2.1   二次冷冻导致囊胚期H3K4me3表达水平下降   对各组囊胚进行H3K4me3免疫荧光染色，见图2A，并对荧光的平均强度进行分析，结果表明，对照组(n=16)相对荧光强度为1.000±0.068，8C组(n=14)相对荧光强度为1.045±0.207，8C-8C组(n=16)相对荧光强度为0.818±0.155，8C-BL组(n=17)相对荧光强度为0.738±0.154，相较于对照组，一次冷冻组(8C组) H3K4me3的表达水平无显著变化，但是二次冷冻组(8C-8C组和8C-BL组)H3K4me3的水平显著降低，其中8C-BL组降低尤为明显 (P < 0.001)，见图2B。



2.2   冷冻导致囊胚期H3K9me2表达水平上升   对各组囊胚进行H3K9me2免疫荧光染色，见图3A，并对荧光的平均强度进行分析，结果表明，对照组(n=13)相对荧光强度为1.000±0.213，8C组(n=5)相对荧光强度为1.335±0.225，8C-8C组(n=11)相对荧光强度为1.341±0.297，8C-BL组(n=14)相对荧光强度为1.382±0.28，相较于对照组， 一次冷冻组(8C组)及二次冷冻组 (8C-8C组和8C-BL组)H3K9me2表达水平均有显著升高(P < 0.01)，但二次冷冻组(8C-8C组和8C-BL组)与一次冷冻组(8C组)之间无显著差异，见图3B。



2.3   冷冻导致囊胚期H3K9AC表达水平上升    对各组囊胚进行H3K9AC免疫荧光染色，见图4A，并对染色的结果进行荧光平均强度分析，结果显示，对照组(n=21)相对荧光强度为0.994±0.175，8C组(n=20)相对荧光强度为1.404±0.315，8C-8C组(n=16)相对荧光强度为1.450±0.299，8C-BL组 (n=13)相对荧光强度为1.457±0.253，与对照组相比，一次冷冻组(8C组，P < 0.000 1)及二次冷冻组 (8C-8C组和8C-BL组，P < 0.000 1)H3K9AC表达水平均有显著升高，但二次冷冻组(8C-8C组和8C-BL组)与一次冷冻组(8C组)之间无显著差异，见图4B。



2.4   囊胚期二次冷冻影响多能性基因的表达水平   实时荧光定量PCR结果显示，Cdx2在对照组、8C组、8C-8C组及8C-BL组的相对表达量分别为1，1.03±0.11，1.00±0.13，1.44±0.25，Oct4在对照组、8C组、8C-8C组及8C-BL组的相对表达量分别为1，0.85±0.05，0.79±0.05，0.76±0.13，Sox2在对照组、8C组、8C-8C组及8C-BL组的相对表达量分别为1.00±0.01，1.18±0.2，1.02±0.19，1.26±0.19，与对照组相比，一次冷冻组 (8C组)及8C-8C组中Oct4、Cdx2和Sox2基因表达水平均无显著差异。然而，8C-BL组中Cdx2(P < 0.001)、Sox2(P < 0.01)表达水平显著上升，Oct4(P < 0.01)的表达水平显著下降，见图5。

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胚胎玻璃化冷冻是辅助生殖中的一项重要技术。自1983年首次报道冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer，FET)临床妊娠以来，胚胎冷冻已成为人类辅助生殖领域中常见的技术手段[1]。二次冷冻是指对解冻复苏后的胚胎进行再次冷冻。1990年，首例二次冷冻的胚胎成功妊娠[2]。临床中，胚胎二次冷冻主要发生在以下几种情况：①随着单胚胎移植的逐渐普及，解冻胚胎数有时会多于移植胚胎数，对解冻移植后剩余的优质胚胎会行二次冷冻；②8-细胞期的胚胎解冻后进行囊胚培养，但患者由于内膜等因素取消了移植周期，获得的可移植囊胚进行二次冷冻；③因各种原因，胚胎解冻复苏后不能移植[3-5]。因此，通过二次冷冻，可以有效提高累计活产率，并降低多胎妊娠的风险。课题组前期的研究结果显示，在8-细胞期和囊胚期进行二次玻璃化冷冻对胚胎发育潜力有不同的影响，囊胚期二次冷冻显著降低活产率，并在小鼠上进行了验证，但其具体机制尚不明确[6]。

