淫羊藿苷干预磷酸钙骨水泥/骨髓间充质干细胞复合体修复兔股骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1413

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (30): 4757-4762.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1413

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淫羊藿苷干预磷酸钙骨水泥/骨髓间充质干细胞复合体修复兔股骨缺损

贾丙申¹，张熙明²，于鹏¹，李明¹，李君¹，云大科¹，王晟¹，胡帅¹

¹海南医学院第一附属医院关节创伤外科，海南省海口市 570102；²湖北省文理学院附属医院骨科，湖北省襄阳市 441021

收稿日期:2019-05-08 出版日期:2019-10-28 发布日期:2019-10-28
通讯作者: 张熙明，主治医师，硕士，湖北省文理学院附属医院骨科，湖北省襄阳市 441021
作者简介:贾丙申，男，1980年生，副主任医师，硕士，主要从事骨关节疾病、运动损伤及骨组织修复研究。

Effect of icariin on the repair of femoral defects in rabbits by calcium phosphate bone cement/bone marrow mesenchymal stem cell complex

Jia Bingshen¹, Zhang Ximing², Yu Peng¹, Li Ming¹, Li Jun¹, Yun Dake¹, Wang Sheng¹, Hu Shuai¹

¹Department of Joint Trauma Surgery, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China; ²Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441021, Hubei Province, China

Received:2019-05-08 Online:2019-10-28 Published:2019-10-28
Contact: Zhang Ximing, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441021, Hubei Province, China
About author:Jia Bingshen, Master, Associate chief physician, Department of Joint Trauma Surgery, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

磷酸钙骨水泥：是一种骨修复材料，自从被Brown等发明以来已得到广泛研究和应用。磷酸钙骨水泥的出现拓展了磷酸钙陶瓷制备与成型方法，其选用特定的磷酸钙盐，以类似水泥固化的常温湿法合成羟基磷灰石。

淫羊藿苷：是黄酮类化合物，具有免疫调节、抗肿瘤、延缓衰老、影响心血管系统等生物活性。研究发现，淫羊藿苷可作为一种良好的骨诱导活性因子，能有效促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化，能够促进成骨相关因子表达，这为其在骨组织工程中的应用奠定了实验基础。

背景：已有研究显示磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞复合物有助于修复软骨缺损。淫羊藿苷是一类黄酮类物质，其对细胞增殖和分化有明显促进作用。

目的：观察淫羊藿苷干预下磷酸钙骨水泥/骨髓间充质干细胞复合体修复兔股骨缺损的效果。

方法：取30只新西兰大白兔(海南医学院实验动物中心提供)，随机分为3组并制作右侧股骨末端骨缺损模型：空白组股骨缺损不填充材料，对照组骨缺损处植入成骨诱导培养的骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合物，实验组股骨缺损处植入淫羊藿苷干预且经成骨诱导培养的骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合物。术后4，8，12周进行骨缺损部位影像学、生物力学分析。动物实验获得海南医学院第一附属医院伦理委员会批准。

结果与结论：①术后4，8，12周Micro-CT显示，实验组成骨速度明显优于空白组和对照组；术后第12周，对照组中磷酸钙骨水泥有部分被新骨代替，骨痂未完全包绕，实验组股骨缺损区已完全有新骨生成，植入的磷酸钙骨水泥已完全降解；实验组和对照组术后12周的骨小梁模式因子、骨体积分数、骨小梁数量均明显高于空白组(P < 0.05)，并且实验组各项指标优于对照组(P < 0.05)；②实验组术后4，8，12周的骨密度高于对照组、空白组(P < 0.05)；③实验组术后12周的骨标本抗弯曲能力的最大应力、最大负荷力和破坏能量明显高于对照组、空白组(P < 0.05)；④结果表明，淫羊藿苷干预后的骨髓间充质干细胞/磷酸钙骨水泥复合物能有效促进新骨形成，加快骨修复。

ORCID: 0000-0001-6569-4419(贾丙申)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 磷酸钙骨水泥, 淫羊藿苷, 骨髓间充质干细胞, 股骨缺损, 骨密度, 生物力学, 骨形成, 骨修复

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that calcium phosphate bone cement/bone marrow mesenchymal stem cell complex can help repair cartilage defects. Icariin is a kind of flavonoids that can promote cell proliferation and differentiation.

OBJECTIVE: To investigate the effect of icariin-treated calcium phosphate cement/bone marrow mesenchymal stem cell complex in the repair of femoral defects in rabbits.

