、改善动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝等活性[11-12]。近年来大量研究表明，荷叶碱具有广谱抗肿瘤(包括肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等)作用，并且对人体正常细胞无明显毒副作用[13-14]，然而由于荷叶碱的水溶性较差，阻碍了其临床应用。
为将纳米颗粒CuNPs和荷叶碱同时递送到肿瘤部位以发挥协同治疗作用，实验采用双乳化法将CuNPs和荷叶碱共同搭载到中空聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒的壳层中，合成了新型纳米颗粒h-PCuNF，该策略解决了CuNPs聚集沉降和荷叶碱水溶性差的问题，可以有效介导MRI引导光热/光动力/化学动力/化疗联合治疗恶性肿瘤，为多功能纳米材料的制备和应用提供了参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   体外观察性实验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD法。
1.2   时间及地点   实验于2021年10月至2023年7月在山西医科大学医学影像学院实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   主要试剂和细胞   三水合硝酸铜[Cu(NO3)2•3H2O]、十二水合磷酸氢二钠[Na2HPO4•12H2O]和NaOH购自国药集团化学试剂有限公司；聚丙烯酸、聚乙烯醇、1，3-二苯基异苯并呋喃(1，3-Diphenylisobenzofuran，DPBF)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine，TMB)、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[5，5’-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]、2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’，7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)和MTT购自美国Sigma-Aldrich公司；聚乳酸-羟基乙酸共聚物购自济南岱罡生物工程有限公司；荷叶碱购自上海阿拉丁试剂有限公司；谷胱甘肽、谷胱甘肽检测试剂盒、钙黄绿素/碘化丙啶活死细胞染色试剂盒和青霉素-链霉素溶液购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自美国ScienCell公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；人肝脏恶性肿瘤细胞系HepG2购自上海中乔新舟生物科技有限公司，采用添加体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基进行培养。
1.3.2   主要仪器   透射电子显微镜(JEM-2100，日本JEOL)；激光粒度仪(BI-90 Plus，美国Brookhaven)；电感耦合等离子体发射光谱仪(ICPOES730，美国Aligent)；紫外可见分光光度计(UH 5700，日本Hitachi)；磁共振成像仪(Achieva 3.0T TX，荷兰Philips Healthcare)；近红外激光器(MDL-XF-808-5W，长春新产业光电技术有限公司)；红外热成像仪(E60，美国FLIR)；激光共聚焦显微镜(A1R，日本Nikon)；荧光显微镜(BX53，日本Olympus)；酶标仪(ELx808，美国BioTek)。
1.4   实验方法   
1.4.1   纳米颗粒h-PCuNF的制备   