胚胎发育是一个复杂的过程，受到组蛋白表观修饰、多能性基因表达等多方面的调控。在胚胎的发育过程中，组蛋白甲基化或乙酰化发生异常，都会影响胚胎乃至整个个体的发育[7-8]。胚胎的谱系分化也受到多能性基因Oct4、Sox2及Cdx2等的调控[9]。然而，目前有关二次冷冻对胚胎发育潜能的影响机制知之甚少。因此，该研究基于小鼠这一模式动物，探索不同时期二次冷冻对小鼠胚胎组蛋白表观遗传修饰及多能性基因表达的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外胚胎实验，包括胚胎免疫荧光及实时荧光定量PCR实验，单因素方差分析用于评估组间差异。
1.2   时间及地点   实验于2021年1-8月在重庆市妇幼保健院人类胚胎工程重庆市重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   小鼠   雄性ICR小鼠60只，体质量36-42 g，雌性ICR小鼠230只，体质量25-30 g，均为6-8周龄，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验方案经重庆市妇幼保健院实验动物福利伦理委员会批准，批准号为2021005。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   胚胎冷冻、解冻试剂盒   玻璃化冷冻、解冻使用商业化的试剂盒 (Kitazato Inc，Cryotop Safety Kit，F0403)。
1.3.3   胚胎培养试剂   M2培养基 (Sigma，货号M716)；KSOM培养基 (Sigma，货号MR-121-D)。
1.3.4   抗体   H3K4me3 (CST，货号9727，来源：兔，稀释比例：1∶1 000)；H3K9me2 (Abcam，货号ab32521，来源：兔，稀释比例：1∶1 000)；H3K9AC (Abcam，货号ab32129，来源：兔，稀释比例：1∶500)；二抗(CST，货号4412，来源：山羊，稀释比例：1∶200)。
1.4   实验方法   
1.4.1   胚胎培养及获取   雄性和雌性ICR小鼠在光控条件下饲养，12 h光照，12 h黑暗，自由摄食和饮水，温度22-24 ℃。超排小鼠于下午4：00腹腔注射孕马血清促性腺激素10 IU，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素10 IU，与雄鼠合笼交配，次日早晨检查雌鼠阴栓，见栓小鼠在注射人绒毛膜促性腺激素44 h后从输卵管中收集2-细胞胚胎，体外培养至8-细胞。将8-细胞胚胎分为4组：①对照组：8-细胞直接体外培养至囊胚；②8C组：8-细胞时期冷冻一次并解冻培养至囊胚；③8C-8C组：8-细胞时期冷冻解冻2次后培养至囊胚；④8C-BL组：8-细胞时期冷冻解冻培养至囊胚期，再在囊胚期冷冻并解冻，见图1。 

