IP3R2及RYR2介导Ca2+信号在急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型中的表达

doi:10.12307/2025.246

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (2): 254-261.doi: 10.12307/2025.246

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IP3R2及RYR2介导Ca2+信号在急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型中的表达

赵吉利1，孟天予1，岳雅蓉1，张鑫1，杜文倩1，张鑫宇1，薛慧2，项文平3

1内蒙古科技大学包头医学院中心临床医学院，内蒙古自治区包头市 014040；2包头市中心医院神经内科，内蒙古自治区包头市 014040；3包头市蒙医中医医院，内蒙古自治区包头市 014040

收稿日期:2024-01-19 接受日期:2024-04-22 出版日期:2025-01-18 发布日期:2024-05-24
通讯作者: 薛慧，博士，副主任医师，包头市中心医院神经内科，内蒙古自治区包头市 014040 并列通讯作者：项文平，博士，副主任医师，包头市蒙医中医医院，内蒙古自治区包头市 014040
作者简介:赵吉利，女，1997年生，内蒙古自治区鄂尔多斯市人，汉族，2024年内蒙古科技大学包头医学院毕业，硕士，医师，主要从事脑血管疾病、头痛、头晕及眩晕的研究。
基金资助:
中央引导地方科技发展资金(2021ZY0038)，项目负责人：项文平

Expression of IP3R2 and RYR2 mediated Ca2+ signals in a mouse model of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning

Zhao Jili1, Meng Tianyu1, Yue Yarong1, Zhang Xin1, Du Wenqian1, Zhang Xinyu1, Xue Hui2, Xiang Wenping3

1Clinical School of Medicine, Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014040, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Department of Neurology, Baotou Central Hospital, Baotou 014040, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 3Baotou Mongolian Medicine Hospital, Baotou 014040, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2024-01-19 Accepted:2024-04-22 Online:2025-01-18 Published:2024-05-24
Contact: Xue Hui, MD, Associate chief physician, Department of Neurology, Baotou Central Hospital, Baotou 014040, Inner Mongolia Autonomous Region, China Co-corresponding author: Xiang Wenping, MD, Associate chief physician, Baotou Mongolian Medicine Hospital, Baotou 014040, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Zhao Jili, Master, Physician, Clinical School of Medicine, Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014040, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
The Central Government Guides Local Funds for Science and Technology Development Program, No. 2021ZY0038 (to XWP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
急性一氧化碳中毒迟发性脑病：是指急性一氧化碳中毒患者经抢救急性中毒症状恢复后，经过数天或数周(2-60 d)的假愈期，再次发生以痴呆、精神症状、锥体系及锥体外系症状为主的神经系统疾病。一般发生在急性中毒的2个月内。
1，4，5-三磷酸肌醇受体(Inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)：是位于内质网上的配体门控Ca2+通道，当细胞外信号分子激活细胞膜上的受体，受体与特定的G 蛋白偶联受体结合，引起磷脂酶C激活，水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸生成肌醇三磷酸和甘油二酯，IP3 与在内质网膜上的IP3Rs 结合，促使内质网Ca2+库释放 Ca2+，引起细胞内Ca2+浓度瞬间增高，产生钙信号。目前已知IP3Rs有3种亚型，其中IP3R2在星形胶质细胞中表达丰富。

