半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺递送siRNA对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中MRE11表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.020

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (6): 934-939.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.020

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半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺递送siRNA对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中MRE11表达的影响

刘云¹，潘杰^2，3，董伟^1，2，惠景^1，2，李三华¹，范芳^1，2，朱欣婷^1，2

¹遵义医学院贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州省遵义市 563000；²遵义医学院基础医学院，贵州省遵义市 563000；³仁怀市人民医院病理科，贵州省仁怀市 564500

收稿日期:2017-01-13 出版日期:2017-02-28 发布日期:2017-03-16
通讯作者: 朱欣婷，副教授，遵义医学院基础医学院，贵州省遵义市 563000
作者简介:刘云，男，1980年生，贵州省遵义市人，汉族，2015年重庆大学毕业，博士，副教授，主要从事小分子抗癌药物的研究与开发研究。
基金资助:
贵州省科技厅社会发展攻关项目(黔科合SY[2013]3008)；遵义医学院招标项目(F-614)；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目(黔教合KY字[2014]212)

Effect of small interfering RNA delivery using galactosylated chitosan-graft-polyethylenimine on MRE11 gene expression in drug-resistant hepatocellular carcinoma BEL7402/5-Fu cells

Liu Yun¹, Pan Jie^{2, 3}, Dong Wei^{1, 2}, Hui Jing^{1, 2}, Li San-hua¹, Fan Fang^{1, 2}, Zhu Xin-ting^{1, 2}

¹Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; ²Basic Medicine School of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China;³Department of Pathology, People’s Hospital of Renhuai, Renhuai 564500, Guizhou Province, China

Received:2017-01-13 Online:2017-02-28 Published:2017-03-16
Contact: Zhu Xin-ting, Associate professor, Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; Basic Medicine School of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Liu Yun, M.D., Associate professor, Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Social Research and Development Project of Guizhou Science and Technology Department, No. SY[2013]3008; the Tender Project of Zunyi Medical University, No. F-614; the Key Lab Construction Project of the Educational Department of Guizhou Province, No. KY[2014]212

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
RNA干扰：是基因沉默的常用方法，将小干扰 RNA安全高效地递送到肿瘤组织，使其在细胞内发挥基因沉默作用，是RNA干扰技术应用于肿瘤基因治疗的关键技术之一。目前，用于基因递送的载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。病毒载体的优点是转染率高，但其存在安全隐患，在临床应用方面受到诸多限制；非病毒载体具有低毒、低免疫反应、易于组装等优点在基因递送方面应用前景广阔。
壳聚糖：是一种常用的非病毒载体，具有良好生物相容性、生物可降解性、低毒等优点，但其基因递送能力相对较弱，常需要进行结构衍生修饰。

背景：壳聚糖是一种常用的非病毒载体，具有良好生物相容性、生物可降解性、低毒等优点，但其基因递送能力相对较弱，常需要进行结构衍生修饰。
目的：观察半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺(LA-CS-PEI)在肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中递送siRNA的能力及对减数分裂重组蛋白11(MRE11)表达的影响。
方法：①将肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu或人肝细胞HL-7702分别与0，10，20，40，80，100 mg/L的LA-CS-PEI或壳聚糖-聚乙烯亚胺共培养24 h，检测细胞存活率；②将LA-CS-PEI与siRNA-FAM分别以0，2，4，8，16，32的质量比混合，制备复合转染颗粒。以复合转染颗粒转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu，48，72，96 h后，以转染效率筛选最佳质量比与转染时间，进行下步实验；③以复合转染颗粒、LA-CS-PEI、siRNA分别转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu 48 h后，以未转染的细胞为空白对照，检测MRE11基因及蛋白的表达。
结果与结论：①与壳聚糖-聚乙烯亚胺相比，LA-CS-PEI毒性更低，且当LA-CS-PEI质量浓度高达100 mg/L时，仍表现出很低的细胞毒性；②LA-CS-PEI与siRNA-FAM质量比为4和8时转染效率均达95%以上，入胞效率极高，转染48 h转染效果最好，所以后续实验选择质量比为8，转染时间为48 h的复合转染颗粒；③复合转染颗粒组MRE11基因及蛋白表达低于LA-CS-PEI组、siRNA组、空白对照组(P < 0.05)；④结果表明，LA-CS-PEI能实现siRNA的有效递送，并能沉默肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中的MRE11基因。