METHODS: Thirty New Zealand white rabbits were provided by Laboratory Animal Center, Hainan Medical University, China and prepared into models of right femur end defect. Then these models were randomly divided into three groups. In the blank group, there was no filling material for femoral defect. In the control group, the complex of calcium phosphate bone cement and the bone marrow mesenchymal stem cells which were cultured from osteoblasts was implanted in the femoral defect area. In the experimental group, the complex of calcium phosphate bone cement and the bone marrow mesenchymal stem cells which were cultured from osteoblasts and treated with icariin was implanted in the femoral defect area. Imaging and biomechanical analysis of bone defects were performed at 4, 8 and 12 weeks after surgery. Animal experiments were approved by the Ethics Committee, First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, China.

RESULTS AND CONCLUSION: At postoperative 4, 8 and 12 weeks, micro-CT scans showed that the osteogenesis rate of the experimental group was significantly faster than that of the blank and control groups. At 12 weeks after surgery, some calcium phosphate bone cement was replaced by new bone, and callus was not completely enclosed in the control group. New bone formed in the femoral defect area, and the implanted calcium phosphate bone cement was completely degraded in the experimental group. At 12 weeks after surgery, trabecular mode factor, bone volume fraction, and the number of trabeculae in the experimental and control groups were significantly greater than those in the blank group (P < 0.05). The indexes in the experimental group were better than those in the control group (P < 0.05). At 4, 8 and 12 weeks after surgery, bone density in the experimental group was significantly higher than that in the control and blank group (P < 0.05). At 12 weeks after surgery, the maximum stress, maximum load and destructive energy in the experimental group were significantly greater than those in control and blank groups (P < 0.05). These results suggest that icariin-treated bone marrow mesenchymal stem cells/calcium phosphate bone cement complex can effectively promote new bone formation and accelerate bone repair.

Key words: calcium phosphate bone cement, icariin, bone marrow mesenchymal stem cells, femoral defect, bone density, biomechanics, bone formation, bone repair

中图分类号:

贾丙申，张熙明，于鹏，李明，李君，云大科，王晟，胡帅. 淫羊藿苷干预磷酸钙骨水泥/骨髓间充质干细胞复合体修复兔股骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(30): 4757-4762.

Jia Bingshen, Zhang Ximing, Yu Peng, Li Ming, Li Jun, Yun Dake, Wang Sheng, Hu Shuai. Effect of icariin on the repair of femoral defects in rabbits by calcium phosphate bone cement/bone marrow mesenchymal stem cell complex[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(30): 4757-4762.

图/表（结果） 6

2.1 兔骨髓间充质干细胞形态和鉴定第2代骨髓间充质干细胞呈短梭形，分布较均匀，见图1。

流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记，细胞高表达CD29和CD44，极低表达CD34和CD45，见图2。

2.2 淫羊藿苷浓度与作用时间的筛选结果通过锥虫实验筛选出淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞促进增殖的最佳浓度为0.05 µmol/L，最佳作用时间为48 h，见图3。

2.3 大体观察术后实验兔情况良好，能正常进食和排泄，伤口愈合良好，无感染现象，术后观察期内无意外死亡。

2.4 Micro-CT观察股骨内部微观结构结果术后4周，空白组没有新的骨组织和软组织生成，骨缺损处凹陷明显且凹陷裂痕较深；对照组骨缺损凹陷不明显，有少量新骨形成，实验组骨缺损区凹陷不明显，有较多骨痂形成。术后8周，空白组骨组织凹陷裂隙仍较深，且未见新骨组织和软组织生成；对照组有少量的骨小梁和骨基质形成，磷酸钙骨水泥两端有较多的新骨形成，骨缺损处有少部分被纤维组织填充；实验组股骨缺损处有新骨填充，有更加成熟的骨小梁和软骨细胞。术后12周，空白组仍未见明显的骨组织成形；对照组部分磷酸钙骨水泥被新骨代替，骨痂未完全包绕；实验组骨缺损区已完全有新骨生成，植入的磷酸钙骨水泥已完全降解，见图4。

2.5 感兴趣区骨计量学分析结果术后12周，通过Micro-CT检测骨小梁模式因子、骨体积分数、骨小梁数量指标，骨体积分数与骨形成量呈正相关，即新骨形成量越多；骨小梁模式因子、骨小梁数量与新生骨的致密程度相关。实验结果显示，实验组和对照组骨小梁模式因子、骨体积分数、骨小梁数量均明显高于空白组(P < 0.05)，并且实验组各项指标均优于对照组(P < 0.05)，成骨效果更佳，见表2。

2.6 骨密度分析术后4，8，12周，实验组股骨骨密度明显高于空白组和对照组(P < 0.05)，见表3。

2.7 生物力学分析术后第12周，实验组骨标本抗弯曲能力的最大应力、最大负荷力和破坏能量明显高于对照组和空白组(P < 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年5月至2018年5月在海南医学院第一附属医院实验室完成。