背景：研究发现星形胶质细胞中Ca2+的表达与认知功能密切相关，目前由1，4，5-三磷酸肌醇受体(Inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)2、兰尼碱受体(ryanodine receptors，RYRs)2受体及其调控的Ca2+信号通路已经成为认知障碍相关疾病研究的热点。
目的：研究急性一氧化碳中毒迟发性脑病动物模型中，海马组织内星形胶质细胞和IP3R2、RYR2介导的Ca2+信号的表达情况，探索急性一氧化碳中毒迟发性脑病可能的发病机制。
方法：Morris水迷宫实验筛选认知功能合格的C57BL小鼠随机分为对照组、实验组，实验组小鼠采用静态吸入一氧化碳建立急性一氧化碳中毒迟发性脑病模型，对照组小鼠吸入等量空气。造模后第21天，利用Morris水迷宫、苏木精-伊红染色、Western blot、免疫荧光双标法、Ca2+荧光探针检测中毒小鼠行为学及神经元改变、星形胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白及IP3R2、RYR2受体、星形胶质细胞内Ca2+ 浓度变化。
结果与结论：①Morris水迷宫实验发现与对照组相比，实验组小鼠逃避潜伏期明显延长(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色表明实验组小鼠海马锥体细胞数减少、细胞结构紊乱、细胞核碎裂伴溶解；③免疫荧光检测表明海马区 IP3R2、RYR2分别和胶质纤维酸性蛋白存在共表达，且实验组海马区 IP3R2、RYR2和胶质纤维酸性蛋白表达均上调(P < 0.05) ；④Western blot检测显示实验组海马区IP3R2、RYR2及胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达均增多(P < 0.05) ；⑤Ca2+荧光探针法检测表明实验组小鼠海马区星形胶质细胞内 Ca2+ 浓度明显升高(P < 0.05)；⑥结果说明，星形胶质细胞可能通过介导IP3R2、RYR2受体影响Ca2+信号，进而使一氧化碳中毒的小鼠认知功能受损，最终导致急性一氧化碳中毒迟发性脑病发生。
https://orcid.org/0009-0009-2208-6611(赵吉利)；https://orcid.org/0000-0001-5618-2534(薛慧)；
https://orcid.org/0000-0002-9952-0983(项文平)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 急性一氧化碳中毒迟发性脑病, 星形胶质细胞, IP3R2受体, RYR2受体, 钙信号, 认知功能

Abstract: BACKGROUND: Ca2+ expression in astrocytes has been found to be closely related to cognitive function, and the Ca2+ signaling pathway regulated by inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3R2) and ryanodine receptor (RYR) 2 receptors has become a hot spot in the study of cognitive disorder-related diseases.
OBJECTIVE: To investigate the expression of Ca2+ signals mediated by IP3R2 and RYR2 in hippocampal astrocytes in animal models of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning, and to explore the possible pathogenesis of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning.
METHODS: C57BL mice with qualified cognitive function were selected by Morris water maze experiment and randomly divided into control group and experimental group. An animal model of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning was established by static carbon monoxide inhalation in the experimental group, and the same amount of air was inhaled in the control group. Behavioral and neuronal changes, astrocyte specific marker glial fibrillary acidic protein, IP3R2, RYR2 receptor and Ca2+ concentration in astrocytes of the two groups were detected using Morris water maze, hematoxylin-eosin staining, western blot, immunofluorescence double labeling and Ca2+ fluorescence probe at 21 days after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: In the Morris water maze, the escape latency of the experimental group was significantly longer than that of the control group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining results showed that in the experimental group, the number of hippocampal pyramidal cells decreased, the cell structure was disordered, and the nucleus was broken and dissolved. Immunofluorescence results showed that IP3R2 and RYR2 were co-expressed with glial fibrillary acidic protein in the hippocampus, and the expressions of IP3R2, RYR2 and glial fibrillary acidic protein were up-regulated in the hippocampus of the experimental group (P < 0.05). Western blot analysis showed that the expressions of IP3R2, RYR2, and glial fibrillary acidic protein in the hippocampus of the experimental group were increased (P < 0.05). Ca2+ concentration in hippocampal astrocytes increased significantly in the experimental group (P < 0.05). To conclude, astrocytes may affect Ca2+ signals by mediating IP3R2 and RYR2 receptors, then impair the cognitive function of mice with carbon monoxide poisoning, and eventually lead to delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning.

Key words: delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning, astrocyte, IP3R2 receptor, RYR2 receptor, calcium signaling, cognitive function

中图分类号:

赵吉利, 孟天予, 岳雅蓉, 张鑫, 杜文倩, 张鑫宇, 薛慧, 项文平. IP3R2及RYR2介导Ca2+信号在急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 254-261.

Zhao Jili, Meng Tianyu, Yue Yarong, Zhang Xin, Du Wenqian, Zhang Xinyu, Xue Hui, Xiang Wenping. Expression of IP3R2 and RYR2 mediated Ca2+ signals in a mouse model of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(2): 254-261.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析实验选用100只小鼠进行Morris水迷宫实验后，筛选出合格小鼠91只，随机分成2组，最终以每组36只进入结果分析。
2.2 Morris水迷宫逃避潜期伏比较与对照组相比，实验组小鼠Morris水迷宫逃避潜伏期显著延长(t=4.702，P < 0.05)，见图1；说明在21 d时小鼠记忆力显著下降，出现认知功能受损，发生了行为学改变。
2.3 海马区苏木精-伊红染色对照组海马CA1区锥体细胞多层排列，细胞排列整齐，结构清晰完整，胞质均一染色，胞核呈蓝色；实验组小鼠海马CA1区锥体细胞层数减少，结构不清，细胞皱缩明显，胞浆浓缩呈深蓝色，细胞核固缩、碎裂，甚至发生神经元变性坏死，见图2。结合水迷宫结果，证实小鼠急性一氧化碳中毒迟发性脑病造模成功。
2.4 免疫荧光检测GFAP、IP3R2、RYR2表达情况海马CA1区存在GFAP与IP3R2及GFAP与RYR2的共表达；与对照组相比，实验组小鼠海马区 IP3R2、RYR2 和 GFAP 表达均显著增多(P < 0.05)(表1，2，图3，4)。