水热法合成纳米颗粒CuNPs[9]：在磁力搅拌下，将10 mL的聚丙烯酸(35 mg/mL)加入到20 mL的Cu (NO3)2•3H2O(14.5 mg/mL)中；将30 mL的Na2HPO4•12H2O (7.13 mg/mL)缓慢加入到上述液体中；在pH计监测下，采用NaOH溶液(1 mol/L)将混合溶液的pH值调整为7.0；将溶液转移至100 mL铁氟龙衬里的高压反应釜中，放入高温反应箱中120 ℃反应6 h；10 000 r/min离心5 min，弃上清，采用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次；冷冻干燥(-80 ℃，48 h)，获得的青色产物即为纳米颗粒CuNPs。
双乳化法合成纳米颗粒h-PCuNF：将30 mg的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和5 mg的荷叶碱溶解在3 mL二氯甲烷中；将33 mg的纳米颗粒CuNPs重悬于1 mL二甲基亚砜中，取300 μL加入二氯甲烷溶液中并混匀；加入200 μL去离子水，将反应管置于冰上，采用超声声震仪(100 W，20 Hz)进行第一次乳化；加入8 mL的4%聚乙烯醇，采用超声声震仪(50 W，20 Hz)进行第二次乳化；加入10 mL的2%异丙醇，磁力搅拌3 h；10 000 r/min离心10 min，弃上清，采用去离子水清洗3次，冷冻干燥(-80 ℃，48 h)，即获得纳米颗粒h-PCuNF。在不添加荷叶碱的情况下，采用相同的制备程序可获得纳米颗粒h-PCu。
1.4.2   纳米颗粒物理性能的表征   采用透射电子显微镜观察纳米颗粒h-PCuNF和h-PCu的形态和元素组成。在激光粒度仪上通过动态光散射检测纳米颗粒h-PCuNF的水合粒径和Zeta电位。通过电感耦合等离子体发射光谱仪检测纳米颗粒h-PCuNF中铜元素的含量。
通过紫外可见分光光度计检测纳米颗粒h-PCuNF中荷叶碱的含量。采用二氯甲烷配置不同质量浓度(0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL)的荷叶碱溶液，分别取2.5 mL加入石英比色皿中，采用紫外可见分光光度计获得光吸收曲线，采用荷叶碱在273 nm特征性吸收峰处的光吸收值绘制浓度-吸光度线性回归曲线，获得相应的线性回归方程。将1.2 mg纳米颗粒h-PCuNF溶解在3 mL二氯甲烷中，10 000 r/min离心10 min，保留上清；取2.5 mL上清加入石英比色皿，检测273 nm处的吸光度值带入上述线性回归方程中，计算荷叶碱的浓度。根据先前报道的公式计算纳米颗粒h-PCuNF中CuNPs和荷叶碱的载药率和包封率[15]。将纳米颗粒CuNPs和h-PCuNF分别用生理盐水重悬(2 mg/mL)，加入到1.5 mL EP管中，常温下静置观察并拍照，检测两种纳米颗粒在生理环境中的稳定性。
1.4.3   纳米颗粒的MRI成像   采用去离子水配置不同质量浓度(0，0.5，1，1.5，2 mg/mL)的纳米颗粒h-PCuNF悬浮液；将纳米颗粒悬浮液注满1.5 mL EP管，制备成为体外检测模型；在MRI成像仪上，采用T1 mapping成像序列检测纳米颗粒的纵向弛豫时间(T1)，建立1/T1-Cu2+浓度的线性回归曲线，获得相应的线性回归方程，其斜率即为纵向弛豫率(r1)；采用T1WI序列检测纳米颗粒的T1加权MRI成像效果。
1.4.4   纳米颗粒的光热治疗性能   实验设置对照组、h-PCu组、h-PCuNF组、近红外组、h-PCu+近红外组、h-PCuNF+近红外组，对照组和近红外组的石英管中加入0.5 mL去离子水，其余组的石英管中加入0.5 mL相应的纳米颗粒溶液(2 mg/mL)，在需要近红外激光照射的组别中，采用808 nm的近红外激光(1 W/cm2)在液面上方0.5 cm的位置照射10 min；采用红外热成像仪监测温度变化，每30 s进行检测。