1.3 材料磷酸钙骨水泥理化性能，见表1。

实验动物：2月龄新西兰大白兔30只，体质量 1.8-2.1 kg；1周龄新西兰大白兔2只，体质量225 g左右，均由海南医学院实验动物中心提供，饲养于SPF级动物实验室。实验过程中对动物处置符合实验动物伦理学标准。

实验用主要试剂和仪器：淫羊藿苷(上海友思生物技术有限公司，纯度>98%)；L-DMEM培养基、成骨诱导完全培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；间充质干细胞鉴定流式试剂盒(BD中国)；胰蛋白酶(Sigma公司)；Micro-CT机(德国Siemens公司)。

1.4 实验方法动物实验获得海南医学院第一附属医院伦理委员会批准。

1.4.1 原代兔骨髓间充质干细胞的培养与鉴定实验前将实验需要用到的EP管、剪刀、摄子、纱布等进行高压蒸汽灭菌，烘干后放入超净台紫外照射30 min。耳缘静脉空气栓塞法处死1周龄新西兰兔，转移到无菌操作台后用剪刀剪开皮毛，取出带有肌肉的兔股骨，并将其移入装有乙醇的培养瓶中灭菌6 min取出，然后将股骨上的肌肉剔除干净，放入含有完全培养基的培养皿中清洗3遍，然后取出股骨至新的培养皿中，用1 mL无菌注射器吸取完全培养基反复冲洗股骨骨髓腔。将培养皿中的骨髓混悬液搜集到10 mL BD管中，加入3 mL Percoll淋巴细胞分离液(密度1.073 g/mL)，1 000 r/min离心10 min，用吸管吸取分离液层与淋巴细胞层之间的白膜层(即单个核细胞层)到新的离心管中，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液制成单细胞悬液，接种于25 cm²培养皿中培养，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱内孵育，观察细胞形态，48 h后更换新鲜培养液。待细胞铺满培养皿底部的80%-90%时进行传代，用吸管吸去旧培养基，PBS清洗，加入胰蛋白酶溶液2 mL消化细胞三四分钟，按1∶2的比例传代培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，正常细胞呈贴壁的梭形。

取生长良好的第2代骨髓间充质干细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，加入抗CD34、CD45、CD29、CD90单克隆抗体，鼠同型对照抗体作为参照，4 ℃避光孵育 30 min，上流式细胞仪进行检测分析。

1.4.2 淫羊藿苷的制备将3.83 g淫羊藿苷用10 μL二甲基亚砜溶解后PBS定容至5 mL，然后用0.22 μm微孔过滤器进行过滤除菌，放于4 ℃冰箱中保存。

1.4.3 淫羊藿苷浓度与作用时间的筛选调整第2代骨髓间充质干细胞浓度为2.5×10⁷ L^-1，接种于96孔板中，每孔100 μL，24 h后更换成含淫羊藿苷的完全培养基，淫羊藿苷的浓度分别为5×10^-4，5×10^-3，0.05，0.5，5 µmol/L，空白组加入等量的二甲基亚砜与PBS混合物。每组5个复孔，各孔总体积保持一致。每2 d换1次培养基，分别干预24，48，72 h消化收集细胞，制备成单细胞悬液，取80 μL 细胞悬液与20 μL 0.4%锥虫蓝溶液混合均匀。显微镜观察，光亮透明细胞为活细胞，锥虫蓝染成蓝色的细胞计为死细胞。每次实验二甲基亚砜浓度不超过0.1%，计算细胞存活率。细胞存活率=实验组活细胞数/空白组活细胞数× 100%。

1.4.4 淫羊藿苷干预下细胞/支架复合物的制备将原代骨髓间充质干细胞进行传代培养，细胞铺满培养皿90%时，弃去旧培养基，换为成骨诱导完全培养基，然后加入 0.05 µmol/L淫羊藿苷，干预48 h。将淫羊藿苷干预且经成骨诱导培养的骨髓间充质干细胞以2.5×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于磷酸钙骨水泥。两者复合8 h后进行移植。

1.4.5 兔股骨头缺损模型制备将30只新西兰兔编号并标记，术前剃除手术部位的毛发，用体积分数为75%乙醇消毒，在无菌环境下进行手术，首先用3%戊巴比妥钠经兔耳缘静脉注射麻醉，切开右侧股骨末端的皮肤和肌肉，显露股骨末端，用骨科钻制成直径为6 mm的骨缺损，随机分为3组(n=10)：对照组骨缺损处植入成骨诱导培养的骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合物，实验组骨缺损处植入淫羊藿苷干预且经成骨诱导培养的骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合物，空白组骨缺损处不植入任何材料。然后伤口逐层缝合，手术区域再次消毒，术后连续4 d注射青霉素以防感染，分笼饲养。术后观察动物的进食、活动状况、伤口愈合情况等。

