尾静脉移植羊膜间充质干细胞对缺血再灌注损伤后神经功能恢复的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
人羊膜间充质干细胞：来源于胚外中胚层，分散于单层羊膜上皮细胞下的胶原基质中，具有向三胚层细胞分化的潜能。有研究表明，培养三四周后能够得到大量的贴壁间充质干细胞，形态学类似于骨髓间充质干细胞，且比骨髓来源间充质干细胞具有更强的增殖能力，人羊膜间充质干细胞在体外至少可以传到第15代而保持其形态不变。
脑缺血再灌注损伤：根据临床观察，脑梗死患者闭塞的脑血管再通后(溶栓或自发再通)，部分病侧的神经缺失反而加重。动物实验也证实，重灌注可加重脑组织原有的缺血性损伤，可见缺血引起的脑损伤不仅发生在组织灌注不足时，更重要的发生在灌注恢复期，这种现象称为再灌注损伤。目前认为再灌注损伤的机制与下列因素有关：①无再流现象：指缺血后脑组织恢复血流后，缺血组织并未得到重新灌注，而是继续缺血，损伤加重。其发生认为与神经细胞、内皮细胞肿胀，微血管内白细胞阻塞等造成微循环障碍有关；②钙超载：指细胞内Ca超过正常水平甚至达正常的200倍。细胞膜通透性增高，钙通道开放，Ca顺浓度差进入细胞内。Ca超载是各种原因造成神经元坏死的共同路径；③自由基的作用：缺血再灌注时，灌注氧突然增加，产生大量氧自由基，损伤细胞膜及蛋白质，最后造成细胞坏死；④高能磷酸化合物缺乏，影响细胞功能的恢复；⑤白细胞作用：实验发现，缺血再灌注时脑组织有白细胞浸润增加，用除去白细胞的血再灌注，或用抗炎药物布洛芬减轻组织浸润，可保护缺血组织。

摘要
背景：研究表明，MAG、OMgp等髓磷脂抑制物的过表达是早期神经元再生失败的主要原因。
目的：探讨人羊膜间充质干细胞移植对缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复的影响。
方法：SD大鼠60 只，随机分为假手术组、缺血再灌注损伤组及人羊膜间充质干细胞移植组，每组20只。人羊膜间充质干细胞组于缺血再灌注损伤后24 h经尾静脉注入细胞浓度为1.0×10⁸ L^-1的人羊膜间充质干细胞悬液1 mL。移植后24 h，3 d及1，2，3周，采用Longa行为学评分、圆筒实验、水平梯行走实验及肢体对称性实验对各组大鼠进行行为学评估，观察神经功能恢复情况；移植1 d和1，2，3周后免疫荧光法观察细胞迁移和分布情况；移植后2周采用Western blot检测各组大鼠脑组织MAG及OMgp蛋白的表达；移植后3周采用TUNEL 染色观察神经元凋亡情况。
结果与结论：①移植后1周在损伤区周围可见红色阳性标记细胞，并且随移植时间的延长，阳性标记细胞逐渐增多；②与缺血再灌注损伤组比较，在移植后3 d及1，2，3周人羊膜间充质干细胞移植组大鼠神经功能得到明显改善(P < 0.05)；③与缺血再灌注损伤组比较，人羊膜间充质干细胞移植组MAG及OMgp蛋白的表达量均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；④与假手术组相比，缺血再灌注损伤组凋亡细胞数增多；人羊膜间充质干细胞移植组凋亡细胞数目较缺血再灌注损伤组下降；⑤结果表明，人羊膜间充质干细胞移植可能通过降低MAG及OMgp表达，减少神经元凋亡，进而促进缺血再灌注损伤大鼠的神经功能恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9599-5140(赵宇)