ORCID: 0000-0001-6138-6822(刘云)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺, 去唾液酸糖蛋白受体, 减数分裂重组蛋白11, RNA干扰, 肝癌细胞BEL7402/5-Fu

Abstract:

BACKGROUND: Chitosan is a kind of common non-viral vector characterized by good biocompatibility, biodegradability and low toxicity. However, it usually needs structural modification via derivatization due to its weak gene delivery ability.
OBJECTIVE: To observe the ability of galactosylated chitosan-graft-polyethylenimine (GAL-CHI-g-PEI) delivering small interfering RNA (siRNA) on drug-resistant hepatocellular carcinoma BEL7402/5-Fu and its effect on the expression of meiotic recombination 11 (MRE11).
METHODS: BEL7402/5-Fu cells or human hepatocytes HL-7702 were co-cultured with 0, 10, 20, 40, 80 and 100 μg/mL GAL-CHI-g-PEI or chitosan-PEI for 24 hours, and then the cell viability was detected. The composite transfection particles were prepared by mixing GAL-CHI-g-PEI with siRNA-FAM at the mass ratio of 0, 2, 4, 8, 16 and 32, respectively. The next experiments were performed based on BEL7402/5-Fu cells transfected with the compound transfection particles, and the optimal mass ratio and transfection time were selected according to the efficiency of transfection at 18, 72 and 96 hours afte transfection. At 48 hours after BEL7402/5-Fu cells transfected with compound transfection particles, GAL-CHI-g-PEI and siRNA, respertively, the expressions of MRE11 mRNA and protein were detected in comparison with untransfected cells as controls.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with chitosan-PEI, GAL-CHI-g-PEI demonstrated lower toxicity, and still showed low cytotoxicity when the mass concentration reached 100 μg/mL. The transfection efficiency was over 95% and the cell entry efficiency was extremely high when the mass ratio of GAL-CHI-g-PEI to siRNA-FAM was 4 and 8, respectively, with the optimal transfection effect at 48 hours after transfection. Therefore, the mass ratio in the subsequent experiments was set to 8. The expressions of MRE11 mRNA and protein in the composite transfection group were lower than those in the GAL-CHI-g-PEI, siRNA and control groups (P < 0.05). These results suggest that the effective delivery of siRNA and the silencing of the MRE11 gene in BEL7402/5-Fu cells can be achieved by GAL-CHI-g-PEI.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Transfection, Gene Silencing, Polyethyleneimine, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘云，潘杰，董伟，惠景，李三华，范芳，朱欣婷. 半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺递送siRNA对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中MRE11表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(6): 934-939.

Liu Yun, Pan Jie, Dong Wei, Hui Jing, Li San-hua, Fan Fang, Zhu Xin-ting. Effect of small interfering RNA delivery using galactosylated chitosan-graft-polyethylenimine on MRE11 gene expression in drug-resistant hepatocellular carcinoma BEL7402/5-Fu cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(6): 934-939.

图/表（结果） 7

2.1 核磁共振氢谱表征LA-CS-PEI的结果观察壳聚糖(图1a)、壳聚糖-聚乙烯亚胺(图1b)和LA-CS-PEI(图1c)的核磁共振氢谱(D₂O)图，依据各物质官能团特征峰归属及峰裂分现象，化学位移δ2.0-1.8 ppm处有壳聚糖中-COCH₃，-CH₃的特征峰^[20]，以此峰作为3图中各自的标准峰作积分高度对照；δ3.32-.5 ppm处有聚乙烯亚胺中-NHCH₂CH₂-的特征峰^[21]；δ4.09 ppm处是专属于乳糖环-H的特征峰^[10]；对各图化学位移δ特征峰处进行积分比较，3图中，只有c图δ4.09 ppm处有峰且积分面积为0.80，说明聚乙烯亚胺上已成功接枝上半乳糖基；且对比a、b图，b图由高峰变为低峰，峰有裂分现象，由原来的单峰变为多峰亦可说明C-C键间-H的增加；a、b图中δ3.0 ppm处均有峰且积分面积为2.81、1.17，b图中化学位移δ3.0 ppm处的峰积分面积2.42几乎是a图中δ3.0 ppm处峰积分面积的一半，受到杂质峰或溶剂峰的影响目标峰有所偏移属于正常现象，但不影响聚乙烯亚胺已成功接枝上壳聚糖的判断，同样，c图峰裂分现象最为明显，三图相比峰最低且成多峰状态，说明-H均有增加，亦可说明半乳糖、聚乙烯亚胺等功能基团已成功接枝上壳聚糖大分子上。