2.5 Western Blot检测GFAP、IP3R2、RYR2蛋白表达情况与对照组相比，实验组小鼠海马组织中GFAP、IP3R2和RYR2蛋白表达量均显著增高(P < 0.05)，见表3，图5-7。

2.6 星形胶质原代细胞分离及鉴定细胞形态呈明显的分支状，并且GAFP免疫荧光染色呈阳性，表明实验所分离培养的细胞为星形胶质细胞，见图8。

2.7 Ca2+浓度检测与对照组相比，实验组小鼠海马区星形胶质细胞内Ca2+荧光强度显著增强(210 689.41±
16 641.25，370 419.11±58 415.92，t=-8.316，P < 0.05)，见图9。

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引言

急性一氧化碳中毒迟发性脑病是一氧化碳中毒后最常见且最严重的并发症之一[1]，主要临床表现之一为认知障碍。目前关于急性一氧化碳中毒迟发性脑病发病机制主要集中在探讨缺血-缺氧学说、氧化应激学说[2]、兴奋性毒性学说[3-4]、线粒体功能损伤学说[5]、细胞凋亡坏死学说等[6-7]，仍未有明确阐述。目前国内外关于急性一氧化碳中毒迟发性脑病认知障碍机制的研究鲜有报道，而临床中急性一氧化碳中毒迟发性脑病一旦发生，治疗难度大、效果及预后差，迫切需要坚实的理论基础，为该病的预防和治疗进行指导。
星形胶质细胞作为中枢神经系统数量最多、分布最广的神经胶质细胞，在各种生理及病理状态下扮演重要角色。当中枢神经系统经历疾病和损伤时，星形胶质细胞会进行形态、分子和功能的重塑，成为反应性星形胶质细胞[8]，进一步对损伤和疾病作出反应和调节。星形胶质细胞中钙离子(Calcium，Ca2+) 信号调节障碍是以阿尔茨海默病为主要代表的认知障碍相关疾病的主要发病机制之一[9-10]。Ca2+作为机体生理病理过程的关键信号分子，对神经递质的释放、突触可塑性和认知功能调节[11]、神经元-星形胶质细胞整合等有重要影响。细胞内钙超载增加内质网应激和线粒体Ca2+摄取，降低抗凋亡蛋白Bcl2的表达，导致细胞毒性和细胞凋亡[12-14]。
1，4，5-三磷酸肌醇受体(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)和兰尼碱受体(ryanodine receptors，RYRs)是位于内质网上的配体门控Ca2+通道[15]，介导内质网中Ca2+的释放，产生钙信号[16]。目前已知IP3Rs和RYRs都有3种亚型，其中IP3R2和RYR2在星形胶质细胞中表达丰富。星形胶质细胞表面表达了大量的G蛋白偶联受体，如P2Y嘌呤受体(P2Y1，P2Y2)，这些G蛋白偶联受体被激活后，介导内质网上的IP3Rs受体释放Ca2+ 产生钙信号[17]。OKUBO 等[18]研究发现，在IP3R2敲除(IP3R2-/-)的小鼠海马星形胶质细胞中，钙释放显著减少，表明IP3R2 介导的 Ca2+的释放是中枢神经系统星形胶质细胞中主要(约75%)的 Ca2+信号通路。REICHENBACH等[19]在APP/PS1小鼠模型研究中发现，星形胶质细胞G蛋白偶联受体特异性基因缺失(P2Y1受体抑制)或星形胶质细胞钙信号减少(IP3R2-/-)可以增强突触结构的完整性，使星形胶质细胞和神经元网络功能障碍正常化，改善空间和记忆能力。
RYR2在海马体和皮质中存在大量表达，与海马突触可塑性、学习和记忆有重要关联[20]。先天性(RYR2-/-)小鼠在突触可塑性、行为和认知功能方面表现出过早且严重的缺陷，MORE等[21]研究发现，下调海马组织中RYR2的表达，小鼠记忆空间和记忆任务出现明显缺陷；Datta等[22]在老年猕猴中研究了RyR2介导的内质网钙泄漏对神经元放电和认知功能的影响，发现老年猕猴背外侧前额皮质存在过度磷酸化的tau蛋白(阿尔茨海默病病理标志物)以及钙泄漏标记物(pS2808-RyR2)的显著表达，而阻断RYR2可改善老年猕猴的神经元放电和认知功能。LACAMPAGNE等[23]在两种阿尔茨海默病小鼠模型中使用了一种药物Rycal S107(阻断RYR2介导的内质网 Ca2+泄漏)，改善了小鼠的突触可塑性和认知功能。综上，星形胶质细胞中IP3R2、RYR2受体及其调控的Ca2+信号通路是星形胶质细胞中重要的Ca2+通路，并且在认知功能中发挥重要作用。