关键词: 干细胞, 移植, 人羊膜间充质干细胞, 缺血再灌注损伤, 神经功能, MAG, OMgp, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that overexpression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and oligodendrocyte myelin glycoprotein (OMgp) is the main reason for early neuronal regeneration failure.
OBJECTIVE: To study the effect of human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) transplantation on neural functional recovery of rats with ischemia/reperfusion (I/R) injury.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley were randomized into sham, I/R, and hAMSCs groups (n=20 per group). Rats in the hAMSCs group were given 1 mL of hAMSCs suspension (1.0×10⁸/L) via the tail vein 24 hours after I/R injury. Rat neurological function recovery was assessed based on behavior changes, as determined by Longa behavioral score, cylinder test, horizontal ladder walking test and limb symmetry test at 1, 3 days, and 1, 2, 3 weeks post transplantation. Cell migration and distribution were observed using immunofluorescence method at 1 day, and 1, 2, 3 weeks post transplantation. MAG and OMgp protein expression was detected by western blot assay at 2 weeks post transplantation. Neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining at 3 weeks post transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: In the hAMSCs transplantation group, red marker-positive cells were visible around the injury region at 1 week after transplantation, and over time, these cells were increased in number. Significant improvement in the neurological function of rats were observed in the hAMSCs group as compared with the I/R group at 3 days and 1, 2, 3 weeks after transplantation (P < 0.05), and the expression of MAG and OMgp proteins were also decreased dramatically in the hAMSCs group (P < 0.05). After I/R injury, the number of apoptotic cells was increased, but hAMSCs transplantation reversed this effect. Overall, hAMSCs transplantation can reduce neuronal apoptosis by reducing MAG and OMgp expression levels, and thereby promote neurological functional recovery from I/R injury in rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Amnion, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Reperfusion Injury, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵宇. 尾静脉移植羊膜间充质干细胞对缺血再灌注损伤后神经功能恢复的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 707-712.

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图/表（结果） 2

2.1 人羊膜间充质干细胞的形态 人羊膜间充质干细胞复苏后重悬于新鲜的细胞培养液中，除少数细胞贴壁死亡外，多数细胞生长良好，培养六七天即可传代，培养14 d可见呈平形排列或漩涡状集落生长，细胞排列紧密(图1A)；第3代细胞生长迅速，纯度高、形态单一(图1B)。实验选取第3代细胞进行移植。

2.2 移植细胞迁移和分布情况 免疫荧光检测显示，细胞移植后第1天在损伤区未观察到阳性细胞，移植后1周在损伤区周围可见红色阳性标记细胞，并且随移植时间的延长，移植细胞表达逐渐增多，见图2。

2.3 实验动物数量分析 实验共纳入60只SD大鼠，均进入结果分析。

2.4 行为学评分 移植后不同时间点进行Longa行为学评分、圆筒实验评分、水平梯行走实验评分、肢体对称性实验评分。结果显示：在移植后24 h各组行为学评分差异无显著性意义；移植后3 d及1，2，3周，细胞移植组较缺血再灌注损伤组神经受损得到明显改善(P < 0.05)；对人羊膜间充质干细胞移植组不同时间点进行比较发现，随着时间的延长，大鼠神经功能亦得到明显改善(P < 0.05)，而缺血再灌注组不同时间点行为学评分比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1-4。

2.5 各组大鼠脑组织MAG及OMgp蛋白的表达变化 与假手术组比较，缺血再灌注组MAG及OMgp蛋白的表达量均明显升高；与缺血再灌注损伤组比较，人羊膜间充质干细胞移植组MAG及OMgp蛋白的表达量均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表5和图3。

2.6 TUNEL染色观察神经元凋亡情况 与假手术组相比，缺血再灌注损伤组凋亡细胞数增多；人羊膜间充质干细胞移植组凋亡细胞数目较缺血再灌注损伤组下降，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年11月至2016年2月在天津医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 成年雄性SD大鼠60只，体质量(260±10) g，购于天津医科大学实验动物中心，动物质量合格证号为SCXK(津)20060008，在清洁级屏蔽环境中喂养，实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。