2.2 细胞生物相容性检测结果以不同质量浓度壳聚糖-聚乙烯亚胺和LA-CS-PEI分别处理BEL7402/5-Fu细胞(或人肝细胞HL-7702)后，MTT检测各组细胞存活率结果(图2)：与壳聚糖-聚乙烯亚胺相比，LA-CS-PEI的毒性更低；且当LA-CS-PEI的质量浓度高达100 mg/L时，仍表现出很低的细胞毒性，说明其细胞相容性较好。

2.3 不同质量比复合颗粒对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu转染率的影响 LA-CS-PEI/siRNA-FAM转染BEL7402/5- Fu细胞48 h后，利用荧光显微镜观察到胞内呈现绿色荧光，说明LA-CS-PEI与siRNA-FAM形成的复合颗粒能够很容易进入胞内(图3)。另外，实验还考察了不同质量比复合颗粒的转染效率，见图4所示，m₀/m_t为4和8时，其转染效率均达95%以上，入胞效率极高。

2.4 转染时间对转染效率的影响分别用m₀/m_t=8和4的LA-CS-PEI/siRNA复合颗粒考察不同转染时间对转染效率的影响，见图5显示，与48，72 h比较，m₀/m_t=8的LA-CS-PEI/siRNA转染96 h后仍保持较高的水平；而m₀/m_t=4的LA-CS-PEI/siRNA转染72，96 h后，转染效率较48 h明显下降。后续实验选择m₀/m_t=8LA-CS-PEI/ siRNA复合颗粒，转染时间选择48 h。

2.5 Real-time PCR检测检测 MRE11沉默效率复合颗粒(m₀/m_t=8)转染48 h后，通过MRE11 Ct值分析得出(表1)：空白对照组、LA-CS-PEI组、siRNA组MRE11 mRNA表达无明显差异(P > 0.05)，复合颗粒组中MRE11 mRNA表达低于空白对照组(P < 0.05)，且MRE11 mRNA水平沉默效率为51.7%。

2.6 Western blot检测MRE11蛋白水平沉默效率以复合颗粒转染48 h后，提取各组细胞总蛋白，Western blot检测转染后各组细胞MRE11蛋白表达变化，结果显示(图6)：复合颗粒组MRE11蛋白表达低于空白对照组(0.551±0.224，1.272±0.533，P < 0.05)，空白对照组、LA-CS-PEI组(1.412±0.608)、siRNA(1.151±0.319)组MRE11蛋白表达无明显差异(P > 0.05)。

参考文献

[1]Nagy Z,Kalousi A,Furst A,et al.Tankyrases Promote Homologous Recombination and Check Point Activation in Response to DSBs.PLoS Genet.2016;12(2):e1005791.

[2]Becker A,Durante M,Taucher-Scholz G,et al.ATM alters the otherwise robust chromatin mobility at sites of DNA double-strand breaks (DSBs) in human cells.PloS One.2014;9(3): e92640.

[3]Ju X,Liang S,Zhu J,et al.Extracellular matrix metalloproteinase inducer (CD147/BSG/EMMPRIN)-induced radioresistance in cervical cancer by regulating the percentage of the cells in the G2/m phase of the cell cycle and the repair of DNA Double- strand Breaks (DSBs).Am J Transl Res.2016;8(6):2498.

[4]Staples CJ,Barone G,Myers KN,et al.MRNIP/C5orf45 Interacts with the MRN Complex and Contributes to the DNA Damage Response.Cell Rep.2016;16(10):2565-2575.

[5]Lavin MF,Kozlov S,Gatei M,et al.ATM-Dependent Phosphorylation of All Three Members of the MRN Complex: From Sensor to Adaptor.Biomolecules. 2015;5(4):2877-2902.

[6]Stracker TH,Petrini JHJ.The MRE11 complex: starting from the ends.Nat Rev Mol Cell Biol.2011;12(2):90-103.

[7]Yuan SS,Hou MF,Hsieh YC,et al.Role of Mre11 in cell Proliferation, tumor invasion, and DNA repair in Breast cancer.J Natl Cancer Inst.2012;104(19):1485-1502.