1.4.5   纳米颗粒的光动力治疗性能   实验设置对照组、h-PCu组、h-PCuNF组、近红外组、h-PCu+近红外组、h-PCuNF+近红外组，对照组、近红外组的石英管中加入0.5 mL去离子水，其余组的石英管中加入0.5 mL相应的纳米颗粒溶液(2 mg/mL)，各组纳米颗粒在50 ℃下进行预破坏，6组各加入5 μL DPBF指示剂(1 mg/mL)，将需要近红外激光照射的组别置于冰上，采用808 nm的近红外激光照射30 min；将石英管中的样品转移至1.5 mL离心管中10 000 r/min离心10 min，保留上清；采用紫外可见分光光度计检测上清液在410 nm处的吸光度值。
1.4.6   纳米颗粒消耗谷胱甘肽的能力   实验设置对照组(pH=7.4)、h-PCu(pH=7.4)组、h-PCuNF(pH=7.4)组、h-PCu(pH=6.5)组、h-PCuNF(pH=6.5)组，对照组的石英管中加入3 mL去离子水，其余组的石英管中加入3 mL相应的纳米颗粒溶液(0.5 mg/mL)，在pH计监测下通过盐酸(0.05 mol/L)调整溶液的pH值，各组纳米颗粒在50 ℃下进行预破坏；5组各加入100 μL谷胱甘肽水溶液(9 mmol/L)
室温下反应6 h；10 000 r/min离心10 min，保留上清，加入100 μL DTNB指示剂(9 mmol/L)与上清液中残余的谷胱甘肽反应10 min，采用紫外可见分光光度计检测上清液412 nm处的吸光度值，吸光度值越高表明未被消耗的谷胱甘肽越多。
1.4.7   纳米颗粒的化学动力治疗性能   通过TMB指示剂检测Cu2+介导类芬顿反应产生的•OH。实验设置对照组、H2O2组、h-PCu组、h-PCuNF组、H2O2+h-PCu组、H2O2+h-PCuNF组、H2O2+h-PCu+谷胱甘肽组、H2O2+h-PCuNF+谷胱甘肽组，对照组和H2O2组的石英管中加入3 mL去离子水，其余各组的石英管中加入3 mL相应的纳米颗粒溶液(2 mg/mL)，在pH计监测下采用盐酸(0.05 mol/L)将各组溶液的pH值调整为6.5，各组纳米颗粒在50 ℃下进行预破坏；需要添加谷胱甘肽的组加入100 μL谷胱甘肽水溶液(6 mmol/L)，其余组加入100 μL去离子水，室温下反应6 h；8组各加入60 μL TMB指示剂(10 mg/mL)；在需要添加H2O2的组加入100 μL H2O2水溶液(12 mmol/L)，其余各组加入100 μL去离子水，室温反应2 h；10 000 r/min离心10 min，保留上清液，采用紫外可见分光光度计检测上清液652 nm处的吸光度值，吸光度值越高表明生成的•OH越多。
1.4.8   肿瘤细胞摄取纳米颗粒实验   将HepG2细胞接种到共聚焦显微镜专用培养皿中，细胞密度为5×104/皿，放入培养箱中进行孵育；孵育24 h后弃去培养基，用PBS清洗3次；采用培养基悬浮DiI标记的纳米颗粒h-PCuNF(2 mg/mL)，取2 mL加入到细胞培养皿中分别孵育1，3，5 h，弃培养基，用PBS清洗3次，以去除未被细胞摄取的纳米颗粒；加入40 g/L多聚甲醛1 mL静置10 min，用PBS清洗3次；加入1 mL DAPI染色液静置10 min，用PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.4.9   纳米颗粒对肿瘤细胞内活性氧含量的影响   将HepG2细胞接种到48孔板中，细胞密度为2×104 /孔，接种24 h后弃培养基，用PBS清洗3次，分为对照组、近红外组、h-PCu组、h-PCu+近红外组、h-PCuNF组、h-PCuNF+近红外组，对照组、近红外组加入500 µL新鲜的培养基，各纳米颗粒组加入500 µL含2 mg/mL对应纳米颗粒的培养基，各组纳米颗粒在50 ℃下进行预破坏；孵育12 h后弃培养基，用PBS清洗3次；加入300 µL DCFH-DA指示剂