课题组前期研究发现在SD大鼠急性一氧化碳中毒迟发性脑病模型中，海马区星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和P2Y1受体表达水平显著升高[24-25]。据此合理假设，P2Y1受体下游信号IP3R2调控Ca2+释放引起认知功能障碍，此外RYR2受体作为星形胶质细胞内质网上另一非常重要的Ca2+释放通道，也可能参与Ca2+释放过程。因此该项研究继续以星形胶质细胞为基础，进一步从IP3R2、RYR2介导的Ca2+信号通路出发，探索急性一氧化碳中毒迟发性脑病的可能发病机制，为临床预防急性一氧化碳中毒迟发性脑病的发生提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2021年12月至2023年8月在包头市中心医院神经内科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雄性10-12周龄C57BL/6J小鼠100只，体质量(25.0±2.5) g，购于斯贝福北京生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0010，饲养于室内，12 h明暗交替，室温为 18-23 ℃ ，分笼标准鼠饲料喂养，自由进食水。实验方案经内蒙古医科大学生物医学科动物实验伦理委员会批准(批准号为YKD2019003)。
1.3.2 主要仪器和试剂 Morris 水迷宫分析系统(北京众实迪创科技发展有限公司)；纯度99.9%的一氧化碳气体 (购于佛山市科的气体化工有限公司)；石蜡包埋机、冰冻切片机、普通光学显微镜(Leica)；蛋白垂直电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)；荧光显微镜(明美，MI52-N，荧光光源型号MIF-BGU-LED-CKX)；酶标仪、体式显微镜、生物安全柜、CO2培养箱(赛默飞)；DMEM/F12培养基(thermofisher)；GFAP抗体(Proteintech，
16825-1-AP)；IP3R2抗体(Santa，sc-398434)；RYR2 抗体(Affinty，AF0015)；山羊抗兔IgG(FITC)(Ebiogo，B029)；山羊抗小鼠IgG(CY3)(Ebiogo，B026)；Ca2+探针(YEASEN，40704ES50)；苏木精染液(Ebiogo；B006)；醇溶伊红染液(ebiogo；B005)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物筛选及分组 100只小鼠适应性饲养1周后进行连续5 d的Morris 水迷宫定位航行训练，第6天进行逃避潜伏期(爬上平台时间)测试，筛选出合格小鼠91只(逃避潜伏期 < 60 s )，按照抽签法将合格小鼠随机分成对照组(n=36)及实验组(n=55)。实验组小鼠在中毒后第21天进行取材实验。
1.4.2 急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型制备参照OCHI等[26]的方法采取一氧化碳静态吸入法建立急性一氧化碳中毒迟发性脑病模型，模型建立的成功标准：Morris 水迷宫实验证实小鼠发生认知功能障碍，且苏木精-伊红染色海马组织内有细胞损伤。实验组小鼠采用静态吸入一氧化碳浓度0.1%，持续通气 40 min后，将一氧化碳浓度上调到 0.3%，持续通气20 min，对照组在同一时间吸入等量空气。