[8]Deshpande RA,Lee JH,Arora S,et al.Nbs1 converts the human Mre11/Rad50 nuclease complex into an endo/exonuclease machine specific for protein-DNA adducts.Mol Cell.2016;64(3):593-606.

[9]Inagaki A,Roset R,Petrini JHJ.Functions of the MRE11 complex in the development and maintenance of oocytes. Chromosoma.2016;125(1):151-162.

[10]范芳,耿磊,李长福.shMRE11质粒转染对BEL7402 /5-FU肝癌细胞耐药性的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2013,29(10):1040-1046.

[11]Deng Y,Wang CC,Choy KW,et al.Therapeutic potentials of gene silencing by RNA interference: principles, challenges, and new strategies.Gene.2014;538(2):217-227.

[12]Fellmann C,Lowe SW.Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 2014;16(1):10-18.

[13]Pandey AP,Sawant KK.Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.Mater Sci Eng C.2016;68:904-918.

[14]Yin H,Kanasty RL,Eltoukhy AA,et al.Non-viral vectors for gene-based therapy. NatRev Genet.2014;15(8):541-555.

[15]Huang PI,Lo WL,Cherng JY,et al.Nonviral delivery of RNA interference targeting cancer cells in cancer gene therapy. Curr Gene Ther.2012;12(4):275-284.

[16]Oliveira C,Silveira I,Veiga F,et al.Recent advances in characterization of nonviral vectors for delivery of nucleic acids: impact on their biological performance.Expert Opin Drug Deliv.2015;12(1):27-39.

[17]Rekha MR,Sharma CP.Polymers for gene delivery: current status and future perspectives.Recent Pat DNA Gene Seq. 2012;6(2):98-107.

[18]Xu M,Myerson RJ,Hunt C,et al.Transfection of human tumour cells with Mre11 siRNA and the increase in radiation sensitivity and the reduction in heat-induced radiosensitization. Int J Hyperthermia.2004;20(2):157-162.

[19]Jiang HL, Kwon JT, Kim EM,et al. Galactosylated-poly (ethyleneglycol)-chitosan-graft- polyethylenimine as a gene carrier for hepatocyte-targeting.J Controll Release.2008; 131(2):150-157.

[20]Rekha MR,Sharma CP.Polymers for gene delivery: current status and future perspectives.Recent Pat DNA Gene Seq. 2012;6(2):98-107.

[21]Wong K,Sun G,Zhang X,et al.PEI-g-chitosan, a novel gene delivery system with transfection efficiency comparable to polyethylenimine in vitro and after liver administration in vivo.Bioconjug Chem.2006;17(1):152-158.

[22]Vadlapatla RK,Vadlapudi AD,Pal D,et al.Mechanisms of drug resistance in cancer chemotherapy:coordinated role and regulation of efflux transporters and metabolizing enzymes. Curr Pharm Des.2013;19(40):7126-7140.

[23]Huang JJ,iHong M.The Involvement and Modulation of ABC Transporters in Multidrug Resistance[M]. Handbook of Anticancer Pharmacokinetics and Pharmacodynamics.Progress in Modern Biomedicine,2009:4571-4573.

[24]Giovannetti E,Erozenci A,Smit J,et al.Molecular mechanisms underlying the role of microRNAs (miRNAs) in anticancer drug resistance and implications for clinical practice.Crit Rev Oncol Hematol.2012;81(2):103-122.

[25]Liao S, Guay C, Toczylowski T, et al. Analysis of MRE11's function in the 5'-->3' processing of DNA double-strand breaks. Nucleic Acids Res.2012;40(10):4496-4506.

[26]Chen GY,Tan DY.The Research Status and Application Prospect of RNA Interference. J Dali Univ.2012;11(10):52-55.

[27]Cai B,Miao Y,Liu Y,et al.Nuclear multidrug-resistance related protein 1 contributes to multidrug-resistance of mucoepidermoid carcinoma mainly via regulating multidrug-resistance protein 1:a human mucoepidermoid carcinoma cells model and Spearman's rank correlation analysis.PLoS One.2013;8(8):e69611.

[28]Fan F,Geng L,Li D,et al.ShRNA-mediated MRE11 gene silencing inhibits DNA repair in multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line BEL7402/5-FU.World ChinJ Digestol.2013;21(29):3053-3058.

[29]Liang M,Shen Z,Zhen MA,et al.Progress on ASGPR-Mediated Hepatic targeting.Chin JMAP.2010;27(2):109-114.