(10 μmol/L)孵育20 min；在需要近红外激光干预的组中将细胞培养板放置于冰上，采用808 nm的近红外激光照射10 min；荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光信号。
1.4.10   纳米颗粒对肿瘤细胞活性的影响   将HepG2细胞接种于48孔板中，细胞密度为2×104/孔，接种24 h后弃去培养基，用PBS清洗3次，分为对照组、近红外组、h-PCu组、h-PCu+近红外组、h-PCuNF组、h-PCuNF+近红外组，分组干预同活性氧含量检测；孵育12 h后弃培养基，用PBS清洗3次，加入300 µL培养基；在需要近红外照射的组中，采用808 nm的近红外激光照射10 min；每孔加入200 μL培养基，继续孵育12 h，弃培养基，用PBS清洗3次；避光条件下将10 μL Calcein AM(2 mmol/L)和20 μL的PI(2 mmol/L)加入到10 mL PBS中并混匀，每孔加入200 μL Calcein AM/PI染色液孵育15 min；弃去染色液，用PBS清洗3次，荧光显微镜下观察并拍照。
1.4.11   纳米颗粒对肿瘤细胞活力的影响   
纳米颗粒h-PCuNF的细胞毒性：将HepG2细胞接种于96孔板中，细胞密度为6×103/孔，接种24 h后，弃培养基，加入含有不同质量浓度[0(对照)，0.4，0.8，1.2，1.6，2 mg/mL]纳米颗粒h-PCuNF的培养基，同时设置空白孔(仅加入单纯的培养基，无细胞)；孵育24 h后弃培养基，用PBS清洗3次，加入含MTT的培养基(0.5 mg/mL)避光孵育4 h，弃培养基，每孔中加入100 µL二甲基亚砜，振荡10 min溶解细胞中的紫色晶体，采用酶标仪在490 nm处检测每孔的吸光度值。细胞活力=(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照组吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。
纳米颗粒h-PCuNF的治疗效果：将HepG2细胞接种于96孔板中，细胞密度为6×103/孔，接种24 h后弃培养基，分为对照组、近红外组、h-PCu组、h-PCu+近红外组、h-PCuNF组、h-PCuNF+近红外组，对照组、近红外组加入100 μL新鲜培养基，其余组加入100 μL含对应纳米颗粒(2 mg/mL)的培养基，各组纳米颗粒在50 ℃下进行预破坏；孵育12 h后弃培养基，用PBS清洗3次，加入100 µL培养基；在近红外照射组中采用808 nm的近红外激光照射10 min。继续孵育12 h，随后进行上述MTT孵育与吸光度值检测，计算细胞活力。
CuNPs介导的光热、光动力、化学动力协同治疗肿瘤的作用：将HepG2细胞接种于96孔板中，细胞密度为6×103/孔，孵育24 h后弃培养基，分为对照组、化学动力治疗组、近红外(6 min)组、近红外(6 min)+化学动力治疗组、近红外(10 min)组、近红外(10 min)+化学动力治疗组，对照组加入100 μL新鲜培养基，其余组加入100 μL含纳米颗粒CuNPs(0.8 mg/mL)的培养基，孵育3 h进行细胞摄取；弃培养基，用PBS清洗3次，加入100 µL新鲜培养基；需近红外照射的组采用808 nm的近红外激光照射细胞6 min或10 min；不需要化学动力治疗干预的组进行MTT孵育与吸光度值检测，需要化学动力治疗干预的组继续孵育12 h后进行MTT孵育与吸光度值检测。细胞抑制率=(对照组吸光度值-实验孔吸光度值)/(对照组吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。