1.4.2   胚胎冷冻   使用商业化的试剂盒 (Kitazato Inc，Cryotop Safety Kit，F0403)进行冷冻，先进行实验前的准备工作，将平衡液ES和玻璃化冷冻液VS在室温下平衡15 min，在载杆上写明要冷冻的胚胎数量及信息，将新鲜的液氮放置于冷冻架中。然后将胚胎转移至平衡液ES中平衡12-15 min，再将胚胎转移至玻璃化冷冻液中暴露45-60 s，最后用少量的玻璃化冷冻液将胚胎挪到载杆的顶端，并立即浸入液氮中。
1.4.3   胚胎解冻   使用商业化的试剂盒 (Kitazato Inc，Cryotop Safety Kit，F0403)进行解冻 ，胚胎的解冻分为4个步骤：首先，将载杆顶端冷冻的玻璃化胚胎浸入已预热至37 ℃的1.0 mol/L蔗糖溶液 (TS) 中，保持1 min；第2步，将胚胎悬浮于0.5 mol/L蔗糖溶液 (DS)中3 min；第3步，在清洗液1(WS1)溶液中浸泡5 min；第4步，在清洗液2(WS2)溶液中浸泡1 min。解冻完成之后在培养液中培养。
1.4.4   免疫荧光染色   收集3.5 d 各组囊胚，用含有0.2%聚乙烯醇的PBS洗涤3次，每次5 min，然后置于40 g/L多聚甲醛中室温条件下固定1 h；再将胚胎转移至含有0.1% TritonX-100的PBS母液中透膜处理30 min，转移前洗涤3次，每次5 min；然后将胚胎转移至封闭液 (含3%牛血清白蛋白)中封闭处理，室温下孵育1 h；洗涤3次，每次 5 min，4 ℃冰箱过夜进行一抗(H3K4me3、H3K9AC及H3K9me2)孵育；PBSA (含1%牛血清白蛋白)洗涤3次，每次5 min，室温下孵育二抗2 h，过程中要注意避光；PBSA洗涤3次后，用hoechst染核15 min，转移至载玻片上，压片，之后在共聚焦显微镜 (Leica TCS SP8)下拍照，利用ImageJ软件统计荧光平均强度。
1.4.5   总RNA提取   使用Thermo Fisher公司RNA提取试剂盒Arcturus PicoPure RNA isolation Kit(Thermo，KIT0214)，具体操作如下：取出在囊胚期冻存的胚胎 (100枚)；先加入350 μL Lysis Buffer，用移液枪轻轻吹匀；再加入350 μL体积分数为70%乙醇，再次用移液枪轻轻吹匀；将混合后样品转移至吸附柱中，12 000 r/min离心20 s，弃废液；在吸附柱中加入80 μL DNA酶，避光消化15 min；加入350 μL Wash Buffer 1，
12 000 r/min离心20 s，弃废液；随后加入500 μL Wash Buffer 2，12 000 r/min离心20 s，弃废液，再加入500 μL Wash Buffer 2，12 000 r/min离心20 s，弃废液；13 000 r/min空离2 min，更换收集管；在吸附柱中加入20 μL DEPC水洗脱。
1.4.6   总RNA反转录   使用Takara反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix (Takara，货号RR036A)，具体操作如下：准备2×RT Master Mix 2.0 μL的10×RT Buffer，0.8 μL的25×dNTP Mix (100 mol/L)，2.0 μL的10×RT Random Primers，1.0 μL的MultiScribe Reverse Transcriptase，4.2 μL的Nuclease-free H2O；将2×RT Master Mix与洗脱得到RNA混合均匀，反应条件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 2 h，85 ℃ 5 min，经反转得到cDNA。
1.4.7   Real-time PCR实验   基因表达模式检测均采用SYBR real-time PCR，反应体系如下：1 μL模板cDNA，10 μL 2×SYBR ExTaq Mix，引物F/R (10 μmol/L)各0.5 μL (2×1 μL)，8 μL dH2O。在CFX96 Real-Time System上按以下条件作PCR反应，95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min (检测信号)，40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min (检测信号)，95 ℃ 15 s。Real-time PCR结果分析采用经典2-∆∆Ct法。相对基因表达归一化处理以Hprt mRNA水平为内参。基因引物序列见表1。

1.5   主要观察指标   新鲜组胚胎体外培养至囊胚期、在8-细胞时期冷冻并解冻后培养至囊胚期、在8-细胞时期冷冻并解冻2次后培养至囊胚期以及8-细胞时期冷冻解冻培养至囊胚期，再在囊胚期冷冻并解冻后进行免疫荧光染色，观察统计H3K4me3、H3K9me2和H3K9AC的荧光强度变化，RT-PCR检测多能性基因Oct4、Sox2及Cdx2的表达水平。
1.6   统计学分析   使用SPSS 23.0 软件统计分析。数据以平均值±标准误表示，单因素方差分析用于评估组间差异。利用GraphPad Prism 8.0软件绘图。文章统计学方法已经通过东北农业大学生命科学学院生物统计学专家审核。