引言

DNA双链断裂是抗癌药物导致肿瘤细胞死亡的主要机制之一^[1-3]。在检测和修复DNA双链断裂时，MRN复合物(MRE11/ RAD50/NBS1)扮演着重要角色^[4-5]，其组分减数分裂重组蛋白11(Meiotic recombination 11，MRE11)的表达量与肿瘤的恶性程度相关^[6-9]。课题组前期研究表明，通过抑制MRE11 mRNA的表达水平，能在一定程度上提升肝肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性，提升抗癌效果^[10]。

RNA干扰是基因沉默的常用方法^[11-12]，将小干扰 RNA(Small interfering RNA，siRNA)安全高效地递送到肿瘤组织，使其在细胞内发挥基因沉默作用，是RNA干扰技术应用于肿瘤基因治疗的关键技术之一。目前，用于基因递送的载体主要有病毒载体和非病毒载体2种^[13-14]。病毒载体的优点是转染率高，但其存在安全隐患，在临床应用方面受到诸多限制；非病毒载体具有低毒、低免疫反应、易于组装等优点，在基因递送方面应用前景广阔^[15-16]。壳聚糖是一种常用的非病毒载体，具有良好生物相容性、生物可降解性、低毒等优点，但其基因递送能力相对较弱，常需要进行结构衍生修饰^[17]。在此次实验中，课题组首先利用聚乙烯亚胺与壳聚糖相偶联生成聚乙烯亚胺壳聚糖；在此基础上，再将半乳糖分子与聚乙烯亚胺壳聚糖结合，形成半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺(Galactosylated chitosan-graft-polyethylenimine，LA-CS-PEI)，研究LA- CS-PEI/siRNA复合颗粒对肝癌耐药细胞BEL7402/ 5-Fu中MRE11 mRNA表达的影响，以期为开展基于壳聚糖衍生物的siRNA与化疗药物联用克服肝癌细胞多药耐药性打下基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年3月至2015年5月在遵义医学院基础医学院和贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室完成。

1.3 材料肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu细胞株购买于南京凯基生物有限公司；人肝细胞HL-7702细胞株购于中科院上海细胞库；胎牛血清购于美国GIBCO公司；DMEM培养基购于美国Hyclone公司；MRE11 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列为5'-A AG AA CC UG GU CC CA GA GG AG-3'，参考文献[18]合成，并标记FAM荧光基团；壳聚糖购于浙江金壳药业有限公司；聚乙烯亚胺(M_W= 1 800，99%)购于上海晶纯实业有限公司；5-氟尿嘧啶购自天津金耀制药厂；核磁共振仪(美国瓦里安公司)；MRE11兔抗人的一抗(ABGENT公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 LA-CS-PEI的合成与表征根据文献方法^[19]，略有修改。取0.5 g壳聚糖，溶于20 mL 0.5%醋酸，待其完全溶解后加入0.223 g CDI，反应1 h后，加入0.029 5 g聚乙烯亚胺，室温反应过夜，再透析48 h后，取出透析液冷冻干燥，即得壳聚糖-聚乙烯亚胺。在此基础上，取0.08 g壳聚糖-聚乙烯亚胺干燥样品，溶于40 mL 0.1 mol/L MES buffer中，待其完全溶解后调节pH值至5.7，再同时加入0.032 g乳糖酸、0.102 g NHS、0.17 g EDC，搅拌反应 30 min，完全溶解后置于4 ℃放置12 h，然后转移至室温放置12 h，最后用透析袋透析3 d，取出透析液冷冻干燥，即得LA-CS-PEI。以5%氘代三氟乙酸为溶剂，利用 400 MHz核磁共振仪进行氢谱检测。

1.4.2 细胞培养将肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu用含体积分数10%胎牛血清、10 mg/L5-氟尿嘧啶的DMEM培养基，于37 ℃ CO₂养箱中培养，待细胞处于对数生长期后用于后续实验。

1.4.3 细胞相容性评价分别称取10 mg LA-CS-PEI和壳聚糖-聚乙烯亚胺，加入10 mL醋酸(10 mmol/L)溶液，磁力搅拌2 h，配置成1 g/L的母液。

取肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu及人肝细胞HL-7702，分别以每孔8×10⁶ L^-1的细胞浓度接种于96孔板，每孔100 μL，培养约24 h后，弃上清，PBS洗2次。利用培养液稀释LA-CS-PEI、壳聚糖-聚乙烯亚胺母液，每一种材料设5个浓度梯度，每个浓度设3个复孔，周围边缘孔加PBS；在相应孔内分别加入0，10，20，40，80，100 mg/L的LA-CS-PEI、壳聚糖-聚乙烯亚胺各100 μL；培养24 h后，弃清液，PBS洗2次，每孔加180 μL培养基，20 μL MTT，培养4 h；去上清，加150 μL二甲基亚砜，轻轻震荡10 min，测定各孔的A₄₉₀值。细胞存活率=A₄₉₀(处理细胞)/A₄₉₀(阴性对照)×100%。其中A₄₉₀(处理细胞)表示用LA-CS-PEI和壳聚糖-聚乙烯亚胺处理，A₄₉₀(阴性对照)表示用PBS处理。最后，根据细胞的存活率评估递送材料的细胞相容性。

1.4.4 LA-CS-PEI/siRNA-FAM复合颗粒转染细胞

LA-CS-PEI/siRNA-FAM复合颗粒的制备：用50 mmol/L的硫酸钠将siRNA-FAM分别稀释成3.125，6.25，12.5，25，50 mg/L的质量浓度，待用。以10 mmol/L的醋酸为溶剂，配置质量浓度为100 mg/L的 LA-CS-PEI溶液，55 ℃水浴加热15 min；然后与50 μL不同质量浓度的siRNA-FAM等体积混合，涡旋10 s后，在室温下静置30 min，制得质量比(m0/mt)分别为32、16、8、4、2的siRNA复合颗粒(LA-CS-PEI/siRNA- FAM)，m₀为LA-CS-PEI溶液，m_t为siRNA-FAM。

BEL7402/5-Fu细胞转染：将BEL7402/5-Fu细胞以4×10⁵/孔的密度接种于24孔培养板，每组细胞种3个复孔，当细胞融合度达到70%左右时，吸去各孔培养液，用PBS轻轻润洗3次，将质量比分别为32，16，8，4，2的LA-CS-PEI/ siRNA-FAM复合颗粒加至相应培养孔中，每孔100 μL，再用无血清培养基补足到500 μL，8 h后换液。转染48，72，96 h后，在荧光显微镜下观察、拍照、计数，每孔取5个视野，计算出每个视野下的总细胞数和相同视野下荧光细胞数，筛选最佳质量比与转染时间，用于下步实验。转染效率=每个视野下的荧光细胞数/相同视野下的细胞总数×100%。

1.4.5 复合颗粒转染对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中MRE11表达的影响取肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu，分4组培养，其中3组分别以LA-CS-PEI/siRNA-FAM复合颗粒、LA-CS-PEI、siRNA转染，以正常培养的细胞为空白对照组。

Real-time PCR检测MRE11 mRNA水平的沉默效率：培养48 h后，按宝生物公司RNAiso Plus试剂盒说明书方法提取细胞总RNA，Real-time PCR定量试剂盒(SYBR Green)检测MRE11 mRNA的表达水平。MRE11的引物为：上游5′-G TG GA CA AG GA GG AG AA AG AT G-3′；下游3′-T AC TT CA GG CA CT CC GA TA CT G-5′，扩增片段长度为188 bp。β-actin 的引物为：上游5′-T GA CG TG GA CA TC CG CA AA G-3′，下游3′-G GA GC GA CA GG TG GA AG GT C-5′，扩增片段长度为205 bp。各组样品经荧光 PCR仪检测，观察各组样品的扩增曲线、溶解曲线，并根据公式2^-^??Ct计算MRE11 mRNA相对表达量。

Western blot检测MRE11蛋白表达：培养48 h后，进行细胞总蛋白的提取。弃培养基，PBS洗3遍；加RIPA蛋白裂解液，放置30 min；吹打使细胞裂解，移入EP管， 12 000 r/min离心20 min，取上清液，BCA法测定样品中蛋白含量。Western blot法检测MRE11蛋白表达；MRE11兔抗人的一抗的稀释比例为1∶1 000，山羊抗兔IgG的二抗稀释比例为1∶1 000；采用ECL发光显影，用bio-rad Quantity One图像分析仪分析MRE11蛋白表达情况。

1.5 主要观察指标各组MRE11基因及蛋白的表达。

1.6 统计学分析以上实验均重复3次，实验结果均用x(_)±s表示。采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，资料经正态性及方差齐性检验后，行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验法。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