1.4.3 Morris水迷宫实验实验采用直径100 cm、高40 cm
的水迷宫，将其分为完全相同的4个象限，用遮光布围挡起来，第1象限水面下置一直径为10 cm的隐藏平台，在水迷宫中注水使水面高于平台约1.5 cm，向水中倒钛白粉，使水呈不透明状态。将小鼠置于水迷宫实验的平台上适应数秒，然后依次面壁从4个象限中点放入水中，记录小鼠巡游轨迹及爬上平台时间，找到平台后让小鼠在平台上停留15 s，适应平台安全区，若60 s小鼠仍未找到平台，则用木棍将小鼠引导上平台，并让其停留15 s，训练期为5 d，每天4次。第6天进行逃避潜伏期测试，将小鼠面向水迷宫池壁，在第3象限中点位置放入水中，自动记录小鼠巡游轨迹及逃避潜伏期。在造模后第21天，随机选取实验组36只小鼠与对照组36只小鼠再次进行上述测试过程，记录数据分析。

1.4.4 苏木精-伊红染色 Morris水迷宫实验结束后，麻醉小鼠进行灌注取脑，标本均用40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，不同浓度梯度乙醇脱蜡至水后用蒸馏水清洗，苏木精染液染核，分化与返蓝后用伊红染液染质，再次脱水透明，中性树胶封固，镜下观察。
1.4.5 免疫荧光检测 IP3R2、RYR2 受体和 GFAP表达脑组织经蔗糖梯度脱水后经冰冻切片机切片，浸泡在PBS中，用0.3% Triton-PBS通透；体积分数10%山羊血清封闭，孵育一抗GFAP ( 1∶1 000) 、IP3R2( 1∶500) 、RYR2(1∶500)，于4 ℃冰箱摇床上孵育过夜，第2天避光孵育相应二抗，将脑片捞出后贴片，用 DAPI 染色固定细胞核后封固，镜下观察。Image J 软件进行平均吸光度分析。
1.4.6 Western blot检测IP3R2、RYR2受体、GFAP、内参GAPDH蛋白的表达取小鼠海马组织用超声波细胞破碎机制备脑组织匀浆，离心后取上清液参照BCA法对蛋白含量进行测定，计算上样体积，蛋白变性，配置十二烷基苯磺酸钠凝胶并上样电泳，转膜，体积分数5%牛血清封闭，4 ℃冰箱摇床上孵育一抗IP3R2(1∶1 000) ，RYR2(1∶
2 000)，GFAP (1∶4 000) ，内参 GAPDH ( 1∶10 000) 过夜；第2天室温孵育二抗，用发光液浸湿PVDF膜，于 Image Lab 凝胶成像系统进行曝光采集图片。Image J 软件测定蛋白表达条带灰度值。
1.4.7 海马组织星形胶质原代细胞分离培养小鼠脱颈处死后，体式显微镜下剥离海马组织，剪成 0.5 mm3的碎块，置于培养皿中，用针管磨碎，于离心管中加入胰酶水浴培养，消化完毕后混匀过细胞筛。收集液体离心弃上清收集细胞沉淀，用培养基重悬，置于培养箱孵育，差速黏附处理(时间：50 min，转速：120 r/min)，吸出细胞悬液；再次重复上述步骤，培养7-10 d，舍弃含脱落细胞的细胞悬液。
1.4.8 星形胶质细胞免疫荧光鉴定弃去培养基，40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，封闭，37 ℃孵育一抗和FITC二抗，DAPI室温避光染色，镜下观察拍照。
1.4.9 星形胶质细胞Ca2+浓度测定配制Fluo-4 AM 母液及工作液。①Fluo-4 AM 母液的配制：向Fluo-4 AM中加入适量二甲基亚砜，配制成 1-5 mmol/L 的储存液，二甲基亚砜的加入量根据Fluo-4 AM (MW 1 096.94)相对分子质量进行计算；②Fluo-4 AM工作液的配制：利用HBSS将Fluo-4 AM稀释成1-5 µmol/L的工作液，如1 mmol/L母液配制1 mL浓度为 4 µmol/L工作液，用 1 mL HBSS溶液稀释4 µL 1 mmol/L母液即可，取出预培养的细胞，除去培养基，将Fluo-4 AM工作液加入细胞(以覆盖细胞为准)进行培养，除去Fluo 4-AM工作液，加入HBSS 溶液覆盖细胞，37 ℃培养箱孵育，荧光显微镜检测细胞，激发波长494 nm，发射波长516 nm。Image J软件进行荧光强度分析。
1.5 主要观察指标 ①小鼠Morris水迷宫逃避潜期伏；②海马区苏木精-伊红染色观察；③海马GFAP、IP3R2、RYR2蛋白的表达；④星形胶质原代细胞分离及鉴定；⑤星形胶质细胞内Ca2+浓度。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析。计量资料均符合正态分布，用 x±s描述。组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经包头医学院，中心临床医学院生物统计学专家审核。