CuNPs和荷叶碱协同治疗肿瘤的作用：将HepG2细胞接种于96孔板中，细胞密度为6×103/孔，孵育24 h后弃培养基，分为对照组、近红外(6 min)+化学动力治疗组、化疗组、近红外(6 min)+化学动力治疗+化疗组，对照组和化疗组加入100 μL新鲜培养基，其余组加入100 μL含CuNPs(0.8 mg/mL)的培养基，孵育3 h进行细胞摄取；弃培养基，用PBS清洗3次，在需化疗干预的组加入100 µL含荷叶碱(70 µmol/L)的培养基，其余组加入100 µL新鲜培养基；需近红外照射的组采用808 nm的近红外激光照射细胞6 min；继续孵育12 h后进行MTT孵育与吸光度值检测，计算细胞抑制率。
1.5   主要观察指标   纳米颗粒h-PCuNF的结构、粒径和性能及体外抗肿瘤效果。
1.6   统计学分析   采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验数据用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD法。P < 0.05被认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经山西医科大学第一医院生物统计学专家审核。

基于多功能纳米材料的精准治疗是恶性肿瘤的新型治疗模式。多功能纳米材料可以将多种成像和治疗模式整合到一个纳米级平台中，实现可视化联合治疗[16]。近年来，铜基纳米材料在肿瘤治疗领域受到了广泛关注，它们通常具有多种成像和治疗功能，包括MRI成像、光声成像、光热治疗、光动力治疗、化学动力治疗等。
MRI成像空间分辨率强且无电离辐射，在疾病的临床诊断中被广泛应用[17-18]，然而由于肿瘤的浸润性生长，常规MRI成像往往难以准确地判断肿瘤的性质和边界，因此需要采用MRI对比剂来缩短肿瘤区域的纵向或横向弛豫时间，进而产生对比增强信号。通常，含有不成对电子的离子具有顺磁性(例如Gd3+，Mn2+和Cu2+)，可以缩短纵向弛豫时间以增强T1加权成像信号[19-22]。此次实验中纳米颗粒h-PCuNF所搭载的CuNPs中含有Cu2+，因此h-PCuNF可以显著增强磁共振T1加权成像信号。
肿瘤微环境具有缺氧、弱酸性及H2O2和谷胱甘肽过量积累等特点[23-24]，对肿瘤进展具有显著的促进作用，因此破坏肿瘤微环境是肿瘤的有效治疗方式。在酸性环境中，多种过渡金属离子可以催化H2O2分解，促进细胞毒性•OH的生成，由Fe2+介导的称为芬顿反应，由其他离子(例如Cu2+和Mn2+)介导的称为类芬顿反应。据此，很多研究将Cu2+、Mn2+或Fe2+通过纳米材料递送到肿瘤部位，介导芬顿或类芬顿反应来破坏肿瘤微环境，同时通过产生细胞毒性•OH杀伤肿瘤细胞，该疗法被称为化学动力治疗。由于正常组织中没有芬顿或类芬顿反应发生的条件，因此化学动力治疗具有选择性杀伤肿瘤细胞的能力[25-26]。此外，化学动力治疗还可以克服肿瘤乏氧和外源性能量依赖[27]。近年来，铜基纳米材料介导肿瘤微环境响应性化学动力治疗杀灭肿瘤的策略受到广泛关注，该策略具有以下优势：①肿瘤细胞中过量的谷胱甘肽可以显著清除细胞毒性活性氧，从而降低化学动力治疗的疗效。Cu2+通过消耗肿瘤细胞中过量的谷胱甘肽来产生Cu+，Cu+进而催化•OH的生成，同时Cu+又被氧化为Cu2+，形成Cu2+/Cu+循环。②与经典的Fe2+/Fe3+循环相比，Cu2+/Cu+循环所需的氧化还原电位更低，循环效率更高。③与Fe2+相比，Cu+的催化能力更强。④铜基纳米材料的合成条件相对温和、安全[28-29]。前期研究利用水热法合成了铜基纳米材料CuNPs，并且证明其可以通过介导光疗(光热治疗和光动力治疗)来杀灭肿瘤细胞，此次实验进一步证明CuNPs可以有效介导化学动力治疗。然而，CuNPs介导的化学动力治疗难以与光疗发挥协同治疗作用，这可能是因为光疗和化学动力治疗机制之间的相互干扰：光热治疗促进H2O2分解为H2O和O2；光动力治疗生成的活性氧可以消耗谷胱甘肽，这些因素导致化学动力治疗的反应底物减少，从而影响化学动力治疗的疗效。据此可推断，将治疗机制不同的治疗方式相结合可能更容易获得协同治疗效果。化疗药物通常通过抑制肿瘤细胞中异常激活的多种信号传导通路来诱导肿瘤细胞凋亡[30-32]，这与CuNPs介导光热/光动力/化学动力治疗肿瘤的机制存在明显差异，因此，此次实验采用天然广谱抗癌药物荷叶碱来提高CuNPs的疗效，并且证明二者可以发挥协同抗癌作用。