在辅助生殖助孕中，存在胚胎二次冷冻的情况，其可以提高胚胎利用率，从而提高累计活产率。课题组之前的研究结果表明，不同时期的胚胎二次冷冻会影响发育潜能，其中囊胚期二次冷冻会导致妊娠率显著降低，但其机制尚不明确。该研究通过对不同时期胚胎冷冻，发现相较于对照组，囊胚期二次冷冻会显著改变组蛋白H3K4me3的修饰及多能性相关基因Oct4、Cdx2和Sox2的表达水平，为阐明二次冷冻对胚胎发育潜力的可能影响提供了依据。

目前，胚胎冷冻保存技术在辅助生殖中广泛应用，玻璃化冷冻保存的胚胎数量迅速增加。在某些情况下，胚胎在移植前需要经历2次冷冻[10]。EL-GAYAR等[11]研究发现有相当大的一部分胚胎不能忍受3次冷冻。VITALE等[12]在解冻后的每个周期之间重复冷冻小鼠胚胎，且不进行培养时间干预，其孵化时的平均细胞数低于新鲜胚胎，表明连续的冷冻过程影响了胚胎发育。NOHALEZ等[13]对猪的胚胎进行玻璃化二次冷冻研究发现，尽管二次冷冻会降低囊胚存活率及孵化率，但仍有一部分胚胎可用于移植。MAJIDI GHARENAZ等[14]对小鼠胚胎在桑椹期进行玻璃化二次冷冻，会显著降低囊胚发育率。临床研究方面，ZHENG等[15]对人类囊胚期二次冷冻胚胎与新鲜胚胎比较发现，二次冷冻胚胎妊娠率显著降低。MURAKAMI等[16]研究发现，与一次冷冻胚胎相比，囊胚期二次冷冻胚胎流产率显著增加。作者之前对小鼠和人的胚胎研究表明，与新鲜胚胎相比，8-细胞期二次冷冻不影响妊娠率，但囊胚期二次冷冻导致妊娠率显著降低，为此对其机制进行了探索。 

在胚胎发育过程中，组蛋白会经历多种翻译后修饰，包括甲基化、乙酰化等[17]。组蛋白精确修饰确保胚胎发育过程中基因的正确表达，其中H3K4me3动态控制着早期胚胎发育，对调控基因活化和发育功能至关重要[18]。以组蛋白甲基转移酶SETD1为核心组成的蛋白复合体是细胞中负责生成H3K4me3修饰的主要生物大分子，SHA等[19]将该复合体中一个非常重要的亚基CFP1条件性敲除后发现胚胎在刚刚植入子宫即死亡，说明CFP1介导的H3K4me3修饰直接介导了卵母细胞发育潜能的建立。组蛋白去甲基化酶 KDM5B负责介导组蛋白H3K4me3发生去甲基化，在小鼠受精卵中敲降 KDM5B导致基因组上H3K4me3 信号普遍延长及胚胎发育的阻滞[20]。另一个卵母细胞中的甲基化酶UHRF1缺陷导致早期胚胎发育停滞在2-细胞阶段，并伴随H3K4me3甲基化模式的显著改变[21]。此外，组蛋白 H3K4me3 能够调节染色质处于松散状态，从而促进基因转录[22]。ZHAO等[23]研究发现，与新鲜胚胎相比，玻璃化冷冻后卵裂期胚胎的甲基化水平显著下调。在另一项研究中，BAKHTARI等[24]研究发现，冷冻会显著改变早期胚胎中组蛋白表观修饰变化。然而，很少有研究评估二次冷冻对胚胎表观遗传方面的影响。该研究在8-细胞或囊胚期对小鼠胚胎进行二次玻璃化冷冻，这与人类胚胎二次玻璃化冷冻的2个发育阶段相对应。作者发现在8-细胞或囊胚期二次冷冻均会降低激活型组蛋白修饰H3K4me3的水平，且在囊胚期二次冷冻降低尤为严重，表明囊胚期二次冷冻可能在全基因组水平抑制基因表达。