讨论

此次实验选择一氧化碳吸入中毒建立急性一氧化碳中毒迟发性脑病模型，这符合一氧化碳中毒的常见临床模式。结合Morris水迷宫结果实验组小鼠逃避潜伏期明显延长，出现认知功能下降，苏木精-伊红染色实验组小鼠海马区大量锥体细胞发生损伤坏死，证实了急性一氧化碳中毒迟发性脑病诱导脑损伤后的病理改变和行为缺陷。此外进一步研究发现在急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型中，海马区IP3R2、RYR2、GFAP、星形胶质细胞内Ca2+表达均显著升高；结合水迷宫实验，实验组小鼠认知功能减退，据此合理推测在急性一氧化碳中毒后，星形胶质细胞可能通过介导IP3R2、RYR2受体调控Ca2+释放，使一氧化碳中毒小鼠认知功能受损，并最终导致急性一氧化碳中毒迟发性脑病的发生发展。
星形胶质细胞一直以来都是认知障碍相关疾病发病机制的研究热点，例如阿尔茨海默病等神经退行性疾病、缺血性脑卒中后的认知功能缺陷等[27-30]。星形胶质细胞-突触双向通信是神经元发育和突触可塑性的必要条件，突触周围星形胶质细胞突起(PAP)的形态可塑性与突触重塑相关，而研究表明突触重塑与学习和记忆功能相关[31]。星形胶质细胞G蛋白偶联受体信号通路有助于介导记忆过程[32-33]，在阿尔茨海默病小鼠模型中发现PAP的形态可塑性受损[34]，提示星形胶质细胞G蛋白偶联受体介导的PAP运动可能是介导学习和记忆过程的关键机制。免疫荧光及Western Blot实验结果均表明，实验组小鼠GFAP的表达显著升高(P < 0.05)，这与前期在大鼠急性一氧化碳中毒迟发性脑病模型中的发现是相同的[24-25]。据此推测急性一氧化碳中毒后，星形胶质细胞表达增多活化，可能会通过G蛋白偶联受体信号通路介导PAP运动，从而影响突触重塑，导致小鼠出现认知功能障碍。
此项研究包括了内质网上2个最主要的Ca2+释放通道，即IP3R2和RYR2。IP3R2是中枢神经系统星形胶质细胞中的主要表达亚型，IP3R2的正常激活可以调节突触传递和可塑性，从而调节正常的认知功能。如上文所述，IP3R2介导的 Ca2+释放是中枢神经系统星形胶质细胞中主要(约75%)的 Ca2+信号通路。在阿尔茨海默病IP3R2(-/-)小鼠模型中，星形胶质细胞中的Ca2+信号表达显著下降，小鼠的空间和记忆能力也得到了改善，这与此次实验结果一致。根据免疫荧光及Western Blot实验结果显示，实验组小鼠海马区IP3R2的表达显著升高(P < 0.05)。然而有趣的是，PADMASHRI等[35]通过选择性地减弱星形胶质细胞中IP3R2介导的 Ca2+信号或使用星形胶质细胞特异性代谢抑制剂氟柠檬酸盐来干扰星形胶质细胞，观察到小鼠运动技能学习受损，这与此项结果研究相反。Pinto-Duarte等[36]研究也发现IP3R2介导的Ca2+信号通路的缺失并没有破坏正常的学习或近期(24-48 h)的记忆，而会对远期空间记忆(2-4周)造成显著损伤，还阻止了记忆巩固后的记忆增强，说明IP3R2介导的Ca2+信号通路对长期记忆具有促进作用。由此提出IP3R2对认知功能的影响是否与疾病发生发展的时间相关？所以后续研究将进一步完善一氧化碳中毒1，3，7，14，28 d后IP3R2的表达量变化。此外，有研究证实星形胶质细胞内Ca2+ 浓度的升高会刺激神经递质谷氨酸的释放[37]，作用于突触受体，增加突触强度，直接参与记忆过程和大脑信息存储[38]。实验结果表明在急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型中，IP3R2表达增多后，星形胶质细胞内Ca2+从内质网释放增多，这可能刺激神经递质谷氨酸的释放，谷氨酸作用于突触从而直接参与对小鼠认知功能的调节，这值得进一步探究。将利用IP3R2(-/-)的急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型进一步验证此次实验结果及猜想，更好地明确急性一氧化碳中毒迟发性脑病发病机制。