将CuNPs和荷叶碱同时有效递送到肿瘤部位是二者发挥协同作用的前提。聚乳酸-羟基乙酸共聚物是一种有机聚合物，具有良好的载药能力和生物相容性，已被批准用作临床药物载体[33-34]。更重要的是，聚乳酸-羟基乙酸共聚物可以在体内进行生物降解，通过水解反应降解为乳酸和羟基乙酸，随后进入细胞内参与三羧酸循环，最终转化为水和二氧化碳[35]。此次实验采用双乳化法将CuNPs和荷叶碱搭载到中空聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒的壳层中，合成了新型h-PCuNF纳米颗粒，实现了二者的有效递送，同时有效地解决了CuNPs聚集沉降和荷叶碱水溶性差的问题。
纳米颗粒的聚集沉降是影响其研究与应用的主要因素之一。纳米颗粒在水溶液中的聚集主要是由于纳米颗粒表面的高疏水性，降低了溶液对其表面的润湿性，导致其表面能较高，纳米颗粒倾向于聚集以降低表面能。为减少纳米颗粒聚集，需要：在纳米颗粒表面修饰亲水性基团，降低表面能；在纳米颗粒表面修饰高分子聚合物，增加空间位阻；增加纳米颗粒表面同种电荷，增强静电排斥[36]。为减少h-PCuNF纳米颗粒的聚集，此次实验在聚乳酸-羟基乙酸共聚物的表面包裹了亲水高分子聚合物稳定剂聚乙烯醇，以增强纳米颗粒表面的亲水性和空间位阻[37]。此外该纳米颗粒表面带有负电荷，具有静电排斥作用。纳米颗粒的沉降主要是由于：纳米颗粒的聚集导致质量增加；纳米颗粒本身的质量较大。此次实验除采用聚乙烯醇和静电排斥减少纳米颗粒的聚集外，还将纳米颗粒设计为空心结构，减少其质量，防止沉降。
综上所述，实验采用双乳化法合成了纳米颗粒h-PCuNF，该纳米颗粒具有中空球形结构，其壳层中搭载有CuNPs和荷叶碱，在生理环境中具有良好的悬浮稳定性，可以增强T1加权MRI成像信号，当其被肿瘤细胞摄取并被近红外激光照射激活后，CuNPs介导的光热/光动力/化学动力治疗可与荷叶碱介导的化疗协同治疗恶性肿瘤(图8)。

实验的局限性：目前所制备的纳米颗粒缺乏主动靶向功能；尚未在动物模型中验证其安全性和有效性，这将是未来研究工作的重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：

近红外光响应性纳米颗粒：在近红外激光照射下，可以介导光热转换或电子转移等光响应效应的纳米颗粒，在肿瘤的治疗中常被用于介导光热治疗和光动力治疗。

荷叶碱：是从荷叶中提取的一种天然阿朴啡类生物碱，具有调节血脂、改善动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝等活性，并且具有广谱抗肿瘤作用，对人体正常细胞无明显毒副作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

此次研究采用双乳化法制备出了新型多功能纳米颗粒h-PCuNF，该纳米颗粒采用中空球形聚乳酸-羟基乙酸共聚物载体搭载碱式磷酸铜纳米颗粒(CuNPs)和荷叶碱，有效解决了CuNPs在生理环境中容易聚集沉降及荷叶碱水溶性差的问题，实现了二者向肿瘤部位的有效递送。CuNPs赋予了h-PCuNF纳米颗粒良好的T1加权MRI成像功能及光热治疗、光动力治疗和化学动力治疗功能。由于CuNPs介导的3种治疗功能的机制之间存在相互影响，较难发挥协同治疗作用，此次研究采用天然抗癌药物荷叶碱介导的化疗与CuNPs发挥协同治疗作用，进一步增强其治疗效果。综上所述，此次研究制备出新型h-PCuNF纳米颗粒介导MRI成像引导光热、光动力、化学动力和化疗联合治疗恶性肿瘤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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