1.3.2 细胞、试剂及仪器 人羊膜间充质干细胞由天津市中心妇产科医院实验中心提供。大脑中动脉阻断栓线(北京沙东生物技术有限公司)；水平梯装置及圆筒装置(美国TAP塑料公司定制)；RNA提取试剂盒(RP4001)(北京百泰克生物技术有限公司)；裂解液(天根生化科技北京有限公司)；石蜡包埋机(德国Leica公司)；石蜡切片机为Leica RIM2255型(德国Leica公司)：SDS-PAGE胶电泳转膜装置(美国BIO-RAD公司)；TUNEL试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人羊膜间充质干细胞体外培养 将冻存管从液氮中取出，迅速放入37 ℃水浴中解冻，注意避免冻存管顶部沾水而受污染。将细胞放入含有培养基的离心管中，1 500 r/min离心5 min，去掉上清，接种到新的培养皿中，置入体积分数为5%的CO₂培养箱内培养，每三四天半量换液1次，7-10 d传代1次。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。

将1 mL完全培养基和5 μL CM-Dil添加至1.5 mL的EP管中，对其反复吹打至混匀，得到CM-Dil标记液。对人羊膜间充质干细胞进行观察，当贴壁数达90%左右时，弃去培养液，PBS冲洗3次，吸干细胞表面液体，加入CM-Dil标记液，继续培养20 min，吸弃标记液，加入5 mL完全培养基孵育10 min吸弃，加入培养基重复清洗2次。细胞继续培养30 d，每天在倒置荧光显微镜下观察CM-Dil标记效果和细胞形态。

1.4.2 大鼠缺血再灌注损伤模型的建立及实验分组 于室温环境中，应用Koizumi线栓法在右侧颈外-颈内动脉插线，1 h后将其拔出，构建脑缺血再灌注损伤模型。将麻醉完全的大鼠仰卧位固定，寻找并暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，将颈外动脉及其周围分支进行结扎并离断，沿颈内动脉走形结扎翼腭动脉；沿颈外动脉断端插入4-0尼龙单线1根，直至颈内动脉颅内分叉处，截断向大脑中动脉方向的血流，1 h后拔出插线，形成再灌注。在整个过程中注意监测大鼠体温变化，使其保持在(37.5±0.5) ℃。麻醉药效消失后，对模型进行评价。

将60只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注损伤组和人羊膜间充质干细胞组，每组20只。人羊膜间充质干细胞组在造模24 h后尾静脉注入细胞浓度为1.0×10⁸ L^-¹的人羊膜间充质干细胞悬液1 mL，假手术组、缺血再灌注损伤组于尾静脉注入生理盐水1 mL。

1.4.3 行为学评分 各组随机取3只大鼠于尾静脉移植后的24 h，3 d和1，2，3周进行行为学评分。①Longa行为学评分：0分：无明显神经损伤症状；1分：不能伸展对侧肢体；2分：行走时向对侧旋转；3分：行走时向对侧倾倒；5分：不能独立行走伴意识障碍；②圆筒实验：测试大鼠在自发直立探究过程中优先使用未受损脑区所支配的前肢来支撑体质量进行移位运动的水平，从而评价其肢体使用的不对称性。将大鼠放在透明的圆筒内，记录大鼠10 min内使用前肢的活动情况，包括身体站起、触嗅时分别使用左、右或两侧前肢放在筒沿的次数。将得到的结果变换为脑缺血再灌注损伤同侧(I)、对侧(C)和两侧(B)前肢的次数，依据公式计算不对称使用分值(SC)，SC=(I+1/2B)/(I+C+B)× 100%；③水平梯行走实验：实验涉及到的仪器有小棒以及透明有机玻璃墙面。实验开始前对大鼠进行为期3 d的训练，以达到在水平梯上行走不害怕，变换梯距后也不害怕。实验重复3次，间隔15 min，观察并计数每次前后肢滑落的次数，取其均值；④肢体放置实验：评估感觉运动的整合能力。该实验共涉及7个项目，每项表现正常为2分，反应不佳为1分，没有反应为0分。总分越低，表明越重。

1.4.4 免疫荧光法观察移植细胞迁移和分布情况 人羊膜间充质干细胞移植后1 d和1，2，3周，各组分别取大鼠3只，麻醉后处死，取脑组织，制备冰冻切片，荧光显微镜下观察细胞在脑组织中的迁移和分布，每张切片计数6个非重叠视野荧光标记细胞数。