内细胞团和滋养外胚层的形成是哺乳动物胚胎发育命运决定的关键。转录因子Oct4及Sox2作为内细胞团标志基因，促进位于内细胞团中细胞多能性的形成和维持。滋养外胚层的标志基因Cdx2敲除会导致胚胎无法形成成熟滋养外胚层，滋养外胚层的缺失则会导致胚胎无法扩大成腔[25-26]。小鼠母源Oct4的mRNA和蛋白储存于卵母细胞中，维持合子早期发育。CHOI等[27-28]发现，Oct4和Sox2出入细胞核的动力学在4-细胞和8-细胞期存在差异，并且随着合子基因组激活，在2.5 d桑椹胚时期和3.5 d囊胚期的表达上调。研究发现Cdx2在8-细胞时期的部分卵裂球中表达，并逐渐向外部细胞聚集，最终只在囊胚的滋养外胚层中表达[29-30]，且Oct4 和Cdx2的表达存在拮抗作用[31]。该研究发现，一次冷冻及8-细胞期二次冷冻对Oct4、Sox2及Cdx2的表达均无影响；有趣的是，囊胚期二次冷冻导致Oct4的表达水平显著降低，而Sox2和Cdx2的表达水平则显著升高，结果提示囊胚期二次冷冻导致多能性基因的异常表达可能是妊娠率下降的原因。

综上所述，玻璃化二次冷冻对小鼠胚胎的表观遗传具有一定的负面影响，且囊胚期二次冷冻显著影响H3K4me3修饰及多能性相关基因表达水平。因此，如果需要进行胚胎二次冷冻保存，8-细胞期二次冷冻可能是更好的选择。二次冷冻导致的组蛋白修饰水平及多能性基因表达变化的影响是复杂的，在后续的研究中，将深入分析组蛋白表观修饰直接影响的基因，更加深入探讨二次冷冻对胚胎质量的潜在影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
玻璃化冷冻：液体介质在没有冰晶形成的情况下快速冷却的冷冻保存过程，已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢速冷冻法，成为冷冻技术的最佳选择。玻璃化冷冻目前已应用于卵母细胞、胚胎及卵巢组织的冷冻保存。
组蛋白表观修饰：表观修饰是指在核酸序列不发生改变的情况下，遗传物质出现了可遗传的变化，从而导致可遗传的表型改变。蛋白质在翻译后需要经过合适的折叠及翻译后修饰才能行使正常功能，对组蛋白而言通常是甲基和乙酰基基团的修饰，包括组蛋白甲基化、乙酰化、泛素化等。

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二次冷冻是指由于各种原因对解冻复苏后的胚胎进行再次冷冻。冷冻解冻过程中冰晶形成、剧烈的温度及渗透压变化等应激均可能影响胚胎发育。因此胚胎冷冻解冻的安全性备受关注。现胚胎二次冷冻的临床应用广泛，针对目前生殖领域专家共识，辅助生殖技术助孕治疗的目的是单胎、足月、健康的婴儿出生，尽量减少双胎妊娠，杜绝三胎妊娠分娩。动物研究表明，冷冻解冻会影响胚胎的凋亡、发育及植入相关基因的表达及DNA甲基化修饰。二次冷冻中，胚胎会经历两次冷冻及解冻，这会对胚胎有怎样的影响？本课题基于小鼠这一物种，完全模拟在人类辅助生殖过程中二次冷冻时期，探究二次冷冻对小鼠胚胎组蛋白表观修饰及多能性基因表达的影响，评估其安全性，为人类胚胎二次冷冻的临床应用提供一定的参考。

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