1.5 主要观察指标

骨密度测量：术后4，8，12周，每组随机取实验兔3只，麻醉后处死，解剖取股骨，采用法国Challenger骨密测定仪进行骨密度检测。

Micro-CT检测兔股骨头缺损修复情况：术后4，8，12周，取上述各组实验兔股骨，去肌肉等软组织后用 Micro-CT扫描检测，采用Image-pro图像分析软件去除图像背景，用可视化软件对图像进行三维重构，了解股骨缺损修复情况。术后12周，设置骨缺损感兴趣区域，检测分析骨小梁模式因子、骨体积分数、骨小梁数量指标。

生物力学分析：术后12周，将各实验组兔股骨标本在万能实验材料机上进行三点弯曲实验，加载速度5 mm/min，量程500 N，跨距20 mm，计算机处理系统实时监测实验过程，自动采样和计算骨标本抗弯曲能力的最大应力、最大负荷力和破坏能量。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨髓间充质干细胞具有增殖能力强、能稳定表达成骨细胞表型等优点，使其成为骨组织工程重要的种子细胞。磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性和可降解性，是优良的生物支架材料，有利于干细胞的附着和增殖。磷酸钙骨水泥良好的生物相容性和可降解性结合骨髓间充质干细胞的分化能力，二者用于骨组织工程研究已成为热点^[19]。已有研究认为载骨髓间充质干细胞磷酸钙骨水泥可应用于软骨组织缺损、下颌骨缺损等^[20-22]。

淫羊藿苷是黄酮类化合物，具有免疫调节、抗肿瘤、延缓衰老、影响心血管系统等生物活性，具有很高的保健作用和药用价值，近年来对淫羊藿苷的研究得到广泛关注^[23-24]。研究发现，淫羊藿苷可作为一种良好的骨诱导活性因子，能有效促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化^[25-27]，能够促进成骨相关因子表达，包括Runt相关转录因子2、成骨特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2和血小板衍生因子Α多肽等，这为其在骨组织工程中的应用奠定了实验基础。

实验通过淫羊藿苷干预骨髓间充质干细胞并结合磷酸钙骨水泥对兔股骨缺损进行研究，利用骨髓间充质干细胞释放的细胞因子促进细胞在材料周围不断成骨，同时淫羊藿苷能加快骨髓间充质干细胞的增殖和分化，以及加速磷酸钙水泥的降解，进而促进兔股骨的修复和材料降解的渐变过程^[28-30]。研究结果显示，淫羊藿苷在0.05 µmol/L浓度下干预骨髓间充质干细胞48 h，能有效促进骨髓间充质干细胞的增殖。实验将骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化，然后加入0.05 µmol/L淫羊藿苷干预48 h。取淫羊藿苷干预且经成骨诱导培养的骨髓间充质干细胞以2.5×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于磷酸钙骨水泥制备复合物，植入股骨缺损处。

Micro-CT可在不破坏标本的情况下获得内部详细的三维结构信息，是目前研究植入物骨结合处微观结构的较好方法。术后4，8，12周，实验组成骨速度明显优于空白组和对照组；术后第12周，对照组中磷酸钙骨水泥有部分被新骨代替，骨痂未完全包绕，实验组股骨缺损区已完全有新骨生成，植入的磷酸钙骨水泥已完全降解，实验组和对照组骨小梁模式因子、骨体积分数、骨小梁数量均明显高于空白组(P < 0.05)，而且实验组各项指标均优于对照组 (P < 0.05)，成骨效果更佳。通过淫羊藿苷干预后的股骨缺损能够得到有效修复，且磷酸钙骨水泥能够得到快速降解，相比未经干预的骨髓间充质干细胞和磷酸钙骨水泥复合体修复股骨缺损时间更短且能有效加快磷酸钙骨水泥的降解。通过生物力学测试，淫羊藿苷干预后的股骨抗弯曲能力的最大应力、最大负荷力和破坏能量都明显优于对照组和空白组。

实验结果表明，淫羊藿苷干预下的骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合体能够有效修复股骨缺损，并能早期恢复股骨生物力学性能，淫羊藿苷干预后能够加快磷酸钙骨水泥的降解及促进新生骨形成。实验不足之处在于动物样本量偏少，在后期研究中应加大动物实验样本量，以及进行更为丰富的评估指标，如组织切片观察、分子生物学检测等，获得更多证据支持其成骨作用。已有相关文献报道淫羊藿苷能够上调骨髓间充质干细胞及成骨细胞的骨形成活性，未来将对其作用机制进行详细研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

淫羊藿苷干预磷酸钙骨水泥/骨髓间充质干细胞复合体修复兔股骨缺损

Effect of icariin on the repair of femoral defects in rabbits by calcium phosphate bone cement/bone marrow mesenchymal stem cell complex

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