1.4.5 Western blot检测各组大鼠脑组织MAG及OMgp蛋白的表达变化 移植后2周随机取3只大鼠，取出脑组织，添加RIPA裂解液充分裂解，提取总蛋白，分离蛋白后电转至NC膜上，封闭1 h，TBS洗膜，添加一抗，4 ℃孵育过夜，TBS洗膜，添加二抗孵育1 h，TBS洗膜，添加显影底物，吸干膜上的水分，放于暗室中进行曝光，对所得条带分析，选取β-actin作为参照。

1.4.6 TUNEL染色观察神经元凋亡情况 移植后3周，各组随机取3只大鼠，取出脑组织进行固定以及常规石蜡切片。将已包埋好的切片按常规方法脱蜡至水，PBS漂洗3次，加入胰蛋白酶K消化，PBS漂洗3次，加入甲醇配制的体积分数为3%过氧化氢室温孵育10 min消除内源性辣根过氧化物酶活性，PBS漂洗3次，加末端脱氧核苷酸转移酶与地高辛标记的dUTP混合反应液进行孵育，用DAB进行显色，核呈深棕黄色为凋亡细胞，最后进行复染、脱水、透明、封固。每只动物选取切片2张，在光镜下(×400)随机选取5个不同的高倍视野进行观察，计数凋亡细胞数和总细胞数，凋亡指数=凋亡细胞数÷总细胞数×100%。

1.5 主要观察指标 ①免疫荧光法观察移植细胞迁移和分布情况；②细胞移植后大鼠神经功能恢复情况；③细胞移植后大鼠脑组织MAG及OMgp蛋白的表达；④细胞移植后大鼠脑组织神经元凋亡情况。

1.6 统计学分析 所有数据以x(_)±s表示，应用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脑缺血再灌注损伤是指脑动脉闭塞导致脑组织缺血、缺氧以及能量供应不足，一定时间后闭塞的血管再通，脑功能障碍加重的病症^[15-21]。脑缺血再灌注损伤的机制尚未研究清楚，细胞凋亡、钙超载、炎症反应等均参与其发病^[22-28]。目前研究认为MAG、OMgp等过表达抑制了早期神经元的再生。众所周知，间充质干细胞能够促进神经再生，但其是否通过抑制MAG、OMgp的表达而起作用，目前尚未见报道。

间充质干细胞是细胞移植的新型种子细胞^[29-32]。已有人从羊膜中培养出间充质干细胞，并发现其与骨髓源性间充质干细胞有极高的相似性^[33-34]。人羊膜间充质干细胞来源广泛、且不受伦理学制约，因此具有广阔的应用前景。实验应用人羊膜间充质干细胞经尾静脉进行移植，探讨其对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复的影响，从而为临床应用提供重要参考。

目前认为，移植的人羊膜间充质干细胞穿过血脑屏障的机制与大脑中动脉阻断后血脑屏障破坏释放出相关的趋化因子有关^[35-36]。研究证实，多种损伤因子能破坏血脑屏障，使其通透性增加，从而使细胞较容易迁移到损伤部位^[37]。

实验对移植后大鼠进行行为学检测发现，与缺血再灌注损伤组相比较，人羊膜间充质干细胞移植组神经功能明显改善。Western blot检测发现，与假手术组比较，缺血再灌注损伤组MAG、OMgp表达量明显升高，人羊膜间充质干细胞移植组MAG、OMgp表达量较缺血再灌注损伤组低。应用TUNEL法检测发现，与假手术组相比，缺血再灌注损伤组凋亡细胞数增多；人羊膜间充质干细胞移植组凋亡细胞数目较缺血再灌注损伤组下降，说明移植人羊膜间充质干细胞能够抑制神经元的凋亡。

总之，人羊膜间充质干细胞移植入脑缺血再灌注损伤大鼠体内可很好地存活，并且能促进神经功能的恢复，但由于有血脑屏障的存在，理论上推断进入脑内的细胞数量有限，在以后的实验中将解决其在体内的不必要损耗，增加其到达脑内缺血再灌注区的数量，则神经功能的改善会更加明显。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程