肿瘤化学疗法是当今治疗肿瘤的重要方法之一，但是由于多药耐药的存在^[22]，总是不能取得良好的化疗效果。一般认为产生多药耐药的原因主要与GSTs、P-gp、MRP的高表达，胞内拓扑异构酶活性下降等相关，而且耐药机制十分复杂，涉及到药物外排增加、药物作用靶点的改变、药物在细胞内的代谢改变、细胞修复途径的增加等^[23-24]。在临床治疗中，化疗药物主要是破坏DNA而达到疗效的^[1]。DNA双链断裂损伤是DNA损伤中最严重的损伤。参与DNA双链断裂的修复的主要有两种途径，一种是同源重组修复，另一种是非同源末端连接。在同源重组修复途径中，当发生DNA双链断裂后，相关的蛋白复合物会向染色体损伤处聚集；MRE11是这些蛋白复合物中重要的成分之一，在参与DNA损伤修复中发挥重要作用^[25]。MRE11不仅是DNA损伤的感受器，更是修复DNA的启动因子，还能修饰受损的DNA分子。目前，MRE11已成为研究肿瘤耐药与DNA损伤修复的一个热点。

目前，RNA干扰技术因其能特异地沉默肿瘤靶基因，抑制肿瘤生长，现在更多用于一些抗肿瘤耐药的研究^[26-27]。课题组在前期利用脂质体转染shMRE11质粒沉默MRE11基因，研究其功能的基础上^[28]，又进一步构建了LA-CS-PEI递送材料，并成功实现了MRE11 siRNA的递送和MRE11基因沉默及蛋白表达量的降低。在所构建的递送材料LA-CS-PEI中，半乳糖基团是肝(癌)细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体，存在特异性相互作用^[29]。并且，去唾液酸糖蛋白受体是一种异源低聚物的内吞受体，对进入血液中的异源复合物具有选择性吞噬作用，研究者可以利用这个特性将一些外源的功能性物质经过半乳糖修饰以后，定向转入到肝脏细胞中发挥作用。因此，去唾液酸糖蛋白受体在基因定向转移、靶向药物、临床检测等方面具有很高的应用价值。另外，LA-CS-PEI中的聚乙烯亚胺具有高阳离子电势的特点，每3个原子就能形成了一个质子化的氨基氮；因此其具有良好的“质子海绵”效应，入胞后不断的吸收胞浆中的质子，造成内涵体的膨胀，促使转染颗粒逃逸内涵体，使转染材料所携带的siRNA更容易在胞浆内实现基因的沉默。课题组希望以此工作能为后续开展化疗药物与siRNA联用，克服肝癌细胞多药耐药做一些前期准备工作。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺递送siRNA对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中MRE11表达的影响

Effect of small interfering RNA delivery using galactosylated chitosan-graft-polyethylenimine on MRE11 gene expression in drug-resistant hepatocellular carcinoma BEL7402/5-Fu cells

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[1]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[2]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[3]	文科, 卢彦青, 侯楠, 马瑞娜, 崔鹏程, 吕蝶, 徐小丽. 生物材料与组织工程技术在鼓膜缺损重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1620-1624.
[4]	梅运运, 张建军, 王东. 高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 12-19.
[5]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[6]	袁丽粉, 曹爽, 孙婷. 靶向血管紧张素原RNA干扰对自发性高血压模型大鼠的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5626-5631.
[7]	李辰凯, 秦文, 刘纯, 陈文扬, 赵红斌. 3D电喷印法制备凹凸棒石/聚己内酯支架及体外成骨诱导性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5459-5464.
[8]	张峰. 聚醚醚酮和钛网材料修补颅骨缺损远期效果及不良事件的差异：前瞻性、单中心、非随机对照、2年随访临床试验方案[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5501-5505.
[9]	彭一帆, 王翀, 山院飞, 芦文丽. 可吸收胶原蛋白线用于Ⅰ，Ⅱ类手术切口缝合效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4587-4592.
[10]	廖思达, 孟昊业, 李俊康, 徐亦驰, 李获, 田萧羽, 冯勇, 汪爱媛, 彭江. 电喷雾法制备海藻酸盐-明胶-脂肪干细胞微球及其修复关节软骨损伤的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4473-4479.
[11]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[12]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[13]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[14]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[15]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.