RYR2在海马体大量表达，主要通过钙诱导钙释放模式介导Ca2+从内质网释放到胞内，调节胞内Ca2+浓度。BERTAN等[39]研究发现海马锥体神经元中RYR2(-/-)会损害树突棘的功能维持和结构可塑性，而树突棘功能维持和可塑性直接影响学习和记忆的调节。免疫荧光及Western Blot实验结果显示，实验组小鼠海马区RYR2的表达显著升高(P < 0.05)。YAO等[40]的研究结果也支持了作者的观点，他们发现在严重的早发性阿尔茨海默病小鼠模型中，减少RYR2的开放时间(从而导致内质网释放到胞质内的总Ca2+减少)，可以防止神经元过度活跃、记忆障碍和神经元丢失。此外，在心源性痴呆的研究中，DRIDI等[41]在心衰患者和小鼠模型的海马神经元中发现了RYR2/Ca2+的泄漏，在应用抗RYR2/Ca2+泄漏(RYR2-p.ser2808ala)基因工程治疗后发现，心衰小鼠的认知功能障碍改善。因此，推断RYR2表达增多可能是促进急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型认知功能障碍发生及发展的重要因素之一，RYR2表达增多后，影响海马锥体神经元中树突棘的功能和结构，从而影响突触的功能，对学习和记忆的调节产生负面作用。
星形胶质细胞中Ca2+的表达与认知功能密切相关，HUFFELS等[42]在小鼠齿状回的脑切片中观察海马星形胶质细胞的自发钙瞬变，发现与野生型星形胶质细胞相比，9个月的阿尔茨海默病模型(APP/PS1)星形胶质细胞自发钙瞬变增加，且总体上显示钙活性增加，认为这可能导致认知功能衰退并最终导致痴呆的神经元生理学的变化。此次研究提取培养了小鼠的海马区星形胶质原代细胞，并用Ca2+荧光探针法检测了原代星形胶质细胞中Ca2+的浓度，结果表明实验组小鼠海马区星形胶质细胞Ca2+浓度显著升高(P < 0.05)。然而在阿尔茨海默病早期星形胶质细胞中Ca2+信号减少导致神经网络过度活跃[43]，神经网络异常兴奋会导致海马体回路失灵从而导致记忆受损[44]。INSTITORIS等[45]研究发现全脑放射治疗导致突触诱发的星形胶质细胞Ca2+信号在放疗后12-15个月的长期下降，这可能是全脑放射治疗后认知能力下降的一个重要因素。显而易见，在阿尔茨海默病模型的不同时间段，Ca2+表达量也不同的，对于疾病发生发展的影响也是不同的，这也提示在急性一氧化碳中毒后，在不同时期进一步进行Ca2+表达量的检测，这可能会对明确急性一氧化碳中毒迟发性脑病发病机制有益。Ca2+就像一把双刃剑，既能促进代谢，又能诱导细胞凋亡，对疾病的发病、发展及结局有着重要影响。内质网和线粒体作为细胞中重要的钙库，在Ca2+信号的调节中扮演重要角色，在急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型海马星形胶质细胞中Ca2+浓度升高，这可能进一步引起钙超载，Ca2+ 可能会进入线粒体，进一步导致线粒体功能损伤而启动细胞凋亡坏死程序，这也许是Ca2+在急性一氧化碳中毒迟发性脑病发生发展中的关键因素之一作用，所以将进一步使用特异性Ca2+指示器检测细胞器(内质网、线粒体)内Ca2+浓度变化，为阐明Ca2+信号在急性一氧化碳中毒迟发性脑病发病机制中的作用。
然而目前的研究存在一些局限性，例如所有实验都是在野生小鼠模型中进行，今后还需要通过设计IP3R2(-/-)及RYR2(-/-)动物模型实验进行验证；此外Ca2+ 信号的下游因子谷氨酸的表达以及海马组织中的突触形态是否发生改变有待进一步完善检测。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

IP3R2及RYR2介导Ca2+信号在急性一氧化碳中毒迟发性脑病小鼠模型中的表达

Expression of IP3R2 and RYR2 mediated Ca2+ signals in a mouse model of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning

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